Verwendung von In-vivo-Assemblierung für den hocheffizienten Plasmidbau

Zusammenfassung

Die In-vivo-Assemblierung ist eine ligationsunabhängige Klonierungsmethode, die auf intrinsischen DNA-Reparaturenzymen in Bakterien beruht, um DNA-Fragmente durch homologe Rekombination zusammenzusetzen. Dieses Protokoll ist sowohl zeit- als auch kosteneffizient, da nur wenige Reagenzien benötigt werden und die Klonierungseffizienz bis zu 99 % betragen kann.

Zusammenfassung

Die In-vivo-Assemblierung (IVA) ist eine molekulare Klonierungsmethode, bei der intrinsische Enzyme in Bakterien verwendet werden, die die intermolekulare Rekombination von DNA-Fragmenten fördern, um Plasmide zusammenzusetzen. Bei dieser Methode werden DNA-Fragmente mit einer Homologie von 15-50 bp in häufig verwendete Laborstämme von Escherichia coli umgewandelt, und die Bakterien verwenden den RecA-unabhängigen Reparaturweg, um die DNA-Fragmente zu einem Plasmid zusammenzusetzen. Diese Methode ist schneller und kostengünstiger als viele molekulare Klonierungsmethoden, die auf der In-vitro-Assemblierung von Plasmiden vor der Umwandlung in E. coli-Stämme beruhen. Dies liegt daran, dass In-vitro-Methoden den Kauf spezialisierter Enzyme und die Durchführung sequenzieller enzymatischer Reaktionen erfordern, die Inkubationen erfordern. Im Gegensatz zu In-vitro-Methoden wurde jedoch experimentell nicht gezeigt, dass IVA lineare Plasmide assembliert. Hier teilen wir das IVA-Protokoll, das von unserem Labor verwendet wird, um Plasmide schnell zusammenzusetzen und DNA-Fragmente zwischen Plasmiden mit unterschiedlicher Herkunft der Replikation und Antibiotikaresistenzmarkern zu subklonen.

Einleitung

Die molekulare Klonierung umfasst eine Reihe von Labortechniken, die zur Herstellung von Plasmiden mit spezifischer rekombinanter DNA^{erforderlich sind 1}. Diese allgegenwärtigen Techniken stellen oft einen Engpass im experimentellen Arbeitsablauf^{dar 2}. Viele molekulare Klonierungstechniken beruhen auf der Assemblierung von DNA-Fragmenten in vitro unter Verwendung einer Reihe enzymatischer Reaktionen vor der Umwandlung in einen Wirtsstamm (z. B. Escherichia coli DH5a) zur Amplifikation 3,4,5,6,7. Da In-vitro-Plasmid-Assemblierungsmethoden auf Enzymen beruhen, kann der Kauf oder die Reinigung von Enzymen sowohl kostspielig als auch zeitaufwändig sein.

Die In-vivo-Assemblierung (IVA) ist eine molekulare Klonierungsmethode, die auf der intermolekularen Rekombination von DNA-Fragmenten in einem geeigneten Wirt^beruht 8,9,10,11,12. Grundlage dieser Methode war die Beobachtung, dass häufig verwendete recA-Klonierungsstämme von E. coli die intermolekulare Rekombination eines einzelsträngigen Primers mit einem durch Restriktionsenzyme gespaltenen Plasmid vermitteln können¹³. Die Verwendung der PCR zur Erzeugung homologer DNA-Enden für die Plasmidassemblierung in E. coli wurde in den 1990er Jahren beschrieben und diese Methode als Rekombinations-PCR ^3,14 bezeichnet. Die Wirksamkeit der Rekombinations-PCR wurde mit etwa 50 % ^angegeben14. Diese Methode wurde jedoch nicht weit verbreitet übernommen, wahrscheinlich aufgrund der hohen Kosten für Primer und des Risikos, unerwünschte Mutationen mit Polymerasen mit geringer Genauigkeit einzuführen, um große DNA-Fragmente zu amplifizieren. Diese Nachteile waren in den 1990er Jahren erheblich und konnten durch den Einsatz von In-vitro-Klonierungsmethoden wie der Restriktionsenzym-vermittelten Klonierung vermieden werden.

In den letzten Jahren sind die Kosten für Primer gesunken, und neue kommerzielle Polymerasen haben die Genauigkeit der PCR-Amplifikation erhöht. Infolgedessen wurde die Rekombinations-PCR als schnelle und kostengünstige molekulare Klonierungstechnik neu interpretiert und in IVA 2,9,15,16 umbenannt. Mit zunehmender Machbarkeit wurde die IVA weiter erforscht und die Methode optimiert, um eine Klonierungseffizienz von bis zu 99 % zu ^erreichen16. Bei den Optimierungen wurden Merkmale der homologen DNA identifiziert, wie z. B. die Anzahl der Basenpaare und die Schmelztemperatur, die die in vivo-Rekombinationseffizienz maximieren ^2,16. Weitere Analysen zeigten, dass bis zu 6 DNA-Fragmente im Bereich von 150 bp bis 7 kbp mit IVA¹⁵ effizient assembliert werden konnten. Darüber hinaus hat unsere Gruppe kürzlich IVA verwendet, um eine Plasmidserie mit unterschiedlichen Antibiotikaresistenzkassetten und Replikationsursprüngen zusammenzusetzen¹⁷. In dieser Studie war die IVA-Klonierung hocheffizient (71-100%), wobei für jedes Plasmid eine kleine Anzahl von Klonen getestet wurde (n = 2)¹⁷. Hier beschreiben wir das von unserem Labor verwendete IVA-Protokoll.

Protokoll

1. Primer oder DNA-Fragmente mit homologen Enden entwerfen

1. Verwenden Sie eine Textverarbeitungssoftware oder eine spezielle DNA-Analysesoftware, um das gewünschte Plasmid künstlich zusammenzusetzen.
   HINWEIS: Es ist oft hilfreich, DNA-Fragmente aus verschiedenen Quellen farblich zu kennzeichnen und homologe Regionen hervorzuheben, die in nachgelagerten Assemblierungsschritten verwendet werden. Darüber hinaus ist es auch hilfreich, homologe DNA farblich zu kodieren, um eine gerichtete Assemblierung zu gewährleisten.
2. Entwerfen Sie Primer, die an jedes DNA-Fragment binden und 15-50 bp der homologen DNA-Sequenz enthalten (Abbildung 1)^2,15.
   1. Um die IVA-Effizienz zu erhöhen, stellen Sie sicher, dass homologe DNA-Fragmente Schmelztemperaturen von 47-52 °C^{aufweisen 2}.
      HINWEIS: Die Schmelztemperatur kann mit der Online-Software¹⁸ oder der Formel bestimmt werden: Schmelztemperatur = 64,9 + 41 * (nG + nC - 16,4)/(nA + nT + nG + nC), wobei n = Anzahl von G, C, A oder T in der Sequenz ^6,19 ist.
   2. Vermeiden Sie Primer mit sich stark wiederholenden Sequenzen wie CATCATCATCATCATCATCATCAT, die für ein HIS-Tag kodieren, da sie zu Instabilität²⁰ führen können. Wenn eine endgültige, sich wiederholende Aminosäuresequenz für Anwendungen wie das Einfügen eines Poly-HIS-Tags benötigt wird, verwenden Sie alternative Codons wie CATCACCATCATCACCAC, um die Wiederholung der Nukleinsäuresequenz zu verringern.
      HINWEIS: Grundierungen können bei jedem bevorzugten Anbieter bestellt werden. Wenn DNA-Fragmente synthetisiert werden sollen, sollten homologe Enden in das synthetisierte DNA-Fragment eingebaut werden.

2. Amplifikation von DNA-Produkten, die homologe Enden enthalten

1. Isolierung von Plasmid-DNA oder genomischen DNA-Templates unter Verwendung von handelsüblichen DNA-Isolationskits oder alkalischer Lyse ^6,17.
2. Verwenden Sie Matrizen-DNA (aus Schritt 2.1) und Primer, die homologe Regionen enthalten (Schritt 1.2) in einer PCR-Reaktion mit einer kommerziell erhältlichen High-Fidelity-Polymerase. Um die DNA-Matrizenverschleppung in nachgeschalteten Reaktionen zu begrenzen, verwenden Sie in jeder Reaktion eine geringe Menge an Matrizen-DNA (20 pg-1 ng). Beachten Sie die Empfehlungen des Herstellers für enzymspezifische PCR-Reaktionsgemischkomponenten und die empfohlenen Bedingungen für den PCR-Zyklus. Fahren Sie mit der PCR-Reaktion fort.
   1. Richten Sie die PCR-Reaktionen (50 μl) so ein, dass sie die in Abbildung 2 gezeigten DNA-Fragmente so amplifizieren, dass sie 100 μM dNTPs, 0,2 μM jedes DNA-Primers, Template-DNA (50 pg pSU19 und 1 ng pSU18mCherry), 1x PCR-Reaktionspuffermischung mit Mg²⁺ (2 mM Endkonzentration) und 1 U High-Fidelity-DNA-Polymerase enthalten.
   2. Verwenden Sie ein Touchdown-PCR-Cycling-Programm, um pSU19 und mCherry zu amplifizieren (Abbildung 2). Stellen Sie den anfänglichen Denaturierungsschritt 5 Minuten lang auf 95 °C ein, gefolgt von 10 Zyklen mit 95 °C für 15 s, 55 °C bis 0,5 °C pro Zyklus für 15 s und 72 °C für 1 min und dann 20 weitere Zyklen mit 95 °C für 15 s, 50 °C für 15 s und 72 °C für 1 min. Beenden Sie den PCR-Zyklus mit einem letzten Verlängerungsschritt bei 72 °C für 10 Minuten.
      HINWEIS: Wenn ein Plasmidrückgrat amplifiziert werden soll, passen Sie die Menge des DNA-Templates basierend auf dem Molekulargewicht an: mit ~20 pg/1 kbp Plasmid-DNA pro 50 μl PCR-Reaktion (50 pg DNA für pSU19 (gezeigt)). Passen Sie außerdem die PCR-Zyklen an, um die Anzahl der während der Amplifikation eingeführten Mutationen zu minimieren: Für die Amplifikation von Plasmidrückgraten sind bereits 20-25 PCR-Zyklen ausreichend.
3. Sobald die PCR-Reaktion abgeschlossen ist, entfernen Sie ein Aliquot (2 μl) der PCR-Reaktion, kombinieren Sie es mit einem Ladefarbstoff (bis zu einer 1-fachen Konzentration) und trennen Sie die DNA-Fragmente durch Agarose-Gelelektrophorese²¹. Verwenden Sie einen ultravioletten (UV) oder LED-Transilluminator, um DNA-Fragmente sichtbar zu machen, die in das Agarosegel migriert sind. Stellen Sie fest, ob PCR-Produkte einzigartig sind, und vergleichen Sie die Produkte mit der DNA-Leiter, um zu überprüfen, ob sie das erwartete Molekulargewicht haben (Abbildung 2). Wenn keine PCR-Produkte mit dem richtigen Molekulargewicht sichtbar sind, beziehen Sie sich auf die Empfehlungen des Herstellers zur Optimierung der PCR-Reaktion.
   HINWEIS: Wenn die PCR-Produkte nicht einzigartig sind, aber ein reichlich vorhandenes DNA-Fragment vorhanden ist, das dem erwarteten Molekulargewicht entspricht, kann eine zusätzliche PCR-Reaktion vermieden werden.
4. Wenn mehrere DNA-Fragmente im Agarosegel vorhanden sind, entfernen Sie das DNA-Fragment, das dem erwarteten Molekulargewicht entspricht, aus dem Agarosegel und verwenden Sie ein Agarosegel-Extraktionskit, um das DNA-Fragment zu gewinnen.
5. Um methylierte Template-DNA aus den PCR-Reaktionen zu entfernen, geben Sie 1 μl DpnI direkt in das Reaktionsröhrchen. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 °C für 15 Minuten bis über Nacht.
   HINWEIS: Dieser optionale Schritt wird dringend empfohlen, um die Menge an Template-DNA zu begrenzen, die in nachgelagerten Reaktionen weitergetragen wird. Dieser Schritt kann jedoch übersprungen werden, wenn in der PCR-Reaktion sehr geringe Konzentrationen von Template-DNA verwendet werden.
6. Verwenden Sie ein Nukleinsäure-Aufreinigungskit, um verbleibende Enzyme, Salze, Primer-Dimere und andere unerwünschte niedermolekulare DNA-Produkte zu entfernen, die aus enzymatischen Assays resultieren.
   HINWEIS: Die Schritte 2.1-2.6 können übersprungen werden, wenn DNA-Fragmente synthetisiert werden.
7. Quantifizieren Sie die DNA-Konzentration der gereinigten DNA-Fragmente durch Spektrophotometrie oder Gelschätzung.

3. IVA (Abbildung 3)

1. Berechnen Sie die Menge an DNA, die für jede IVA-Reaktion erforderlich ist (empfohlen werden 25-50 ng Plasmid-DNA). Verwenden Sie höhere Mengen an Plasmid-DNA für Plasmide mit höherem Molekulargewicht (z. B. verwenden Sie für Plasmide von 2,3 kbp 25 ng Plasmid, aber wenn Plasmide 9 kbp sind, verwenden Sie 50 ng in jeder Reaktion). Berechnen Sie das Volumen der insertiven DNA, das für die Reaktion benötigt wird. Verwenden Sie ein molares Verhältnis von 1:3 oder 1:5 von Plasmid:Insert-DNA.
   HINWEIS: Online-Biorechner oder die unten angegebenen Formeln können verwendet werden, um die molare Menge eines doppelsträngigen DNA-Fragments zu berechnen und das molare Verhältnis jedes DNA-Fragments zu bestimmen.
   Wir verwenden die folgende Formel, um die molare Menge eines doppelsträngigen DNA-Fragments zu berechnen: pmol = (Gewicht in ng) × 1.000 / (Basenpaare × 650 Dalton). Darüber hinaus können molare Verhältnisse berechnet werden durch: Masse Insert (g) = gewünschtes Insert/Plasmid molares Verhältnis × Masse des Plasmids (g) × Verhältnis von Insert- zu Plasmidlängen⁶.
2. Kombinieren Sie das berechnete Plasmidvolumen, geben Sie die DNA in ein vorgekühltes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und bewahren Sie es auf Eis auf.
3. Übertragen Sie das Plasmid und das eingefügte DNA-Gemisch aus Schritt 3.2 in ein Aliquot (25-100 μl) aus aufgetauten recA^- chemisch kompetenten E. coli (z. B. E. coli DH5a;²²).
   HINWEIS: Das Volumen der verwendeten kompetenten Zellen hängt vom Volumen des Plasmid- und Insert-DNA-Gemisches ab. Dieses Gemisch sollte 10 Vol.-% der zuständigen Zellen nicht überschreiten.
4. Fahren Sie mit einer Hitzeschock-Transformation^{fort 23}.
   1. Inkubieren Sie die Mischung aus chemisch kompetenten E. coli und DNA 30 Minuten lang auf Eis.
   2. 1 min in ein 42 °C warmes Wasserbad geben, dann den Schlauch für 2 min auf Eis stellen.
   3. Übertragen Sie LB aseptisch in das Röhrchen, um das Volumen auf 1 ml zu erhöhen.
   4. Übertragen Sie das 1-ml-Volumen in ein Glaskulturröhrchen und stellen Sie es in einen Schüttelinkubator, der auf 37 °C, 220 U/min oder die empfohlene Temperatur eingestellt ist, damit sich der Bakterienstamm und/oder das Plasmid erholen kann (typischer Bereich von 25 °C bis 37 °C), und ermöglichen Sie die Produktion des Plasmid-kodierten Antibiotika-Auswahlmarkers.
5. Nachdem sich die Zellen 30 Minuten bis 1 h erholt haben, wird ein Aliquot (100 μl von 1.000 μl) der Transformationsreaktion auf ein festes Selektionsmedium abgegeben und das Aliquot mit einem sterilen Zellspreizer auf der Agarkulturplatte dispergiert. Sammeln Sie den Rest der transformierten Zellen durch Zentrifugation (13.000 × g für 1 min), entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μl sterilem Medium und lagern Sie es wie oben beschrieben auf festes Selektionsmedium ab. Lassen Sie die Flüssigkeit 30 min lang in das feste Medium einziehen, drehen Sie die Kulturplatten um. und legen Sie sie über Nacht bei der für den Bakterienstamm und/oder das Plasmid empfohlenen Temperatur in einen Inkubator.

4. Screening auf korrekte Plasmidassemblierung

1. Nach der Inkubation (Schritt 3.5) nehmen Sie die Kulturplatten aus dem Inkubator und zählen Sie die Kolonien durch direkte Zählung auf, wenn sich auf jeder Kulturplatte mehrere isolierte Bakterienkolonien befinden. Wählen Sie mehrere Kolonien (1-10) für das Screening aus, um festzustellen, ob sie das gewünschte zusammengesetzte Plasmid enthalten.
   1. Sterile Wachstumsmedien, die mit geeigneten Antibiotika ergänzt sind, in sterile Kulturröhrchen (Glas oder Kunststoff) überführen. Beimpfen Sie das Nährmedium, indem Sie 1 Kolonie mit einer sterilen Transfernadel oder -schlaufe berühren und die Zellen mit der Transfernadel in das Kulturröhrchenmedium übertragen. Legen Sie die Kulturröhrchen in einen Schüttelinkubator und inkubieren Sie sie 16-18 Stunden lang bei der für den Bakterienstamm und/oder das Plasmid empfohlenen Temperatur (typischer Bereich von 25 °C bis 37 °C).
2. Am nächsten Tag isolieren Sie die Plasmid-DNA aus den Bakterienkulturen durch alkalische Lyse⁶ oder unter Verwendung eines handelsüblichen Plasmid-Isolationskits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
3. Stellen Sie fest, ob die Plasmide korrekt zusammengesetzt sind.
   1. Quantifizieren Sie die DNA-Konzentration der isolierten Plasmide durch Spektrophotometrie oder Gelschätzung.
   2. Verwenden Sie ein Aliquot (50-150 ng) Plasmid-DNA für eine diagnostische Restriktionsverdauungsreaktion (10 μl Endvolumen). Wählen Sie Restriktionsenzyme danach aus, wo sie die zusammengesetzte Plasmid-DNA spalten sollen.
      HINWEIS: Wir empfehlen zwei getrennte Reaktionen: (1) Behandlung von Plasmid-DNA mit einem Restriktionsenzym, von dem erwartet wird, dass es das Plasmid an einer einzigen Stelle spaltet, und (2) Behandlung von Plasmid-DNA mit zwei Restriktionsenzymen, von denen erwartet wird, dass sie das eingefügte DNA-Fragment ganz oder teilweise herausschneiden. Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich und sollten gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet werden.
   3. Sobald die Restriktionsenzymreaktion abgeschlossen ist, kombinieren Sie es mit dem Ladefarbstoff (bis zu einer 1-fachen Konzentration), laden Sie das gesamte Gemisch auf ein Agarosegel und trennen Sie die DNA-Fragmente durch Agarosegelelektrophorese²¹. Verwenden Sie einen UV- oder LED-Transilluminator, um die DNA-Fragmente sichtbar zu machen, die im Agarosegel migriert sind. Vergleichen Sie eingeschränkte DNA-Fragmente mit der Molekulargewichtsleiter, um festzustellen, ob es sich um das/die erwartete(n) Molekulargewicht(e) handelt (Abbildung 4). Beachten Sie die Plasmide mit den erwarteten Enzymrestriktionsmustern ( sogenannte positive Klone); Entsorgen Sie die Röhrchen mit Plasmiden, die nicht das erwartete Restriktionsmuster aufweisen (sogenannte negative Klone).
4. Um sicherzustellen, dass positive Klone die erwartete Nukleotidsequenz aufweisen, senden Sie ein Aliquot positiver Plasmidklone zur Sequenzierung.
   HINWEIS: Es wird eine Ganzplasmid-Sequenzierung empfohlen (z. B. Nanoporen-Sequenzierung).

Ergebnisse

Als Beispiel für die Verwendung von IVA folgten wir in diesem Manuskript dem bereitgestellten IVA-Workflow, um den offenen mCherry-Leserahmen in die multiple Klonierungsstelle des Plasmids pSU19 zu klonen, um ein Plasmid zu erzeugen, das mit pSU19mCherry identisch ist (Abbildung 3)¹⁷. Die für IVA geeigneten Primer wurden auf der Grundlage der Protokollschritte 1.1 und 1.2 entwickelt. Anschließend wurde ein Plasmidisolationskit verw...

Diskussion

Der wichtigste Schritt für eine erfolgreiche IVA-Klonierung ist das Design des DNA-Fragments und des Primers. Die IVA-Effizienz wird erheblich verbessert, wenn homologe Fragmente mit einer Länge von mindestens 15 bp und einer Schmelztemperatur von etwa 47-52 °C ausgelegt sind. Eine detaillierte Studie zur Optimierung des IVA-Fragmentdesigns wurde veröffentlicht¹⁶. Ein weiterer wichtiger Schritt für eine hohe Klonierungseffizienz ist die Verwendung von so wen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA ladder	FroggaBio	DM015-R500	DNA molecular weight marker
AccuReady M Single Channel 0.5-10 µL	Bulldog Bio	BPP020	Pipettes for transferring liquid
AccuReady M Single Channel Pipettor Kit	Bulldog Bio	BPK100	Pipettes for transferring liquid
Agar	BioShop Canada	AGR003.1	Solidifying agent for growth medium
Agarose	Biobasic	D0012	Make agarose gels for DNA electrophoresis
Biometra TOne	Analytikjena	846-2-070-301	Thermocycler
Caps for glass culture tubes	Fisher Scientific	14-957-91	Reusable caps for glass culture tubes
DNA primers	Integrated DNA Technologies	N/A	Bind and amplify template DNA in PCR reaction
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Cleave methylated template DNA following PCR amplification
EcoRI	New England Biolabs	R3101L	Restriction enzyme, comes with appropriate buffer
Eppendorf microtubes 1.5 mL	Sarstedt	72.690.300	Microtube, 1.5 mL, conical base, PP, attached flat cap, molded graduations and frosted writing space
Ethidium bromide	Fisher Scientific	AAL0748203	DNA visualization/intercalating agent, toxic
EZ-10 Spin Column Plasmid DNA Miniprep Kit	Biobasic	BS614	Isolate plasmid DNA from overnight bacterial cultures
GelDoc Go-Gel system	Bio-Rad	12009077	Imaging DNA gels
Glass culture tubes	Fisher Scientific	14-925E	Glass culture tubes
myGel Mini Electrophoresis System	Sigma-Aldrich	Z742288	System used for gel electrophoresis
NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	Determine DNA concentration
PCR Clean Up for DNA Sequencing	Biobasic	BT5100	Purify PCR products
Petri dish	Sarstedt	82.1473.011	Petri dish 92 x 16 mm, PS, transparent, with ventilation cams
Pipette tip, 1000 µL	Sarstedt	70.305	Pipette tips for 100-1000 µL
Pipette tip, 2.5 µL	Sarstedt	70.3010.265	Pipette tips for up to 2.5 µL
Pipette tip, 20 µL	Sarstedt	70.3020.200	Pipette tips for up to 20 µL
Pipette tip, 200 µL	Sarstedt	70.3030.020	Pipette tips for 1-200 µL
Salt (NaCl)	Fisher Scientific	S271-10	Component of bacterial growth medium (10 g/L)
Single 0.2 mL PCR tubes with flat cap	FroggaBio	TF-1000	PCR tubes
Tryptone (Bacteriological)	BioShop Canada	TRP402.5	Component of bacterial growth medium (10 g/L)
VeriFi DNA polymerase	PCR Biosystems	PB10.42-01	High fidelity polymerase, the PCR buffer containing Mg2+ and dNTPs is provided with purchase
Xba I	New England Biolabs	R0145S	Restriction enzyme, comes with appropriate buffer
Yeast extract	BioShop Canada	YEX401.205	Component of bacterial growth medium (5 g/L)