Uso de ensamblaje in vivo para la construcción de plásmidos de alta eficiencia

Resumen

El ensamblaje in vivo es un método de clonación independiente de la ligadura que se basa en enzimas intrínsecas de reparación del ADN en bacterias para ensamblar fragmentos de ADN por recombinación homóloga. Este protocolo es rentable y rentable, ya que se requieren pocos reactivos y la eficiencia de la clonación puede ser de hasta el 99 %.

Resumen

El ensamblaje in vivo (IVA) es un método de clonación molecular que utiliza enzimas intrínsecas presentes en bacterias que promueven la recombinación intermolecular de fragmentos de ADN para ensamblar plásmidos. Este método funciona transformando fragmentos de ADN con regiones de 15-50 pb de homología en cepas de Escherichia coli de laboratorio de uso común, y las bacterias utilizan la vía de reparación independiente de RecA para ensamblar los fragmentos de ADN en un plásmido. Este método es más rápido y rentable que muchos métodos de clonación molecular que se basan en el ensamblaje in vitro de plásmidos antes de su transformación en cepas de E. coli. Esto se debe a que los métodos in vitro requieren la compra de enzimas especializadas y la realización de reacciones enzimáticas secuenciales que requieren incubaciones. Sin embargo, a diferencia de los métodos in vitro, no se ha demostrado experimentalmente que IVA ensamble plásmidos lineales. Aquí compartimos el protocolo IVA utilizado por nuestro laboratorio para ensamblar rápidamente plásmidos y subclonar fragmentos de ADN entre plásmidos con diferentes orígenes de replicación y marcadores de resistencia a antibióticos.

Introducción

La clonación molecular engloba una serie de técnicas de laboratorio necesarias para producir plásmidos que contienen ADN recombinante específico¹. Estas técnicas ubicuas a menudo actúan como un cuello de botella en el flujo de trabajo experimental². Muchas técnicas de clonación molecular se basan en el ensamblaje de fragmentos de ADN in vitro mediante una serie de reacciones enzimáticas antes de la transformación en una cepa huésped (por ejemplo, Escherichia coli DH5a) para la amplificación 3,4,5,6,7. Dado que los métodos de ensamblaje de plásmidos in vitro se basan en enzimas, la compra o purificación de enzimas puede ser costosa y llevar mucho tiempo.

El ensamblaje in vivo (IVA) es un método de clonación molecular que se basa en la recombinación intermolecular de fragmentos de ADN en un huésped adecuado ^8,9,10,11,12. La base de este método fue la observación de que las cepas de clonación recA-clonación comúnmente utilizadas podrían mediar la recombinación intermolecular de un cebador monocatenario con un plásmido escindido por enzimas de restricción¹³. En la década de 1990 se describió el uso de la PCR para generar extremos de ADN homólogos para el ensamblaje de plásmidos en E. coli y este método se denominó PCR de recombinación ^3,14. Se reportó que la eficiencia de la PCR por recombinación fue de aproximadamente el 50%¹⁴. Sin embargo, este método no fue ampliamente adoptado, probablemente debido al alto costo de los cebadores y al riesgo de introducir mutaciones no deseadas utilizando polimerasas de baja fidelidad para amplificar grandes fragmentos de ADN. Estos inconvenientes eran importantes en el decenio de 1990 y podían evitarse utilizando métodos de clonación in vitro, como la clonación mediada por enzimas de restricción.

En los últimos años, el costo de los cebadores ha disminuido y las nuevas polimerasas comerciales han aumentado la fidelidad de la amplificación por PCR. Como resultado, la PCR de recombinación se revisó como una técnica de clonación molecular rápida y rentable y se rebautizó como IVA 2,9,15,16. Con el aumento de la viabilidad, se exploró más a fondo el IVA y se optimizó el método para alcanzar eficiencias de clonación de hasta el 99%¹⁶. Las optimizaciones identificaron características del ADN homólogo, como el número de pares de bases y la temperatura de fusión, que maximizan la eficiencia de la recombinación in vivo ^2,16. Un análisis más detallado mostró que hasta 6 fragmentos de ADN que oscilaban entre 150 pb y 7 kbp podían ensamblarse de manera eficiente mediante IVA¹⁵. Además, nuestro grupo utilizó recientemente IVA para ensamblar una serie de plásmidos con diferentes casetes de resistencia a antibióticos y orígenes de replicación¹⁷. En este estudio, la clonación de IVA fue altamente eficiente (71-100%) con un pequeño número de clones probados para cada plásmido (n = 2)¹⁷. A continuación describimos el protocolo de IVA utilizado por nuestro laboratorio.

Protocolo

1. Diseñar cebadores o fragmentos de ADN con extremos homólogos

1. Utilice un software de procesamiento de textos o un software especializado en análisis de ADN para ensamblar artificialmente el plásmido deseado.
   NOTA: A menudo es útil codificar por colores los fragmentos de ADN de diferentes fuentes y resaltar las regiones homólogas que se utilizarán en los pasos de ensamblaje posteriores. Además, también es útil codificar por colores el ADN homólogo para garantizar el ensamblaje direccional.
2. Diseñar cebadores que se unan a cada fragmento de ADN y contengan entre 15 y 50 pb de la secuencia de ADN homóloga (Figura 1)^2,15.
   1. Para aumentar la eficiencia del IVA, asegúrese de que los fragmentos de ADN homólogos tengan temperaturas de fusión de 47-52 °C².
      NOTA: La temperatura de fusión se puede determinar utilizando el software^{en línea 18} o la fórmula: Temperatura de fusión = 64,9 + 41 * (nG + nC - 16,4)/(nA + nT + nG + nC), donde n = número de G, C, A o T en la secuencia ^6,19.
   2. Evite los cebadores con secuencias muy repetitivas como CATCATCATCATCATCAT que codifican para una etiqueta HIS, ya que pueden introducir inestabilidad²⁰. Si se necesita una secuencia final repetitiva de aminoácidos para aplicaciones como la inserción de una etiqueta poly-HIS, utilice codones alternativos como CATCACCATCATCACCAC para disminuir la repetición de la secuencia de ácido nucleico.
      NOTA: Los cebadores se pueden pedir a cualquier proveedor preferido. Si se van a sintetizar fragmentos de ADN, se deben incorporar extremos homólogos en el fragmento de ADN sintetizado.

2. Amplificación de productos de ADN que contienen extremos homólogos

1. Aísle el ADN plasmídico o las plantillas de ADN genómico utilizando kits de aislamiento de ADN estándar disponibles en el mercado o lisis alcalina ^6,17.
2. Utilice ADN molde (a partir del paso 2.1) y cebadores que contengan regiones homólogas (paso 1.2) en una reacción de PCR con una polimerasa de alta fidelidad disponible en el mercado. Para limitar el arrastre de la plantilla de ADN en las reacciones posteriores, utilice una cantidad baja de ADN plantilla (20 pg-1 ng) en cada reacción. Consulte las recomendaciones del fabricante para conocer los componentes de la mezcla de reacción de PCR específicos de la enzima y las condiciones de ciclo de PCR recomendadas. Proceda con la reacción de PCR.
   1. Configure las reacciones de PCR (50 μL) para amplificar los fragmentos de ADN que se muestran en la Figura 2 para que contengan 100 μM de dNTP, 0,2 μM de cada cebador de ADN, ADN molde (50 pg de pSU19 y 1 ng de pSU18mCherry), 1x mezcla de tampón de reacción de PCR que contenga Mg²⁺ (concentración final de 2 mM) y 1 U de ADN polimerasa de alta fidelidad.
   2. Utilice un programa de ciclo de PCR de contacto para amplificar pSU19 y mCherry (Figura 2). Ajuste el paso inicial de desnaturalización a 95 °C durante 5 minutos, seguido de 10 ciclos de 95 °C durante 15 s, 55 °C-0,5 °C por ciclo durante 15 s y 72 °C durante 1 min y luego 20 ciclos adicionales de 95 °C durante 15 s, 50 °C durante 15 s y 72 °C durante 1 min. Complete el ciclo de PCR con un paso final de extensión a 72 °C durante 10 min.
      NOTA: Si se va a amplificar una columna vertebral de plásmido, ajuste la cantidad de molde de ADN en función del peso molecular: con ~20 pg/1 kbp de ADN plasmídico por 50 μL de reacción de PCR (50 pg de ADN para pSU19 (mostrado)). Además, ajuste los ciclos de PCR para minimizar el número de mutaciones introducidas durante la amplificación: para la amplificación de las redes troncales de plásmidos, tan solo 20-25 ciclos de PCR son suficientes.
3. Una vez completada la reacción de PCR, se extraiga una alícuota (2 μL) de la reacción de PCR, se combine con el colorante de carga (a una concentración de 1x) y se separen los fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa²¹. Utilice un transiluminador ultravioleta (UV) o LED para visualizar los fragmentos de ADN que han migrado en el gel de agarosa. Determine si los productos de PCR son únicos y compare los productos con la escalera de ADN para verificar si tienen el peso molecular esperado (Figura 2). Si no se visualizan productos de PCR con el peso molecular correcto, consulte las recomendaciones del fabricante para optimizar la reacción de PCR.
   NOTA: Cuando los productos de PCR no son únicos, pero hay un fragmento de ADN abundante correspondiente al peso molecular esperado, se puede evitar una reacción de PCR adicional.
4. Si hay varios fragmentos de ADN presentes en el gel de agarosa, extraiga el fragmento de ADN correspondiente al peso molecular esperado del gel de agarosa y utilice un kit de extracción de gel de agarosa para recuperar el fragmento de ADN.
5. Para eliminar el ADN molde metilado de las reacciones de PCR, agregue 1 μL de DpnI directamente al tubo de reacción. Incubar las reacciones a 37 °C durante 15 minutos o toda la noche.
   NOTA: Se recomienda encarecidamente este paso opcional para limitar la cantidad de ADN molde que se arrastra en las reacciones posteriores. Sin embargo, este paso se puede omitir si se utilizan concentraciones muy bajas de ADN molde en la reacción de PCR.
6. Utilice un kit de purificación de ácidos nucleicos para eliminar las enzimas residuales, las sales, los dímeros de cebador y otros productos no deseados de ADN de bajo peso molecular resultantes de los ensayos enzimáticos.
   NOTA: Los pasos 2.1-2.6 se pueden omitir si se sintetizan fragmentos de ADN.
7. Cuantificar la concentración de ADN de los fragmentos de ADN purificados mediante espectrofotometría o estimación en gel.

3. IVA (Figura 3)

1. Calcule la cantidad de ADN requerida para cada reacción de IVA (se recomiendan 25-50 ng de ADN plasmídico). Utilice cantidades más altas de ADN plasmídico para plásmidos con mayor peso molecular (por ejemplo, para plásmidos de 2,3 kbp, utilice 25 ng de plásmido, pero cuando los plásmidos sean de 9 kbp, utilice 50 ng en cada reacción). Calcular el volumen de ADN de inserción necesario para la reacción; utilice una proporción molar de 1:3 o 1:5 de plásmido:inserto de ADN.
   NOTA: Las calculadoras de biografía en línea o las fórmulas que se proporcionan a continuación se pueden usar para calcular la cantidad molar de un fragmento de ADN de doble cadena y determinar la proporción molar de cada fragmento de ADN.
   Utilizamos la siguiente fórmula para calcular la cantidad molar de un fragmento de ADN bicatenario: pmol = (peso en ng) × 1.000 / (pares de bases × 650 daltons). Además, las relaciones molares se pueden calcular mediante: masa del inserto (g) = relación deseada entre el inserto y el molar plasmídico × la masa del plásmido (g) × relación entre el inserto y las longitudes del plásmido⁶.
2. Combine el volumen calculado de plásmido e inserte el ADN en un tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 ml y manténgalo en hielo.
3. Transfiera el plásmido e inserte la mezcla de ADN del paso 3.2 a una alícuota (25-100 μL) de E. coli recA^- químicamente competente descongelada (por ejemplo, E. coli DH5a;²²).
   NOTA: El volumen de células competentes utilizadas depende del volumen de la mezcla de plásmido y ADN del inserto; Esta mezcla no debe exceder el 10% del volumen de las células competentes.
4. Proceda con una transformación de choque térmico²³.
   1. Incubar la mezcla de E. coli químicamente competente y ADN en hielo durante 30 min.
   2. Transfiera a un baño de agua a 42 °C durante 1 min, luego transfiera el tubo a hielo durante 2 min.
   3. Transfiera asépticamente LB al tubo para compensar el volumen a 1 mL.
   4. Transfiera el volumen de 1 mL a un tubo de cultivo de vidrio y colóquelo en una incubadora agitadora configurada a 37 °C, 220 rpm o la temperatura recomendada para que la cepa bacteriana y/o el plásmido se recupere (rango típico de 25 °C a 37 °C) y permita la producción del marcador de selección de antibióticos codificado por plásmido.
5. Después de que las células se hayan recuperado durante 30 minutos a 1 hora, deposite una alícuota (100 μL de 1.000 μL) de la reacción de transformación en un medio de selección sólido y utilice un esparcidor de células estéril para dispersar la alícuota a través de la placa de cultivo de agar. Recoja el resto de las células transformadas por centrifugación (13.000 × g durante 1 min), deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet de la célula en 100 μL de medio estéril y deposite en un medio de selección sólido como se indicó anteriormente. Deje que el líquido se absorba en el medio sólido durante 30 minutos, invierta las placas de cultivo. y colóquelos en una incubadora durante la noche a la temperatura recomendada para la cepa bacteriana y/o plásmido.

4. Cribado para el correcto ensamblaje de plásmidos

1. Después de la incubación (paso 3.5), retire las placas de cultivo de la incubadora y enumere las colonias mediante conteo directo si hay varias colonias bacterianas aisladas en cada placa de cultivo. Seleccione varias colonias (1-10) para el cribado y determinar si contienen el plásmido ensamblado deseado.
   1. Transfiera los medios de crecimiento estériles suplementados con antibióticos apropiados a tubos de cultivo estériles (vidrio o plástico). Inocular el medio de cultivo tocando 1 colonia con una aguja de transferencia estéril o un asa y transferir las células al medio del tubo de cultivo con la aguja de transferencia. Colocar los tubos de cultivo en una incubadora agitadora e incubar durante 16-18 h a la temperatura recomendada para la cepa bacteriana y/o plásmido (rango típico de 25 °C a 37 °C).
2. Al día siguiente, aísle el ADN plasmídico de los cultivos bacterianos mediante lisis alcalina⁶ o utilizando un kit de aislamiento de plásmidos disponible en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
3. Determine si los plásmidos están ensamblados correctamente.
   1. Cuantificar la concentración de ADN de los plásmidos aislados mediante espectrofotometría o estimación en gel.
   2. Utilice una alícuota (50-150 ng) de ADN plasmídico para una reacción digestiva diagnóstica de restricción (volumen final de 10 μL). Seleccione las enzimas de restricción en función del lugar donde se espera que escindan el ADN plasmídico ensamblado.
      NOTA: Recomendamos dos reacciones separadas: (1) tratar el ADN plasmídico con una enzima de restricción que se espera que escinda el plásmido en un solo sitio y (2) tratar el ADN plásmido con dos enzimas de restricción que se espera que extirpen todo o parte del fragmento de ADN insertado. Las enzimas de restricción están disponibles comercialmente y deben usarse siguiendo las instrucciones del fabricante.
   3. Una vez completada la reacción enzimática de restricción, combínelo con un colorante de carga (hasta una concentración de 1x), cargue toda la mezcla en un gel de agarosa y separe los fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa²¹. Utilice un transiluminador UV o LED para visualizar los fragmentos de ADN que han migrado en el gel de agarosa. Compare los fragmentos de ADN restringidos con la escala de peso molecular para determinar si tienen el peso molecular esperado (Figura 4). Tome nota de los plásmidos con los patrones de restricción enzimática esperados (llamados clones positivos); Deseche los tubos que contengan plásmidos que no tengan el patrón de restricción esperado (llamados clones negativos).
4. Para asegurarse de que los clones positivos tienen la secuencia de nucleótidos esperada, envíe una alícuota de clones de plásmidos positivos para su secuenciación.
   NOTA: Se recomienda la secuenciación de plásmidos completos (p. ej., secuenciación de nanoporos).

Resultados

En este manuscrito, como ejemplo del uso de IVA, seguimos el flujo de trabajo de IVA proporcionado para volver a clonar el marco de lectura abierto mCherry en el sitio de clonación múltiple del plásmido pSU19 para generar un plásmido idéntico a pSU19mCherry (Figura 3)¹⁷. Los cebadores adecuados para IVA se diseñaron con base en los pasos 1.1 y 1.2 del protocolo. A continuación, se utilizó un kit de aislamiento de plásmidos pa...

Discusión

El paso más crítico para el éxito de la clonación de IVA es el diseño del fragmento de ADN y del cebador. La eficiencia de IVA mejora considerablemente cuando los fragmentos homólogos están diseñados para tener al menos 15 pb de longitud con una temperatura de fusión de aproximadamente 47-52 °C. Se ha publicado un estudio detallado que explora la optimización del diseño de fragmentos de IVA¹⁶. Otro paso importante para tener una alta eficiencia de clo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA ladder	FroggaBio	DM015-R500	DNA molecular weight marker
AccuReady M Single Channel 0.5-10 µL	Bulldog Bio	BPP020	Pipettes for transferring liquid
AccuReady M Single Channel Pipettor Kit	Bulldog Bio	BPK100	Pipettes for transferring liquid
Agar	BioShop Canada	AGR003.1	Solidifying agent for growth medium
Agarose	Biobasic	D0012	Make agarose gels for DNA electrophoresis
Biometra TOne	Analytikjena	846-2-070-301	Thermocycler
Caps for glass culture tubes	Fisher Scientific	14-957-91	Reusable caps for glass culture tubes
DNA primers	Integrated DNA Technologies	N/A	Bind and amplify template DNA in PCR reaction
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Cleave methylated template DNA following PCR amplification
EcoRI	New England Biolabs	R3101L	Restriction enzyme, comes with appropriate buffer
Eppendorf microtubes 1.5 mL	Sarstedt	72.690.300	Microtube, 1.5 mL, conical base, PP, attached flat cap, molded graduations and frosted writing space
Ethidium bromide	Fisher Scientific	AAL0748203	DNA visualization/intercalating agent, toxic
EZ-10 Spin Column Plasmid DNA Miniprep Kit	Biobasic	BS614	Isolate plasmid DNA from overnight bacterial cultures
GelDoc Go-Gel system	Bio-Rad	12009077	Imaging DNA gels
Glass culture tubes	Fisher Scientific	14-925E	Glass culture tubes
myGel Mini Electrophoresis System	Sigma-Aldrich	Z742288	System used for gel electrophoresis
NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	Determine DNA concentration
PCR Clean Up for DNA Sequencing	Biobasic	BT5100	Purify PCR products
Petri dish	Sarstedt	82.1473.011	Petri dish 92 x 16 mm, PS, transparent, with ventilation cams
Pipette tip, 1000 µL	Sarstedt	70.305	Pipette tips for 100-1000 µL
Pipette tip, 2.5 µL	Sarstedt	70.3010.265	Pipette tips for up to 2.5 µL
Pipette tip, 20 µL	Sarstedt	70.3020.200	Pipette tips for up to 20 µL
Pipette tip, 200 µL	Sarstedt	70.3030.020	Pipette tips for 1-200 µL
Salt (NaCl)	Fisher Scientific	S271-10	Component of bacterial growth medium (10 g/L)
Single 0.2 mL PCR tubes with flat cap	FroggaBio	TF-1000	PCR tubes
Tryptone (Bacteriological)	BioShop Canada	TRP402.5	Component of bacterial growth medium (10 g/L)
VeriFi DNA polymerase	PCR Biosystems	PB10.42-01	High fidelity polymerase, the PCR buffer containing Mg2+ and dNTPs is provided with purchase
Xba I	New England Biolabs	R0145S	Restriction enzyme, comes with appropriate buffer
Yeast extract	BioShop Canada	YEX401.205	Component of bacterial growth medium (5 g/L)