Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

İn vivo montaj, DNA parçalarını homolog rekombinasyon yoluyla birleştirmek için bakterilerdeki içsel DNA onarım enzimlerine dayanan, ligasyondan bağımsız bir klonlama yöntemidir. Bu protokol hem zaman hem de maliyet etkindir, çünkü az sayıda reaktif gereklidir ve klonlama verimliliği %99'a kadar çıkabilir.

Özet

İn vivo montaj (IVA), plazmitleri birleştirmek için DNA fragmanlarının moleküller arası rekombinasyonunu destekleyen bakterilerde bulunan içsel enzimleri kullanan bir moleküler klonlama yöntemidir. Bu yöntem, 15-50 bp homoloji bölgelerine sahip DNA fragmanlarını yaygın olarak kullanılan laboratuvar Escherichia coli suşlarına dönüştürerek işlev görür ve bakteriler, DNA fragmanlarını bir plazmide birleştirmek için RecA'dan bağımsız onarım yolunu kullanır. Bu yöntem, E. coli suşlarına dönüşmeden önce plazmitlerin in vitro montajına dayanan birçok moleküler klonlama yönteminden daha hızlı ve uygun maliyetlidir. Bunun nedeni, in vitro yöntemlerin özel enzimlerin satın alınmasını ve inkübasyon gerektiren sıralı enzimatik reaksiyonların performansını gerektirmesidir. Bununla birlikte, in vitro yöntemlerin aksine, IVA'nın deneysel olarak doğrusal plazmitleri bir araya getirdiği gösterilmemiştir. Burada, farklı replikasyon kökenlerine ve antibiyotik direnç belirteçlerine sahip plazmitler arasında plazmitleri ve alt klon DNA fragmanlarını hızlı bir şekilde birleştirmek için laboratuvarımız tarafından kullanılan IVA protokolünü paylaşıyoruz.

Giriş

Moleküler klonlama, spesifik rekombinant DNA1 içeren plazmitleri üretmek için gereken bir dizi laboratuvar tekniğini kapsar. Bu her yerde bulunan teknikler genellikle deneysel iş akışında bir darboğaz görevi görür2. Birçok moleküler klonlama tekniği, amplifikasyon 3,4,5,6,7 için bir konakçı suşuna (örneğin, Escherichia coli DH5a) dönüştürülmeden önce bir dizi enzimatik reaksiyon kullanılarak in vitro DNA fragmanlarının birleştirilmesine dayanır. İn vitro plazmit montaj yöntemleri enzimlere dayandığından, enzimlerin satın alınması veya saflaştırılması hem maliyetli hem de zaman alıcı olabilir.

İn vivo montaj (IVA), uygun birkonakta DNA fragmanlarının moleküller arası rekombinasyonuna dayanan bir moleküler klonlama yöntemidir 8,9,10,11,12. Bu yöntemin temeli, E. coli'nin yaygın olarak kullanılan recA-klonlama suşlarının, tek sarmallı bir primerin restriksiyon enzimleri13 tarafından bölünmüş bir plazmit ile moleküller arası rekombinasyonuna aracılık edebileceğinin gözlemiydi. E. coli'de plazmit montajı için homolog DNA uçları oluşturmak için PCR kullanımı 1990'larda tanımlanmış ve bu yöntem rekombinasyon PCR 3,14 olarak adlandırılmıştır. Rekombinasyon PCR'nin etkinliği yaklaşık %50 olarak bildirilmiştir14. Bununla birlikte, bu yöntem, muhtemelen primerlerin yüksek maliyeti ve büyük DNA parçalarını çoğaltmak için düşük kaliteli polimerazlar kullanarak istenmeyen mutasyonların ortaya çıkma riski nedeniyle yaygın olarak benimsenmedi. Bu dezavantajlar 1990'larda önemliydi ve restriksiyon enzim aracılı klonlama gibi in vitro klonlama yöntemleri kullanılarak önlenebilirdi.

Son yıllarda, primerlerin maliyeti azalmış ve yeni ticari polimerazlar PCR amplifikasyonunun doğruluğunu artırmıştır. Sonuç olarak, rekombinasyon PCR, hızlı ve uygun maliyetli bir moleküler klonlama tekniği olarak yeniden gözden geçirildi ve IVA 2,9,15,16 olarak yeniden markalandı. Artan fizibilite ile IVA daha fazla araştırıldı ve yöntem, %99'a varan klonlama verimliliğine ulaşmak için optimize edildi16. Optimizasyonlar, in vivo rekombinasyon verimliliğini en üst düzeye çıkaran baz çiftlerinin sayısı ve erime sıcaklığı gibi homolog DNA'nın özelliklerini tanımladı 2,16. Daha ileri analizler, 150 bp ila 7 kbp arasında değişen 6 adede kadar DNA parçasının IVA15 ile verimli bir şekilde birleştirilebileceğini gösterdi. Ek olarak, grubumuz yakın zamanda farklı antibiyotik direnç kasetlerine ve replikasyonkökenlerine sahip bir plazmit serisini birleştirmek için IVA'yı kullandı 17. Bu çalışmada, IVA klonlama, her plazmit için test edilen az sayıda klon ile oldukça verimliydi (%71-100)17. Burada laboratuvarımız tarafından kullanılan IVA protokolünü açıklıyoruz.

Protokol

1. Homolog uçlu primerler veya DNA parçaları tasarlayın

  1. İstenen plazmidi yapay olarak bir araya getirmek için bir kelime işlemci yazılımı veya özel DNA analiz yazılımı kullanın.
    NOT: Farklı kaynaklardan gelen DNA parçalarını renk kodlaması yapmak ve sonraki montaj adımlarında kullanılacak homolog bölgeleri vurgulamak genellikle yararlıdır. Ek olarak, yönlü montajı sağlamak için homolog DNA'yı renk kodlaması da yararlıdır.
  2. Her DNA fragmanına bağlanan ve homolog DNA dizisinin 15-50 bp'sini içeren primerler tasarlayın (Şekil 1)2,15.
    1. IVA verimliliğini artırmak için, homolog DNA fragmanlarının 47-52 °C2 erime sıcaklıklarına sahip olduğundan emin olun.
      NOT: Erime sıcaklığı, çevrimiçi yazılım18 veya aşağıdaki formül kullanılarak belirlenebilir: Erime sıcaklığı = 64.9 + 41 * (nG + nC - 16.4)/(nA + nT + nG + nC), burada n = dizideki G, C, A veya T sayısı 6,19.
    2. Kararsızlığa neden olabileceğinden, bir HIS etiketini kodlayan CATCATCATCATCATCAT gibi çok tekrarlayan dizilere sahip primerlerden kaçının20. Bir poli-HIS etiketi eklemek gibi uygulamalar için son bir tekrarlayan amino asit dizisi gerekiyorsa, nükleik asit dizisi tekrarını azaltmak için CATCACCATCATCACCAC gibi alternatif kodonlar kullanın.
      NOT: Astarlar tercih edilen herhangi bir satıcıdan sipariş edilebilir. DNA fragmanları sentezlenecekse, homolog uçlar sentezlenen DNA fragmanına dahil edilmelidir.

2. Homolog uçlar içeren DNA ürünlerinin amplifikasyonu

  1. Plazmid DNA'yı veya genomik DNA şablonlarını, ticari olarak temin edilebilen standart DNA izolasyon kitleri veya alkalin lizis 6,17 kullanarak izole edin.
  2. Ticari olarak temin edilebilen yüksek kaliteli bir polimeraz ile bir PCR reaksiyonunda şablon DNA (adım 2.1'den itibaren) ve homolog bölgeler (adım 1.2) içeren primerleri kullanın. Aşağı akış reaksiyonlarında DNA şablonu taşınmasını sınırlamak için, her reaksiyonda düşük miktarda şablon DNA (20 pg-1 ng) kullanın. Enzime özgü PCR reaksiyon karışımı bileşenleri ve önerilen PCR döngü koşulları için üreticinin tavsiyelerine bakın. PCR reaksiyonuna devam edin.
    1. Şekil 2'de gösterilen DNA fragmanlarını 100 μM dNTP, her DNA primerinden 0.2 μM, şablon DNA (50 pg pSU19 ve 1 ng pSU18mCherry), Mg2+ (2 mM nihai konsantrasyon) ve 1 U yüksek kaliteli DNA polimeraz içeren 1x PCR reaksiyon tampon karışımı.
    2. pSU19 ve mCherry'yi yükseltmek için bir touchdown PCR döngü programı kullanın (Şekil 2). İlk denatürasyon adımını 5 dakika boyunca 95 ° C'de, ardından 15 saniye boyunca 95 ° C'lik 10 döngü, 15 saniye boyunca döngü başına 55 ° C-0.5 ° C ve 1 dakika boyunca 72 ° C'ye ayarlayın ve ardından 15 saniye boyunca 95 ° C, 15 saniye boyunca 50 ° C ve 1 dakika boyunca 72 ° C'lik 20 ek döngü. PCR döngüsünü 72 °C'de 10 dakika boyunca son bir uzatma adımıyla tamamlayın.
      NOT: Bir plazmit omurgası amplifiye edilecekse, DNA şablonunun miktarını moleküler ağırlığa göre ayarlayın: 50 μL PCR reaksiyonu başına ~ 20 pg/1 kbp plazmit DNA ile (pSU19 için 50 pg DNA (gösterilmiştir)). Ek olarak, amplifikasyon sırasında ortaya çıkan mutasyon sayısını en aza indirmek için PCR döngülerini ayarlayın: plazmit omurgalarının amplifikasyonu için 20-25 kadar az PCR döngüsü yeterlidir.
  3. PCR reaksiyonu tamamlandıktan sonra, PCR reaksiyonunun bir alikotunu (2 μL) çıkarın, yükleme boyası (1x konsantrasyona kadar) ile birleştirin ve DNA fragmanlarını agaroz jel elektroforezi21 ile ayırın. Agaroz jeli içinde göç etmiş DNA parçalarını görselleştirmek için bir ultraviyole (UV) veya LED transilluminatör kullanın. PCR ürünlerinin benzersiz olup olmadığını belirleyin ve beklenen moleküler ağırlık olup olmadıklarını kontrol etmek için ürünleri DNA merdiveni ile karşılaştırın (Şekil 2). Doğru moleküler ağırlığa sahip hiçbir PCR ürünü görselleştirilmemişse, PCR reaksiyonunu optimize etmek için üreticinin tavsiyelerine bakın.
    NOT: PCR ürünleri benzersiz olmadığında, ancak beklenen moleküler ağırlığa karşılık gelen bol miktarda DNA fragmanı olduğunda, ek bir PCR reaksiyonundan kaçınılabilir.
  4. Agaroz jelinde birden fazla DNA fragmanı varsa, agaroz jelden beklenen moleküler ağırlığa karşılık gelen DNA fragmanını kesin ve DNA fragmanını geri kazanmak için bir agaroz jel ekstraksiyon kiti kullanın.
  5. Metillenmiş şablon DNA'yı PCR reaksiyonlarından çıkarmak için, doğrudan reaksiyon tüpüne 1 μL DpnI ekleyin. Reaksiyonları 37 ° C'de 15 dakika ila gece boyunca inkübe edin.
    NOT: Bu isteğe bağlı adım, aşağı akış reaksiyonlarında ileriye taşınan şablon DNA miktarını sınırlamak için şiddetle tavsiye edilir. Bununla birlikte, PCR reaksiyonunda çok düşük konsantrasyonlarda şablon DNA kullanılırsa bu adım atlanabilir.
  6. Enzimatik tahlillerden kaynaklanan kalıntı enzimleri, tuzları, primer dimerleri ve diğer istenmeyen düşük moleküler DNA ürünlerini çıkarmak için bir nükleik asit saflaştırma kiti kullanın.
    NOT: DNA parçaları sentezlenirse 2.1-2.6 adımları atlanabilir.
  7. Saflaştırılmış DNA parçalarının DNA konsantrasyonunu spektrofotometri veya jel tahmini ile ölçün.

3. IVA (Şekil 3)

  1. Her IVA reaksiyonu için gereken DNA miktarını hesaplayın (25-50 ng plazmit DNA önerilir). Daha yüksek moleküler ağırlığa sahip plazmitler için daha yüksek miktarlarda plazmit DNA kullanın (örneğin, 2.3 kbp'lik plazmitler için 25 ng plazmit kullanın, ancak plazmitler 9 kbp olduğunda, her reaksiyonda 50 ng kullanın). Reaksiyon için gereken insert DNA hacmini hesaplayın; 1:3 veya 1:5 molar plazmit oranı kullanın: DNA'yı yerleştirin.
    NOT: Çevrimiçi biyo hesaplayıcılar veya aşağıda verilen formüller, çift sarmallı bir DNA parçasının molar miktarını hesaplamak ve her bir DNA parçasının molar oranını belirlemek için kullanılabilir.
    Çift sarmallı bir DNA parçasının molar miktarını hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanırız: pmol = (ng cinsinden ağırlık) × 1.000 / (baz çiftleri × 650 dalton). Ek olarak, molar oranlar şu şekilde hesaplanabilir: kütle eki (g) = istenen ek/plazmit molar oranı × plazmit kütlesi (g) × ekin plazmit uzunluklarına oranı6.
  2. Hesaplanan plazmit hacmini birleştirin ve DNA'yı önceden soğutulmuş 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve buz üzerinde tutun.
  3. Plazmidi aktarın ve DNA karışımını adım 3.2'den bir alikot (25-100 μL) çözülmüş recA-kimyasal olarak yetkin E. coli (örn. E. coli DH5a;22).
    NOT: Kullanılan yetkin hücrelerin hacmi, plazmidin hacmine ve DNA karışımına bağlıdır; Bu karışım yetkin hücrelerin hacminin% 10'unu geçmemelidir.
  4. Bir ısı şoku dönüşümü ile devam edin23.
    1. Kimyasal olarak yetkin E. coli ve DNA karışımını buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
    2. 1 dakika boyunca 42 ° C'lik bir su banyosuna aktarın, ardından tüpü 2 dakika boyunca buza aktarın.
    3. Hacmi 1 mL'ye çıkarmak için LB'yi aseptik olarak tüpe aktarın.
    4. 1 mL hacmi bir cam kültür tüpüne aktarın ve 37 ° C, 220 rpm veya bakteri suşu ve / veya plazmitin iyileşmesi için önerilen sıcaklığa (tipik aralık 25 ° C-37 ° C) ayarlanmış bir çalkalama inkübatörüne yerleştirin ve plazmid kodlu antibiyotik seçim markörünün üretilmesine izin verin.
  5. Hücreler 30 dakika ila 1 saat boyunca iyileştikten sonra, transformasyon reaksiyonunun bir alikotunu (100 μL 1.000 μL) katı seçim ortamına bırakın ve alikotu agar kültür plakası boyunca dağıtmak için steril bir hücre yayıcı kullanın. Dönüştürülmüş hücrelerin geri kalanını santrifüjleme ile toplayın (1 dakika boyunca 13.000 × g ), süpernatanı atın, hücre peletini 100 μL steril ortamda yeniden süspanse edin ve yukarıdaki gibi katı seçim ortamına bırakın. Sıvının 30 dakika boyunca katı ortama emilmesine izin verin, kültür plakalarını ters çevirin. ve bunları bakteri suşu ve/veya plazmid için önerilen sıcaklıkta gece boyunca bir inkübatöre koyun.

4. Doğru plazmit montajı için tarama

  1. İnkübasyondan sonra (adım 3.5), kültür plakalarını inkübatörden çıkarın ve her bir kültür plakasında birkaç izole bakteri kolonisi varsa, kolonileri doğrudan sayarak numaralandırın. İstenen birleştirilmiş plazmidi içerip içermediklerini belirlemek için tarama için birkaç koloni (1-10) seçin.
    1. Uygun antibiyotiklerle desteklenmiş steril büyüme ortamını steril kültür tüplerine (cam veya plastik) aktarın. Steril bir transfer iğnesi veya halkası ile 1 koloniye dokunarak kültür ortamını aşılayın ve hücreleri transfer iğnesi ile kültür tüpü ortamına aktarın. Kültür tüplerini çalkalanan bir inkübatöre yerleştirin ve bakteri suşu ve/veya plazmit için önerilen sıcaklıkta (tipik aralık 25 °C ila 37 °C) 16-18 saat inkübe edin.
  2. Ertesi gün, plazmid DNA'yı bakteri kültürlerinden alkalin lizis6 ile veya üreticinin talimatlarına göre ticari olarak temin edilebilen bir plazmit izolasyon kiti kullanarak izole edin.
  3. Plazmitlerin doğru şekilde monte edilip edilmediğini belirleyin.
    1. İzole edilen plazmitlerin DNA konsantrasyonunu spektrofotometri veya jel tahmini ile ölçün.
    2. Tanısal kısıtlama sindirim reaksiyonu (10 μL nihai hacim) için bir alikot (50-150 ng) plazmit DNA kullanın. Birleştirilmiş plazmit DNA'yı parçalamaları beklenen yere göre kısıtlama enzimlerini seçin.
      NOT: İki ayrı reaksiyon öneriyoruz: (1) plazmit DNA'nın plazmiti tek bir bölgede parçalaması beklenen bir kısıtlama enzimi ile muamele edilmesi ve (2) plazmit DNA'nın eklenen DNA parçasının tamamını veya bir kısmını eksize etmesi beklenen iki kısıtlama enzimi ile muamele edilmesi. Restriksiyon enzimleri ticari olarak temin edilebilir ve üreticinin talimatlarına göre kullanılmalıdır.
    3. Restriksiyon enzimi reaksiyonu tamamlandıktan sonra, yükleme boyası (1x konsantrasyona kadar) ile birleştirin, tüm karışımı bir agaroz jel üzerine yükleyin ve DNA fragmanlarını agaroz jel elektroforezi21 ile ayırın. Agaroz jeli içinde göç eden DNA parçalarını görselleştirmek için bir UV veya LED transilluminatör kullanın. Beklenen moleküler ağırlık(lar) olup olmadıklarını belirlemek için kısıtlı DNA fragmanlarını moleküler ağırlık merdiveni ile karşılaştırın (Şekil 4). Beklenen enzim kısıtlama modellerine ( pozitif klonlar olarak adlandırılır) sahip plazmitleri not edin; Beklenen kısıtlama modeline sahip olmayan ( negatif klonlar olarak adlandırılır) plazmitleri içeren tüpleri atın.
  4. Pozitif klonların beklenen nükleotid dizisine sahip olduğundan emin olmak için, dizileme için bir dizi pozitif plazmit klonu gönderin.
    NOT: Tüm plazmit dizilimi önerilir (ör., nanopor dizilimi).

Sonuçlar

Bu el yazmasında, IVA kullanımına bir örnek olarak, pSU19mCherry ile aynı plazmit oluşturmak için mCherry açık okuma çerçevesini pSU19'un çoklu klonlama bölgesine yeniden klonlamak için sağlanan IVA iş akışını takip ettik (Şekil 3)17. IVA'ya uygun primerler, protokol adımları 1.1 ve 1.2'ye göre tasarlanmıştır. Daha sonra, sırasıyla plazmit omurgasını amplifiye etmek ve DNA'yı eklemek için PCR reaksiyon...

Tartışmalar

Başarılı bir IVA klonlaması için en kritik adım DNA fragmanı ve primer tasarımıdır. Homolog fragmanlar, yaklaşık 47-52 ° C'lik bir erime sıcaklığı ile en az 15 bp uzunluğunda olacak şekilde tasarlandığında IVA verimliliği büyük ölçüde iyileştirilir. IVA parça tasarımının optimizasyonunu araştıran ayrıntılı bir çalışma yayınlanmıştır16. Yüksek klonlama verimliliğine sahip olmanın bir diğer önemli adımı, PCR ampli...

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

HGB, Kanada Lisansüstü Bursları - Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi'nden (NSERC) yüksek lisans programı ve bir Dekan Doktora Ödülü (Saskatchewan Üniversitesi) tarafından finanse edilmektedir. Bu çalışma, bir NSERC Keşif Hibesi (RGPIN-2021-03066), Saskatchewan Üniversitesi'nden başlangıç fonları (JLT'ye) ve Kanada İnovasyon Vakfı John R. Evans Liderler Fonu (JLT'ye hibe numarası 42269) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, UV spektroskopisi ile DNA nicelemesinin fotoğrafını sağladığı için Bay Eric Toombs'a teşekkür eder.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb Plus DNA ladderFroggaBioDM015-R500DNA molecular weight marker
AccuReady M Single Channel 0.5-10 µLBulldog BioBPP020Pipettes for transferring liquid
AccuReady M Single Channel Pipettor KitBulldog BioBPK100Pipettes for transferring liquid
AgarBioShop CanadaAGR003.1Solidifying agent for growth medium
AgaroseBiobasicD0012Make agarose gels for DNA electrophoresis
Biometra TOne Analytikjena846-2-070-301Thermocycler
Caps for glass culture tubesFisher Scientific14-957-91Reusable caps for glass culture tubes
DNA primersIntegrated DNA TechnologiesN/ABind and amplify template DNA in PCR reaction
DpnI New England BiolabsR0176SCleave methylated template DNA following PCR amplification
EcoRINew England BiolabsR3101LRestriction enzyme, comes with appropriate buffer
Eppendorf microtubes 1.5 mLSarstedt72.690.300Microtube, 1.5 mL, conical base, PP, attached flat cap, molded graduations and frosted writing space
Ethidium bromideFisher ScientificAAL0748203DNA visualization/intercalating agent, toxic
EZ-10 Spin Column Plasmid DNA Miniprep KitBiobasicBS614Isolate plasmid DNA from overnight bacterial cultures
GelDoc Go-Gel systemBio-Rad12009077Imaging DNA gels
Glass culture tubesFisher Scientific14-925EGlass culture tubes
myGel Mini Electrophoresis SystemSigma-AldrichZ742288System used for gel electrophoresis
NanoDrop OneThermo FisherND-ONE-WDetermine DNA concentration
PCR Clean Up for DNA SequencingBiobasicBT5100Purify PCR products 
Petri dishSarstedt82.1473.011Petri dish 92 x 16 mm, PS, transparent, with ventilation cams
Pipette tip, 1000 µLSarstedt70.305Pipette tips for 100-1000 µL
Pipette tip, 2.5 µLSarstedt70.3010.265Pipette tips for up to 2.5 µL
Pipette tip, 20 µLSarstedt70.3020.200Pipette tips for up to 20 µL
Pipette tip, 200 µLSarstedt70.3030.020Pipette tips for 1-200 µL
Salt (NaCl)Fisher ScientificS271-10Component of bacterial growth medium (10 g/L)
Single 0.2 mL PCR tubes with flat capFroggaBioTF-1000PCR tubes
Tryptone (Bacteriological)BioShop CanadaTRP402.5Component of bacterial growth medium (10 g/L)
VeriFi DNA polymerasePCR BiosystemsPB10.42-01High fidelity polymerase, the PCR buffer containing Mg2+ and dNTPs is provided with purchase
Xba INew England BiolabsR0145SRestriction enzyme, comes with appropriate buffer
Yeast extractBioShop CanadaYEX401.205Component of bacterial growth medium (5 g/L)

Referanslar

  1. Bertero, A., Brown, S., Vallier, L. Methods of cloning. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Chapter 2, 19-39 (2017).
  2. Garcia-Nafria, J., Watson, J. F., Greger, I. H. IVA cloning: A single-tube universal cloning system exploiting bacterial in vivo assembly. Sci Rep. 6, 27459 (2016).
  3. Bubeck, P., Winkler, M., Bautsch, W. Rapid cloning by homologous recombination in vivo. Nucleic Acids Res. 21 (15), 3601-3602 (1993).
  4. Avilan, L. Assembling multiple fragments: the Gibson assembly. Methods Mol Biol. 2633, 45-53 (2023).
  5. Stukenberg, D., et al. The Marburg Collection: A Golden Gate DNA assembly framework for synthetic biology applications in Vibrio natriegens. ACS Synth Biol. 10 (8), 1904-1919 (2021).
  6. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).
  7. Engler, C., Marillonnet, S. Golden Gate cloning. Methods Mol Biol. 1116, 119-131 (2014).
  8. Ma, H., Kunes, S., Schatz, P. J., Botstein, D. Plasmid construction by homologous recombination in yeast. Gene. 58 (2-3), 201-216 (1987).
  9. Cao, P., Wang, L., Zhou, G., Wang, Y., Chen, Y. Rapid assembly of multiple DNA fragments through direct transformation of PCR products into E. coli and Lactobacillus. Plasmid. 76, 40-46 (2014).
  10. Conley, E. C., Saunders, V. A., Saunders, J. R. Deletion and rearrangement of plasmid DNA during transformation of Escherichia coli with linear plasmid molecules. Nucleic Acids Res. 14 (22), 8905-8917 (1986).
  11. Conley, E. C., Saunders, V. A., Jackson, V., Saunders, J. R. Mechanism of intramolecular recyclization and deletion formation following transformation of Escherichia coli with linearized plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 14 (22), 8919-8932 (1986).
  12. Sung, W. L., Zahab, D. M. Site-specific recombination directed by single-stranded crossover linkers: specific deletion of the amino-terminal region of the beta-galactosidase gene in pUC plasmids. DNA. 6 (4), 373-379 (1987).
  13. Mandecki, W. Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 83 (19), 7177-7181 (1986).
  14. Jones, D. H., Howard, B. H. A rapid method for recombination and site-specific mutagenesis by placing homologous ends on DNA using polymerase chain reaction. Biotechniques. 10 (1), 62-66 (1991).
  15. Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5alpha-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), e0137466 (2015).
  16. Chen, F., et al. Simplified plasmid cloning with a universal MCS design and bacterial in vivo assembly. BMC Biotechnol. 21 (1), 24 (2021).
  17. Braun, H. G., Kanwal, N., Rivera Lopez, L. F., Thomassin, J. L. Generation of a plasmid series for rapid sub-cloning and use in various Enterobacteriaceae. J Biosci Bioeng. 138 (6), 478-487 (2024).
  18. Kibbe, W. A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Res. 35 (Web Server issue), W43-W46 (2007).
  19. Wallace, R. B., et al. Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch. Nucleic Acids Res. 6 (11), 3543-3557 (1979).
  20. Bzymek, M., Lovett, S. T. Instability of repetitive DNA sequences: The role of replication in multiple mechanisms. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (15), 8319-8325 (2001).
  21. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  22. Sambrook, J., Russell, D. W. The inoue method for preparation and transformation of competent E. coli: "ultra-competent" cells. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  23. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  24. Fürste, J. P., et al. Molecular cloning of the plasmid RP4 primase region in a multi-host-range tacP expression vector. Gene. 48 (1), 119-131 (1986).
  25. Bäumler, A. J., et al. Identification of a new iron regulated locus of Salmonella typhi. Gene. 183 (1-2), 207-213 (1996).
  26. Godiska, R., et al. Linear plasmid vector for cloning of repetitive or unstable sequences in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 38 (6), e88 (2010).
  27. Watson, J. F., Garcia-Nafria, J. In vivo DNA assembly using common laboratory bacteria: A re-emerging tool to simplify molecular cloning. J Biol Chem. 294 (42), 15271-15281 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

In Vivo MontajIVAMolek ler KlonlamaPlazmit Yap mDNA FragmanlarEscherichia ColiRecA dan Ba ms z Onar mMaliyet Etkin Y ntemlerAlt KlonlamaAntibiyotik Diren Belirte leriMontaj Protokol

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır