고효율 플라스미드 구조를 위한 In Vivo Assembly 사용

요약

In vivo assembly는 박테리아의 고유 DNA 복구 효소에 의존하여 상동 재조합에 의한 DNA 단편을 조립하는 결찰 독립적 클로닝 방법입니다. 이 프로토콜은 시약이 거의 필요하지 않고 클로닝 효율이 99%에 달하기 때문에 시간과 비용 면에서 모두 효율적입니다.

초록

IVA(In vivo Assembly)는 박테리아에 존재하는 고유 효소를 사용하여 DNA 단편의 분자간 재조합을 촉진하여 플라스미드를 조립하는 분자 클로닝 방법입니다. 이 방법은 상동성 영역이 15-50bp인 DNA 단편을 일반적으로 사용되는 실험실 대장균 균주로 변형시키는 방식으로 기능하며, 박테리아는 RecA 독립 복구 경로를 사용하여 DNA 단편을 플라스미드로 조립합니다. 이 방법은 E. coli 균주로 전환되기 전에 플라스미드의 체외 조립에 의존하는 많은 분자 클로닝 방법보다 빠르고 비용 효율적입니다. 이는 in vitro 방법을 사용하려면 특수 효소를 구입하고 배양이 필요한 순차적 효소 반응을 수행해야 하기 때문입니다. 그러나 in vitro 방법과 달리 IVA는 선형 플라스미드를 조립하는 것으로 실험적으로 입증되지 않았습니다. 여기에서는 복제 기원과 항생제 내성 마커가 다른 플라스미드 간에 플라스미드 및 서브클론 DNA 단편을 신속하게 조립하기 위해 실험실에서 사용하는 IVA 프로토콜을 공유합니다.

서문

분자 클로닝은 특정 재조합 DNA¹을 포함하는 플라스미드를 생산하는 데 필요한 일련의 실험실 기술을 포함합니다. 이러한 유비쿼터스 기술은 종종 실험 워크플로우²에서 병목 현상으로 작용합니다. 많은 분자 클로닝 기술은 증폭을 위해 숙주 균주(예: 대장균 DH5a)로 형질전환하기 전에 일련의 효소 반응을 사용하여 시험관에서 DNA 단편의 조립에 의존합니다 ^3,4,5,6,7. 체외 플라스미드 조립 방법은 효소에 의존하기 때문에 효소를 구매하거나 정제하는 것은 비용과 시간이 많이 소요될 수 있습니다.

생체 내 조립(IVA)은 적절한 숙주에서 DNA 단편의 분자간 재조합에 의존하는 분자 클로닝 방법입니다 ^8,9,10,11,12. 이 방법의 기초는 일반적으로 사용되는 E. coli의 recA-cloning 균주가 제한 효소¹³에 의해 절단된 플라스미드와 단일 가닥 프라이머의 분자간 재조합을 매개할 수 있다는 관찰이었습니다. 대장균에 있는 플라스미드 집합을 위한 상동 DNA 끝을 생성하는 PCR의 사용은 1990 년대에서 기술되고 이 방법은 재조합 PCR ^3,14이라고 지명되었다. 재조합 PCR의 효율은 약 50%¹⁴로 보고되었습니다. 그러나 이 방법은 프라이머의 높은 비용과 큰 DNA 단편을 증폭하기 위해 저충실도 중합효소를 사용하여 원치 않는 돌연변이를 도입할 위험이 있기 때문에 널리 채택되지 않았습니다. 이러한 단점은 1990년대에 심각했으며 제한 효소 매개 복제와 같은 체외 복제 방법을 사용하여 피할 수 있었습니다.

최근 몇 년 동안 프라이머의 비용이 감소했으며 새로운 상업용 중합효소가 PCR 증폭의 충실도를 높였습니다. 그 결과, 재조합 PCR은 빠르고 비용 효율적인 분자 클로닝 기술로 재검토되었으며 IVA ^2,9,15,16으로 브랜드가 변경되었습니다. 타당성이 높아짐에 따라 IVA에 대한 연구가 더욱 심화되었으며, 이 방법은 최대 99%¹⁶의 클로닝 효율에 도달하도록 최적화되었습니다. 최적화를 통해 염기쌍의 수 및 용융 온도와 같은 상동 DNA의 특징이 생체 내 재결합 효율을 극대화하는 것으로 확인되었습니다 ^2,16. 추가 분석은 150 bp에서 7 kbp에 이르는 최대 6개의 DNA 단편이 IVA¹⁵에 의해 효율적으로 조립될 수 있음을 보여주었습니다. 또한, 우리 그룹은 최근 IVA를 사용하여 다양한 항생제 내성 카세트와 복제 기원을 가진 플라스미드 시리즈를 조립했습니다¹⁷. 이 연구에서 IVA 클로닝은 각 플라스미드(n = 2)에 대해 소수의 클론을 테스트하여 매우 효율적(71-100%)이었습니다¹⁷. 여기에서는 본 실험실에서 사용하는 IVA 프로토콜에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. 상동 말단을 가진 디자인 뇌관 또는 DNA 파편

1. 워드 프로세싱 소프트웨어 또는 특수 DNA 분석 소프트웨어를 사용하여 원하는 플라스미드를 인위적으로 조립합니다.
   참고: 다양한 출처의 DNA 단편을 색상으로 구분하고 다운스트림 조립 단계에서 사용할 상동 영역을 강조하는 것이 종종 도움이 됩니다. 또한 방향성 조립을 보장하기 위해 상동 DNA를 색상으로 구분하는 것도 도움이 됩니다.
2. 각 DNA 단편에 결합하고 상동 DNA 서열 (그림 1) ^2,15의 15-50 bp를 포함하는 설계 프라이머.
   1. IVA 효율을 높이려면 상동 DNA 단편의 용융 온도가 47-52°^C2인지 확인하십시오.
      참고: 용융 온도는 온라인 소프트웨어¹⁸ 또는 공식 : 용융 온도 = 64.9 + 41 * (nG + nC - 16.4) / (nA + nT + nG + nC), 여기서 n = 시퀀스 ^6,19의 G, C, A 또는 T의 수.
   2. HIS-태그를 인코딩하는 CATCATCATCATCATCAT과 같이 매우 반복적인 서열을 가진 프라이머는 불안정성을 유발할 수 있으므로 피하십시오²⁰. poly-HIS 태그 삽입과 같은 응용 분야에 최종 반복 아미노산 서열이 필요한 경우 CATCACCATCATCACCAC과 같은 대체 코돈을 사용하여 핵산 서열 반복을 줄입니다.
      참고: 프라이머는 선호하는 공급업체에서 주문할 수 있습니다. DNA 단편이 합성되려면 상동 말단이 합성된 DNA 단편에 통합되어야 합니다.

2. 상동 말단을 포함하는 DNA 산물의 증폭

1. 시판되는 표준 DNA 분리 키트 또는 알칼리 용해를 사용하여 플라스미드 DNA 또는 게놈 DNA 템플릿을 분리하십시오 ^6,17.
2. 시판되는 high-fidelity polymerase를 사용한 PCR 반응에서 template DNA(단계 2.1)와 상동 영역(단계 1.2)을 포함하는 프라이머를 사용합니다. 다운스트림 반응에서 DNA template carryover를 제한하려면 각 반응에서 적은 양의 template DNA(20pg-1ng)를 사용하십시오. 효소 특이적 PCR 반응 혼합물 성분 및 권장 PCR 사이클링 조건에 대한 제조업체의 권장 사항을 참조하십시오. PCR 반응을 진행한다.
   1. PCR 반응(50 μL)을 설정하여 그림 2 에 표시된 DNA 단편을 100 μM의 dNTP, 0.2 μM의 각 DNA 프라이머, 템플릿 DNA(50 pg의 pSU19 및 1 ng의 pSU18mCherry), Mg²⁺ (2 mM 최종 농도) 및 1 U의 high-fidelity DNA 중합효소를 포함하는 1x PCR 반응 완충액 혼합물을 증폭합니다.
   2. touchdown PCR cycling 프로그램을 사용하여 pSU19 및 mCherry를 증폭합니다(그림 2). 초기 변성 단계를 95°C에서 5분 동안 설정한 다음 95°C에서 15초, 55°C-0.5°C에서 15초, 72°C에서 1분 동안 1회 설정한 다음 95°C에서 15초, 50°C에서 15초, 72°C에서 1분 동안 20회 추가 사이클을 설정합니다. 72°C에서 10분 동안 최종 확장 단계로 PCR 사이클을 완료합니다.
      참고: 플라스미드 골격을 증폭해야 하는 경우, 분자량에 따라 DNA 템플릿의 수량을 조정합니다: PCR 반응 50μL당 ~20pg/1kbp의 플라스미드 DNA(pSU19(그림 참조)의 경우 DNA 50pg). 또한, 증폭 중에 도입되는 돌연변이의 수를 최소화하기 위해 PCR 사이클을 조정하십시오: 플라스미드 골격의 증폭을 위해서는 20-25 PCR 사이클 정도면 충분합니다.
3. PCR 반응이 완료되면 PCR 반응의 부분 표본(2 μL)을 제거하고, 로딩 염료(1x 농도까지)와 결합하고, 아가로즈 겔 전기영동²¹로 DNA 단편을 분리합니다. 자외선(UV) 또는 LED 투과광기를 사용하여 아가로스 겔에서 이동한 DNA 단편을 시각화합니다. PCR 산물이 고유한지 확인하고 제품을 DNA 래더와 비교하여 예상 분자량인지 확인합니다(그림 2). 올바른 분자량의 PCR 산물이 시각화되지 않는 경우, PCR 반응 최적화를 위한 제조업체의 권장 사항을 참조하십시오.
   참고: PCR 산물이 고유하지 않지만 예상 분자량에 해당하는 풍부한 DNA 단편이 있는 경우 추가 PCR 반응을 피할 수 있습니다.
4. 아가로스 겔에 여러 DNA 단편이 존재하는 경우, 아가로스 겔에서 예상 분자량에 해당하는 DNA 단편을 절제하고 아가로스 겔 추출 키트를 사용하여 DNA 단편을 회수합니다.
5. PCR 반응에서 메틸화된 템플릿 DNA를 제거하려면 1μL의 DpnI을 반응 튜브에 직접 첨가합니다. 37°C에서 15분에서 하룻밤 동안 반응을 배양합니다.
   참고: 이 선택적 단계는 다운스트림 반응에서 운반되는 template DNA의 양을 제한하는 데 적극 권장됩니다. 그러나 PCR 반응에서 매우 낮은 농도의 템플릿 DNA가 사용되는 경우 이 단계를 건너뛸 수 있습니다.
6. 핵산 정제 키트를 사용하여 효소 분석으로 인한 잔류 효소, 염, 프라이머 이량체 및 기타 원치 않는 저분자 DNA 산물을 제거합니다.
   참고: DNA 단편이 합성되면 2.1-2.6단계를 건너뛸 수 있습니다.
7. 분광 광도법 또는 겔 추정을 통해 정제된 DNA 단편의 DNA 농도를 정량화합니다.

3. IVA(그림 3)

1. 각 IVA 반응에 필요한 DNA의 양을 계산합니다(25-50ng의 플라스미드 DNA 권장). 분자량이 더 높은 플라스미드의 경우 더 많은 양의 플라스미드 DNA를 사용합니다(예: 2.3 kbp의 플라스미드의 경우 25 ng의 플라스미드를 사용하지만 플라스미드가 9 kbp인 경우 각 반응에서 50 ng을 사용). 반응에 필요한 삽입 DNA의 부피를 계산합니다. 1:3 또는 1:5 몰 비율의 plasmid:insert DNA를 사용합니다.
   참고: 온라인 바이오 계산기 또는 아래 제공된 공식을 사용하여 이중 가닥 DNA 단편의 어금니 수량을 계산하고 각 DNA 단편의 몰 비율을 결정할 수 있습니다.
   이중 가닥 DNA 단편의 어금니 수량을 계산하기 위해 다음 공식을 사용합니다: pmol = (ng의 무게) × 1,000 / (염기쌍 × 650 달톤). 또한, 몰비는 질량 인서트 (g) = 원하는 인서트 / 플라스미드 몰 비율 × 플라스미드 질량 (g) × 플라스미드 길이 인서트의 비율로 계산할^{수 있습니다.}
2. 계산된 부피의 플라스미드를 결합하고 DNA를 미리 냉각된 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 삽입하고 얼음 위에 보관합니다.
3. 플라스미드를 옮기고 3.2단계의 DNA 혼합물을 해동된 recA^- 화학적으로 적극적인 대장 균(예: 대장균 DH5a;²²).
   참고: 사용되는 유능 세포의 부피는 플라스미드 및 삽입 DNA 혼합물의 부피에 따라 다릅니다. 이 혼합물은 유능 세포의 10% 부피를 초과해서는 안 됩니다.
4. 열 충격 변환을 진행하십시오²³.
   1. 화학적으로 유능한 대장균 과 DNA의 혼합물을 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
   2. 42°C 수조에 1분 동안 넣은 다음 튜브를 얼음에 2분 동안 넣습니다.
   3. LB를 무균 방식으로 튜브로 옮겨 부피를 1mL로 만듭니다.
   4. 1mL 부피를 유리 배양 튜브로 옮기고 37°C, 220rpm 또는 박테리아 균주 및/또는 플라스미드가 회복될 수 있도록 권장 온도(일반적으로 25°C-37°C)로 설정된 진탕 인큐베이터에 넣고 플라스미드 인코딩 항생제 선택 마커를 생산할 수 있도록 합니다.
5. 세포가 30분에서 1시간 동안 회복된 후 형질전환 반응의 분취액(1,000μL 중 100μL)을 고체 선택 배지에 증착하고 멸균 세포 스프레더를 사용하여 한천 배양 플레이트에 분취액을 분산시킵니다. 원심분리(1분 동안 13,000 × g )로 형질전환된 세포의 나머지 부분을 수집하고, 상등액을 버리고, 세포 펠렛을 100μL의 멸균 배지에 재현탁하고, 위와 같이 고체 선택 배지에 증착합니다. 액체가 고체 매체에 흡수되도록 30분 동안 하고 배양 플레이트를 뒤집습니다. 그리고 박테리아 균주 및/또는 플라스미드에 권장되는 온도로 밤새 인큐베이터에 넣습니다.

4. 올바른 플라스미드 조립을 위한 스크리닝

1. 배양 후(3.5단계), 인큐베이터에서 배양 플레이트를 제거하고 각 배양 플레이트에 여러 개의 분리된 박테리아 콜로니가 있는 경우 직접 계수하여 콜로니를 열거합니다. 스크리닝을 위해 여러 콜로니(1-10)를 선택하여 원하는 조립된 플라스미드를 함유하고 있는지 확인합니다.
   1. 적절한 항생제가 보충된 멸균 성장 배지를 멸균 배양 튜브(유리 또는 플라스틱)로 옮깁니다. 멸균 전달 바늘 또는 루프로 1개의 콜로니를 터치하여 배양 배지를 접종하고 전달 바늘로 세포를 배양관 배지로 이식합니다. 배양 튜브를 진탕 인큐베이터에 넣고 박테리아 균주 및/또는 플라스미드에 권장되는 온도(일반적으로 25°C에서 37°C)에 권장되는 온도에서 16-18시간 동안 배양합니다.
2. 다음 날, 알칼리 용해⁶ 또는 제조업체의 지침에 따라 시판되는 플라스미드 분리 키트를 사용하여 박테리아 배양에서 플라스미드 DNA를 분리합니다.
3. 플라스미드가 올바르게 조립되었는지 확인합니다.
   1. 분광광도법 또는 겔 추정을 통해 분리된 플라스미드의 DNA 농도를 정량화합니다.
   2. 진단용 제한 분해 반응(10 μL 최종 부피)을 위해 부분 표본(50-150 ng)의 플라스미드 DNA를 사용합니다. 조립된 플라스미드 DNA를 절단할 것으로 예상되는 위치에 따라 제한 효소를 선택합니다.
      참고: 두 가지 개별 반응을 권장합니다: (1) 단일 부위에서 플라스미드를 절단할 것으로 예상되는 제한 효소로 플라스미드 DNA를 처리하고, (2) 삽입된 DNA 단편의 전체 또는 일부를 절단할 것으로 예상되는 두 개의 제한 효소로 플라스미드 DNA를 처리합니다. 제한 효소는 시판되고 있으며 제조업체의 지침에 따라 사용해야 합니다.
   3. 제한 효소 반응이 완료되면, 로딩 염료(1x 농도까지)와 결합하고, 전체 혼합물을 아가로스 겔에 로드하고, 아가로즈 겔 전기영동²¹로 DNA 단편을 분리합니다. UV 또는 LED transilluminator를 사용하여 아가로스 겔에서 이동한 DNA 단편을 시각화합니다. 제한된 DNA 단편을 분자량 래더와 비교하여 예상 분자량인지 확인합니다(그림 4). 예상되는 효소 제한 패턴( positive clones이라고 함)을 가진 플라스미드를 주목하십시오. 예상되는 제한 패턴이 없는 플라스미드가 포함된 튜브( negative clone이라고 함)를 폐기합니다.
4. positive clone이 예상되는 nucleotide sequence를 갖도록 하려면 염기서열분석을 위해 positive plasmid clone의 부분 표본을 보냅니다.
   참고: 전체 플라스미드 염기서열분석(예: 나노포어 염기서열분석)이 권장됩니다.

결과

이 원고에서는 IVA 사용의 예로, 제공된 IVA 워크플로우를 따라 mCherry open reading frame을 plasmid pSU19의 다중 클로닝 부위에 재복제하여 pSU19mCherry와 동일한 plasmid를 생성했습니다(그림 3)¹⁷. IVA에 적합한 프라이머는 프로토콜 단계 1.1 및 1.2를 기반으로 설계되었습니다. 그런 다음 플라스미드 분리 키트를 사용하여 pSU19 및 pSU18mCherry를 분리?...

토론

성공적인 IVA 클로닝을 위한 가장 중요한 단계는 DNA 단편과 프라이머 설계입니다. IVA 효율은 상동 단편이 약 47-52°C의 용융 온도에서 길이가 15bp 이상으로 설계될 때 크게 향상됩니다. IVA 단편 설계의 최적화를 탐구하는 상세한 연구가 발표되었다¹⁶. 높은 클로닝 효율을 위한 또 다른 중요한 단계는 PCR 증폭 단계에서 가능한 한 적은 템플릿 DNA를 사용하는 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA ladder	FroggaBio	DM015-R500	DNA molecular weight marker
AccuReady M Single Channel 0.5-10 µL	Bulldog Bio	BPP020	Pipettes for transferring liquid
AccuReady M Single Channel Pipettor Kit	Bulldog Bio	BPK100	Pipettes for transferring liquid
Agar	BioShop Canada	AGR003.1	Solidifying agent for growth medium
Agarose	Biobasic	D0012	Make agarose gels for DNA electrophoresis
Biometra TOne	Analytikjena	846-2-070-301	Thermocycler
Caps for glass culture tubes	Fisher Scientific	14-957-91	Reusable caps for glass culture tubes
DNA primers	Integrated DNA Technologies	N/A	Bind and amplify template DNA in PCR reaction
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Cleave methylated template DNA following PCR amplification
EcoRI	New England Biolabs	R3101L	Restriction enzyme, comes with appropriate buffer
Eppendorf microtubes 1.5 mL	Sarstedt	72.690.300	Microtube, 1.5 mL, conical base, PP, attached flat cap, molded graduations and frosted writing space
Ethidium bromide	Fisher Scientific	AAL0748203	DNA visualization/intercalating agent, toxic
EZ-10 Spin Column Plasmid DNA Miniprep Kit	Biobasic	BS614	Isolate plasmid DNA from overnight bacterial cultures
GelDoc Go-Gel system	Bio-Rad	12009077	Imaging DNA gels
Glass culture tubes	Fisher Scientific	14-925E	Glass culture tubes
myGel Mini Electrophoresis System	Sigma-Aldrich	Z742288	System used for gel electrophoresis
NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	Determine DNA concentration
PCR Clean Up for DNA Sequencing	Biobasic	BT5100	Purify PCR products
Petri dish	Sarstedt	82.1473.011	Petri dish 92 x 16 mm, PS, transparent, with ventilation cams
Pipette tip, 1000 µL	Sarstedt	70.305	Pipette tips for 100-1000 µL
Pipette tip, 2.5 µL	Sarstedt	70.3010.265	Pipette tips for up to 2.5 µL
Pipette tip, 20 µL	Sarstedt	70.3020.200	Pipette tips for up to 20 µL
Pipette tip, 200 µL	Sarstedt	70.3030.020	Pipette tips for 1-200 µL
Salt (NaCl)	Fisher Scientific	S271-10	Component of bacterial growth medium (10 g/L)
Single 0.2 mL PCR tubes with flat cap	FroggaBio	TF-1000	PCR tubes
Tryptone (Bacteriological)	BioShop Canada	TRP402.5	Component of bacterial growth medium (10 g/L)
VeriFi DNA polymerase	PCR Biosystems	PB10.42-01	High fidelity polymerase, the PCR buffer containing Mg2+ and dNTPs is provided with purchase
Xba I	New England Biolabs	R0145S	Restriction enzyme, comes with appropriate buffer
Yeast extract	BioShop Canada	YEX401.205	Component of bacterial growth medium (5 g/L)