שימוש במכלול In Vivo לבניית פלסמיד ביעילות גבוהה

Summary

הרכבה in vivo היא שיטת שיבוט בלתי תלויה בקשירה המסתמכת על אנזימי תיקון DNA פנימיים בחיידקים כדי להרכיב שברי DNA על ידי רקומבינציה הומולוגית. פרוטוקול זה הוא גם חסכוני בזמן וגם בעלות יתר, מכיוון שנדרשים מעט ריאגנטים, ויעילות השיבוט יכולה להגיע עד 99%.

Abstract

הרכבה in vivo (IVA) היא שיטת שיבוט מולקולרית המשתמשת באנזימים פנימיים הקיימים בחיידקים המקדמים רקומבינציה בין-מולקולרית של שברי DNA להרכבת פלסמידים. שיטה זו מתפקדת על ידי הפיכת שברי DNA עם אזורים של 15-50 bp של הומולוגיה לזני Escherichia coli מעבדה נפוצים והחיידקים משתמשים במסלול התיקון הבלתי תלוי ב-RecA כדי להרכיב את שברי ה-DNA לפלסמיד. שיטה זו מהירה וחסכונית יותר משיטות שיבוט מולקולאריות רבות המסתמכות על הרכבה חוץ גופית של פלסמידים לפני הפיכתם לזני E. coli . הסיבה לכך היא ששיטות במבחנה דורשות רכישה של אנזימים מיוחדים וביצוע תגובות אנזימטיות עוקבות הדורשות דגירה. עם זאת, בניגוד לשיטות מבחנה , IVA לא הוכח בניסוי כמרכיב פלסמידים ליניאריים. כאן אנו חולקים את פרוטוקול IVA המשמש את המעבדה שלנו להרכבה מהירה של פלסמידים ושברי DNA תת-שיבוט בין פלסמידים עם מקורות שונים של שכפול וסמני עמידות לאנטיביוטיקה.

Introduction

שיבוט מולקולרי מקיף סדרה של טכניקות מעבדה הדרושות לייצור פלסמידים המכילים DNA רקומביננטי^{ספציפי 1}. טכניקות אלה בכל מקום פועלות לעתים קרובות כצוואר בקבוק בזרימת העבודה הניסיונית². טכניקות שיבוט מולקולאריות רבות מסתמכות על הרכבה של שברי DNA במבחנה באמצעות סדרה של תגובות אנזימטיות לפני הפיכתם לזן מארח (למשל, Escherichia coli DH5a) להגברה 3,4,5,6,7. מכיוון ששיטות הרכבת פלסמיד במבחנה מסתמכות על אנזימים, רכישה או טיהור של אנזימים יכולים להיות יקרים וגוזלים זמן.

הרכבה in vivo (IVA) היא שיטת שיבוט מולקולרית המסתמכת על רקומבינציה בין-מולקולרית של שברי DNA במארח מתאים 8,9,10,11,12. הבסיס לשיטה זו היה התצפית כי זני ^שיבוט נפוצים של E. coli יכולים לתווך רקומבינציה בין-מולקולרית של פריימר חד-גדילי עם פלסמיד שנבקע על ידי אנזימי הגבלה¹³. השימוש ב-PCR ליצירת קצוות DNA הומולוגיים להרכבת פלסמיד ב-E. coli תואר בשנות ה-90 ושיטה זו נקראה רקומבינציה PCR ^3,14. היעילות של PCR רקומבינציה דווחה כ-50%¹⁴. עם זאת, שיטה זו לא אומצה באופן נרחב, ככל הנראה בשל העלות הגבוהה של פריימרים והסיכון להכנסת מוטציות לא רצויות באמצעות פולימראזות בנאמנות נמוכה כדי להגביר שברי DNA גדולים. חסרונות אלה היו משמעותיים בשנות ה-90 וניתן היה להימנע מהם על ידי שימוש בשיטות שיבוט חוץ גופיות כגון שיבוט בתיווך אנזימי הגבלה.

בשנים האחרונות עלות הפריימרים ירדה, ופולימראזים מסחריים חדשים הגדילו את הנאמנות של הגברת PCR. כתוצאה מכך, PCR רקומבינציה נבדק מחדש כטכניקת שיבוט מולקולרית מהירה וחסכונית ומותג מחדש כ-IVA 2,9,15,16. עם היתכנות מוגברת, IVA נחקרה עוד יותר, והשיטה עברה אופטימיזציה כדי להגיע ליעילות שיבוט של עד 99%¹⁶. אופטימיזציות זיהו מאפיינים של DNA הומולוגי, כגון מספר זוגות בסיסים וטמפרטורת התכה, הממקסמים את יעילות הרקומבינציה in vivo ^2,16. ניתוח נוסף הראה כי ניתן להרכיב ביעילות עד 6 מקטעי DNA הנעים בין 150 bp ל-7 kbp על ידי IVA¹⁵. בנוסף, הקבוצה שלנו השתמשה לאחרונה ב-IVA כדי להרכיב סדרת פלסמיד עם קלטות עמידות שונות לאנטיביוטיקה ומקורות השכפול¹⁷. במחקר זה, שיבוט IVA היה יעיל ביותר (71-100%) עם מספר קטן של שיבוטים שנבדקו עבור כל פלסמיד (n = 2)¹⁷. כאן אנו מתארים את פרוטוקול ה-IVA המשמש את המעבדה שלנו.

Protocol

1. תכנן פריימרים או שברי DNA עם קצוות הומולוגיים

1. השתמש בתוכנת עיבוד תמלילים או בתוכנת ניתוח DNA מיוחדת כדי להרכיב באופן מלאכותי את הפלסמיד הרצוי.
   הערה: לעתים קרובות מועיל לקודד בצבע מקטעי DNA ממקורות שונים ולהדגיש אזורים הומולוגיים שישמשו בשלבי הרכבה במורד הזרם. בנוסף, זה גם מועיל לקודד DNA הומולוגי בצבע כדי להבטיח הרכבה כיוונית.
2. תכנן פריימרים הנקשרים לכל מקטע DNA ומכילים 15-50 bp מרצף ה-DNA ההומולוגי (איור 1)^2,15.
   1. ליעילות מוגברת של IVA, ודא שלמקטעי DNA הומולוגיים יש טמפרטורות התכה של 47-52 מעלות צלזיוס².
      הערה: ניתן לקבוע את טמפרטורת ההיתוך באמצעות תוכנה מקוונת¹⁸ או הנוסחה: טמפרטורת התכה = 64.9 + 41 * (nG + nC - 16.4)/(nA + nT + nG + nC), כאשר n = מספר G, C, A או T ברצף ^6,19.
   2. הימנע מפריימרים עם רצפים שחוזרים על עצמם כמו CATCATCATCATCATCATCAT המקודדים לתג HIS מכיוון שהם יכולים להציג חוסר יציבות²⁰. אם יש צורך ברצף חומצות אמינו חוזר סופי ליישומים כמו הכנסת תג poly-HES, השתמש בקודונים חלופיים כמו CATCACCATCATCACCAC כדי להפחית את החזרה על רצף חומצות הגרעין.
      הערה: ניתן להזמין פריימרים מכל ספק מועדף. אם עומדים לסנתז שברי DNA, יש לשלב קצוות הומולוגיים בשבר ה-DNA המסונתז.

2. הגברה של מוצרי DNA המכילים קצוות הומולוגיים

1. לבודד DNA פלסמיד או תבניות DNA גנומיות באמצעות ערכות בידוד DNA סטנדרטיות זמינות מסחרית או ליזה אלקליין ^6,17.
2. השתמש בתבנית DNA (משלב 2.1) ובפריימרים המכילים אזורים הומולוגיים (שלב 1.2) בתגובת PCR עם פולימראז זמין מסחרית בנאמנות גבוהה. כדי להגביל את העברת תבנית ה-DNA בתגובות במורד הזרם, השתמש בכמות נמוכה של תבנית DNA (20 pg-1 ng) בכל תגובה. עיין בהמלצות היצרן עבור רכיבי תערובת תגובת PCR ספציפיים לאנזים ותנאי מחזור PCR מומלצים. המשך עם תגובת ה-PCR.
   1. הגדר את תגובות ה-PCR (50 מיקרוליטר) כדי להגביר את מקטעי ה-DNA המוצגים באיור 2 כך שיכילו 100 מיקרומטר של dNTPs, 0.2 מיקרומטר מכל פריימר DNA, תבנית DNA (50 pg של pSU19 ו-1 ng של pSU18mCherry), תערובת חיץ תגובת PCR 1x המכילה Mg²⁺ (ריכוז סופי של 2 מ"מ), ו-1 U של DNA פולימראז בנאמנות גבוהה.
   2. השתמש בתוכנית רכיבה על אופניים PCR למגע כדי להגביר את pSU19 ו-mCherry (איור 2). הגדר את שלב הדנטורציה הראשוני ל-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואחריו 10 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 55 מעלות צלזיוס -0.5 מעלות צלזיוס למחזור למשך 15 שניות, ו-72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ולאחר מכן, 20 מחזורים נוספים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 50 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. השלם את מחזור ה-PCR עם שלב הארכה אחרון ב-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
      הערה: אם יש להגביר עמוד שדרה של פלסמיד, התאם את כמות תבנית ה-DNA על סמך המשקל המולקולרי: עם ~20 pg/1 kbp של DNA פלסמיד לכל 50 מיקרוליטר של תגובת PCR (50 pg של DNA עבור pSU19 (מוצג)). בנוסף, התאם את מחזורי ה-PCR כדי למזער את מספר המוטציות שהוכנסו במהלך ההגברה: להגברה של עמוד השדרה של הפלסמיד מספיקים רק 20-25 מחזורי PCR.
3. לאחר השלמת תגובת ה-PCR, הסר אליקוט (2 מיקרוליטר) של תגובת ה-PCR, שלב עם צבע טעינה (לריכוז פי 1), והפרד שברי DNA על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז²¹. השתמש בטרנס-תאורה אולטרה סגול (UV) או LED כדי לדמיין שברי DNA שהיגרו בג'ל האגרוז. קבעו אם תוצרי PCR הם ייחודיים והשוו מוצרים עם סולם ה-DNA כדי לבדוק אם הם המשקל המולקולרי הצפוי (איור 2). אם לא מוצגים תוצרי PCR במשקל המולקולרי הנכון, עיין בהמלצות היצרן לאופטימיזציה של תגובת ה-PCR.
   הערה: כאשר תוצרי ה-PCR אינם ייחודיים אך יש מקטע DNA בשפע המתאים למשקל המולקולרי הצפוי, ניתן להימנע מתגובת PCR נוספת.
4. אם קיימים מספר שברי DNA בג'ל האגרוז, הסר את שבר ה-DNA המתאים למשקל המולקולרי הצפוי מג'ל האגרוז והשתמש בערכת מיצוי ג'ל אגרוז כדי לשחזר את שבר ה-DNA.
5. כדי להסיר DNA תבנית מתילציה מתגובות ה-PCR, הוסף 1 מיקרוליטר של DpnI ישירות לצינור התגובה. דגרו את התגובות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עד לילה.
   הערה: שלב אופציונלי זה מומלץ מאוד כדי להגביל את כמות ה-DNA של התבנית המועברת קדימה בתגובות במורד הזרם. עם זאת, ניתן לדלג על שלב זה אם משתמשים בריכוזים נמוכים מאוד של תבנית DNA בתגובת ה-PCR.
6. השתמש בערכת טיהור חומצות גרעין כדי להסיר שאריות אנזימים, מלחים, דימרים פריימר ותוצרי DNA מולקולאריים נמוכים לא רצויים אחרים הנובעים מבדיקות אנזימטיות.
   הערה: ניתן לדלג על שלבים 2.1-2.6 אם מקטעי DNA מסונתזים.
7. כמת את ריכוז ה-DNA של שברי ה-DNA המטוהרים על ידי ספקטרופוטומטריה או הערכת ג'ל.

3. IVA (איור 3)

1. חשב את כמות ה-DNA הנדרשת לכל תגובת IVA (מומלץ 25-50 ננוגרם של DNA פלסמיד). השתמש בכמויות גבוהות יותר של DNA פלסמיד עבור פלסמידים בעלי משקל מולקולרי גבוה יותר (למשל, עבור פלסמידים של 2.3 kbp, השתמש ב-25 ננוגרם של פלסמיד, אך כאשר הפלסמידים הם 9 kbp, השתמש ב-50 ננוגרם בכל תגובה). לחשב את נפח ה-DNA הדרוש לתגובה; השתמש ביחס מולרי של 1:3 או 1:5 של פלסמיד: הכנס DNA.
   הערה: ניתן להשתמש במחשבוני ביו מקוונים או בנוסחאות המפורטות להלן כדי לחשב את הכמות המולרית של שבר DNA דו-גדילי ולקבוע את היחס המולרי של כל שבר DNA.
   אנו משתמשים בנוסחה הבאה כדי לחשב את הכמות המולרית של שבר DNA דו-גדילי: pmol = (משקל ב- ng) × 1,000 / (זוגות בסיס × 650 דלטונים). בנוסף, ניתן לחשב יחסים מולאריים על ידי: הכנסת מסה (g) = יחס מולארי רצוי של הכנסה/פלסמיד × מסה של פלסמיד (g) × יחס של הכנסה לאורכי פלסמיד⁶.
2. שלב את הנפח המחושב של הפלסמיד והכנס DNA לצינור מיקרו-צנטריפוגה מקורר מראש של 1.5 מ"ל והשאר על קרח.
3. העבירו את הפלסמיד והכנסו את תערובת ה-DNA משלב 3.2 לתוך אליקוט (25-100 מיקרוליטר) של E. coli מופשר מבחינה ^כימית (למשל E. coli DH5a;²²).
   הערה: נפח התאים המוסמכים המשמשים תלוי בנפח הפלסמיד והכנסת תערובת ה-DNA; תערובת זו לא תעלה על 10% נפח התאים המוכשרים.
4. המשך עם טרנספורמציה של הלם חום²³.
   1. דגרו את התערובת של E. coli ו-DNA בעלי יכולת כימית על קרח למשך 30 דקות.
   2. מעבירים לאמבט מים של 42 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ואז מעבירים את הצינור לקרח למשך 2 דקות.
   3. העבירו אספטית LB לצינור כדי להרכיב את הנפח ל -1 מ"ל.
   4. העבירו את הנפח של 1 מ"ל לצינור תרבית זכוכית והניחו באינקובטור רועד המוגדר ב-37 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד או הטמפרטורה המומלצת להתאוששות זן החיידקים ו/או הפלסמיד (טווח טיפוסי בין 25 מעלות צלזיוס ל-37 מעלות צלזיוס) ולאפשר ייצור של סמן בחירת האנטיביוטיקה המקודד בפלסמיד.
5. לאחר שהתאים התאוששו במשך 30 דקות עד שעה, הפקידו אליקוט (100 מיקרוליטר של 1,000 מיקרוליטר) של תגובת הטרנספורמציה על מצע ברירה מוצק והשתמשו במפזר תאים סטרילי כדי לפזר את האליקוט על פני צלחת תרבית האגר. אסוף את שאר התאים שעברו טרנספורמציה על ידי צנטריפוגה (13,000 × גרם למשך דקה אחת), השליך את הסופרנטנט, השהה מחדש את כדור התא ב-100 מיקרוליטר של מדיה סטרילית, והפקיד על מצע בחירה מוצק כאמור לעיל. אפשר לנוזל להיספג במדיה מוצקה למשך 30 דקות, הפוך את לוחות התרבות. ולהניח אותם בחממה למשך הלילה בטמפרטורה המומלצת לזן החיידקים ו/או הפלסמיד.

4. הקרנה להרכבת פלסמיד נכונה

1. לאחר הדגירה (שלב 3.5), הסר את צלחות התרבות מהחממה וספיר את המושבות על ידי ספירה ישירה אם יש מספר מושבות חיידקים מבודדות על כל צלחת תרבות. בחר מספר מושבות (1-10) להקרנה כדי לקבוע אם הן מכילות את הפלסמיד המורכב הרצוי.
   1. העבירו אמצעי גידול סטריליים בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה לצינורות תרבית סטריליים (זכוכית או פלסטיק). חסנו את אמצעי התרבות על ידי נגיעה במושבה אחת עם מחט העברה סטרילית או לולאה והעבירו את התאים לתוך אמצעי צינור התרבות בעזרת מחט ההעברה. מניחים את צינורות התרבות בחממה רועדת ודוגרים למשך 16-18 שעות בטמפרטורה המומלצת לזן החיידקים ו/או הפלסמיד (טווח אופייני בין 25 מעלות צלזיוס ל-37 מעלות צלזיוס).
2. למחרת, בודד DNA פלסמיד מתרביות החיידקים על ידי ליזה אלקליין⁶ או באמצעות ערכת בידוד פלסמיד זמינה מסחרית בהתאם להוראות היצרן.
3. קבע אם הפלסמידים מורכבים כהלכה.
   1. כמת את ריכוז ה-DNA של הפלסמידים המבודדים על ידי ספקטרופוטומטריה או הערכת ג'ל.
   2. השתמש ב-aliquot (50-150 ננוגרם) של DNA פלסמיד לתגובת עיכול הגבלה אבחנתית (נפח סופי של 10 מיקרוליטר). בחר אנזימי הגבלה על סמך המקום שבו הם צפויים לבקע את ה-DNA של הפלסמיד המורכב.
      הערה: אנו ממליצים על שתי תגובות נפרדות: (1) טיפול ב-DNA פלסמיד עם אנזים הגבלה הצפוי לבקע את הפלסמיד באתר יחיד ו-(2) טיפול ב-DNA פלסמיד עם שני אנזימי הגבלה הצפויים לכרות את כל או חלק משבר ה-DNA שהוכנס. אנזימי הגבלה זמינים מסחרית ויש להשתמש בהם בהתאם להוראות היצרן.
   3. לאחר השלמת תגובת אנזים ההגבלה, שלב עם טעינת צבע (לריכוז פי 1), טען את כל התערובת על ג'ל אגרוז והפרד את שברי ה-DNA על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז²¹. השתמש בטרנס-תאורה UV או LED כדי לדמיין את שברי ה-DNA שנדדו בג'ל האגרוז. השווה מקטעי DNA מוגבלים עם סולם המשקל המולקולרי כדי לקבוע אם הם המשקל המולקולרי הצפוי (איור 4). שימו לב לפלסמידים עם דפוסי הגבלת האנזים הצפויים (הנקראים שיבוטים חיוביים); השליכו את הצינורות המכילים פלסמידים שאין להם את דפוס ההגבלה הצפוי (הנקראים שיבוטים שליליים).
4. כדי להבטיח שלשיבוטים חיוביים יש את רצף הנוקלאוטידים הצפוי, שלח מספר של שיבוטי פלסמיד חיוביים לריצוף.
   הערה: מומלץ ריצוף פלסמיד שלם (למשל, ריצוף ננו-נקבוביות).

תוצאות

בכתב יד זה, כדוגמה לשימוש ב-IVA, עקבנו אחר זרימת העבודה של IVA שסופקה כדי לשכפל מחדש את מסגרת הקריאה הפתוחה של mCherry לאתר השיבוט המרובה של פלסמיד pSU19 כדי ליצור פלסמיד זהה ל-pSU19mCherry (איור 3)¹⁷. פריימרים המתאימים ל-IVA תוכננו על סמך שלבי פרוטוקול 1.1 ו-1.2. לא?...

Discussion

השלב הקריטי ביותר לשיבוט IVA מוצלח הוא שבר ה-DNA ועיצוב הפריימר. יעילות IVA משופרת מאוד כאשר שברים הומולוגיים מתוכננים להיות באורך של לפחות 15 bp עם טמפרטורת התכה של כ-47-52 מעלות צלזיוס. מחקר מפורט הבוחן את האופטימיזציה של עיצוב מקטעי IVA פורסם¹⁶. צעד חשוב נוסף ליעילות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA ladder	FroggaBio	DM015-R500	DNA molecular weight marker
AccuReady M Single Channel 0.5-10 µL	Bulldog Bio	BPP020	Pipettes for transferring liquid
AccuReady M Single Channel Pipettor Kit	Bulldog Bio	BPK100	Pipettes for transferring liquid
Agar	BioShop Canada	AGR003.1	Solidifying agent for growth medium
Agarose	Biobasic	D0012	Make agarose gels for DNA electrophoresis
Biometra TOne	Analytikjena	846-2-070-301	Thermocycler
Caps for glass culture tubes	Fisher Scientific	14-957-91	Reusable caps for glass culture tubes
DNA primers	Integrated DNA Technologies	N/A	Bind and amplify template DNA in PCR reaction
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Cleave methylated template DNA following PCR amplification
EcoRI	New England Biolabs	R3101L	Restriction enzyme, comes with appropriate buffer
Eppendorf microtubes 1.5 mL	Sarstedt	72.690.300	Microtube, 1.5 mL, conical base, PP, attached flat cap, molded graduations and frosted writing space
Ethidium bromide	Fisher Scientific	AAL0748203	DNA visualization/intercalating agent, toxic
EZ-10 Spin Column Plasmid DNA Miniprep Kit	Biobasic	BS614	Isolate plasmid DNA from overnight bacterial cultures
GelDoc Go-Gel system	Bio-Rad	12009077	Imaging DNA gels
Glass culture tubes	Fisher Scientific	14-925E	Glass culture tubes
myGel Mini Electrophoresis System	Sigma-Aldrich	Z742288	System used for gel electrophoresis
NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	Determine DNA concentration
PCR Clean Up for DNA Sequencing	Biobasic	BT5100	Purify PCR products
Petri dish	Sarstedt	82.1473.011	Petri dish 92 x 16 mm, PS, transparent, with ventilation cams
Pipette tip, 1000 µL	Sarstedt	70.305	Pipette tips for 100-1000 µL
Pipette tip, 2.5 µL	Sarstedt	70.3010.265	Pipette tips for up to 2.5 µL
Pipette tip, 20 µL	Sarstedt	70.3020.200	Pipette tips for up to 20 µL
Pipette tip, 200 µL	Sarstedt	70.3030.020	Pipette tips for 1-200 µL
Salt (NaCl)	Fisher Scientific	S271-10	Component of bacterial growth medium (10 g/L)
Single 0.2 mL PCR tubes with flat cap	FroggaBio	TF-1000	PCR tubes
Tryptone (Bacteriological)	BioShop Canada	TRP402.5	Component of bacterial growth medium (10 g/L)
VeriFi DNA polymerase	PCR Biosystems	PB10.42-01	High fidelity polymerase, the PCR buffer containing Mg2+ and dNTPs is provided with purchase
Xba I	New England Biolabs	R0145S	Restriction enzyme, comes with appropriate buffer
Yeast extract	BioShop Canada	YEX401.205	Component of bacterial growth medium (5 g/L)