JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم الإبلاغ هنا عن بروتوكول للاستئصال الانتقائي للبلاعم الكلوية لدراسة تجديدها باستخدام أداة استئصال الخلايا البشرية CD59 / intermedilysin. هذه الطريقة قابلة للتطبيق أيضا لدراسة وظيفة وتجديد مجموعات الخلايا الأخرى في الكلى والكبد والأنسجة الدهنية.

Abstract

تعتبر البلاعم الكلوية (RMs) ضرورية لصحة الكلى ، وتنظيم المراقبة المناعية ، وتوازن الأنسجة ، والاستجابات للإصابة. في السابق ، أبلغنا عن استخدام أداة استئصال الخلايا البشرية CD59 (hCD59) / intermedilysin (ILY) لدراسة المصير المميز والديناميكيات والمنافذ ل RMs من نخاع العظام أو الأصل الجنيني. تنشأ RMs من الضامة المشتقة من كيس الصفار ، والخلايا الوحيدة في كبد الجنين ، والخلايا الوحيدة المشتقة من نخاع العظام ويتم الحفاظ عليها في مرحلة البلوغ من خلال التكاثر المحلي وتجنيد الخلايا الوحيدة المنتشرة. هنا ، نبلغ عن بروتوكول مفصل للاستئصال الانتقائي ل RMs لدراسة تجديدها ، بما في ذلك 1) توليد وتوصيف التعبير المحفز ل Cre ل hCD59 في RMs للفأر ، 2) تنقية ILY وتوصيف نشاط ILY ، 3) تحريض تعبير hCD59 على RMs في الفئران المركبة ، و 4) توصيف التجديد بعد استئصال RM بوساطة ILY. ILY على وجه التحديد وبسرعة يستنفد RMs في الفئران المركبة ، مع استئصال البلاعم الفعال في غضون يوم واحد من إعطاء ILY. بدأ تجديد البلاعم الكلوي بحلول اليوم 3 بعد الاستئصال ، مع ~ 88٪ من التعافي بحلول اليوم السابع. يوفر هذا النموذج أداة قوية لدراسة بيولوجيا البلاعم ويمكن استخدامه لاستئصال مجموعات الخلايا الأخرى بشكل انتقائي في الكلى والكبد والأنسجة الدهنية للتحقيق في وظيفتها وتجديدها.

Introduction

الضامة الكلوية (RMs) هي خلايا مناعية أساسية تحافظ على توازن الكلى ، وتنظم الاستجابات المناعية ، وتعزز إصلاح الأنسجة بعد الإصابة. يؤدون مجموعة متنوعة من الوظائف ، بما في ذلك البلعمة ، وعرض المستضد ، وتنسيق الاستجابات الالتهابية والمضادة للالتهابات1،2،3. اعتمادا على البيئة المحلية ، يمكن أن تستقطب RMs إما إلى أنماط ظاهرية مؤيدة للالتهابات (M1) أو مضادة للالتهابات (M2) ، إما تؤدي إلى تفاقم الإصابة أو تسهيل الشفاء4،5،6. كان خلل تنظيم RMs متورطا في ظهور وتطور إصابة الكلى الحادة (AKI) وأمراض الكلى المزمنة (CKD) ، مما يجعلها لاعبين حاسمين في صحة الكلى وعلم الأمراض7،8. تنشأ RMs من مصادر مختلفة ، بما في ذلك البلاعم المشتقة من كيس الصفار أثناء التطور الجنيني ، والخلايا الوحيدة في كبد الجنين ، والخلايا الوحيدة المشتقة من نخاع العظام في مرحلة البلوغ. تتوسع RMs وتنضج بالتوازي مع النمو الكلوي بعد الولادة ، والتي تنشأ بشكل أساسي من أحاديات كبد الجنين قبل الولادة ، مع الصيانة الذاتية حتى مرحلة البلوغ التي تكملها الخلايا الوحيدة المحيطية9. في البالغين ، يتم تجنيد الخلايا الوحيدة المنتشرة في الكلى عن طريق إشارات الاستتباب أو الإصابة ، وتتمايز إلى ضامة تحت التأثيرات البيئية الدقيقة المحلية. يتم الحفاظ على صيانة RM من خلال الانتشار المحلي والتجديد الدوري من الخلايا الوحيدةالمتداولة 9،10،11،12.

لقد أظهرنا سابقا استخدام نظام استئصال الخلايا البشرية CD59 (hCD59) / Intermedilysin (ILY) كأداة13،14 للتحقيق في المصائر والديناميكيات والمنافذ البيئية الدقيقة المميزة ل RMs المشتقة من نخاع العظام أو الأصول الجنينية9. يقوم ILY بتحلل الخلايا البشرية بشكل انتقائي في غضون ثوان عن طريق تكوين مسام في أغشية الخلايا المستهدفة15. تنشأ هذه الخصوصية من تقارب الارتباط الحصري ل ILY ل CD59 البشري (hCD59) ، مع عدم وجود تفاعل أو تأثير محلل على الخلايا من الأنواع الأخرى التي تفتقر إلى هذا المستقبل15. بناء على هذا المفهوم ، قمنا بتصميم أداة تسمح بالافصال السريع والمشروط والمستهدف للخلايا البشرية التي تعبر عن CD59 في نماذج الفئران المعدلة وراثيا من خلال تطبيق Intermedilysin (ILY) 14. لتسهيل استخدام هذه الأداة ، قمنا بتطوير نموذج للاستئصال الخلوي الشرطي والمستهدف عن طريق توليد فئران STOP-CD59 (ihCD59) ، حيث يحدث التعبير عن CD59 البشري فقط بعد إعادة التركيب بوساطة Cre13. في السابق ، تم العثور على جين CX3CR1cre-EFP المعبر عنه حصريا على CD11bintF480hi ، والذي يعرف بأنه ضامة كلوية9. لذلك ، استخدمنا خطوط CX3CR1CreER2 +/+  للعبور مع الفئران ihCD59 للتعبير عن hCD59 على البلاعم الكلوية. لقد نجحنا في إنشاء فئران مركبة بالنمط الجيني ihCD59 +/- / CX3CR1CreER +/-9 (+/- و +/+ و -/- تشير إلى الفئران المعدلة وراثيا المتماثلة الزيجوت ، والنصف ، والفئران المعدلة وراثيا غير الحاملة ، على التوالي). إدارة تاموكسيفين في ihCD59 +/- / CX3CR1CreER +/- الفئران المركبة المصنفة بشكل مشروط وتمييزها بواسطة تعبير hCD599. بعد استنفاد مكانة RM من خلال علاج ILY ، تمايزت الخلايا الوحيدة المحيطية على الفور إلى RMs المشتقة من نخاع العظام ، مما أدى إلى إعادة توطين المكان المناسب بشكل فعال كما هو موضح سابقا في9. كان هذا التجديد يعتمد بشكل حاسم على محور الإشارات CX3CR1 / CX3CL1 ، مما يؤكد دوره الأساسي في كل من صيانة واستعادة سكان RM9. نظهر أيضا أنه نظرا لقدراتها المميزة على تحلل السكر ، تتمتع RMs ذات الأصل الجنيني بقدرة أعلى على التخلص من المجمعات المناعية وهي أكثر حساسية للتحديات المناعية من RMs المشتقة من نخاعالعظام 9.

نقدم بروتوكولا مفصلا للاستئصال الانتقائي ل RMs للتحقيق في تجديدها باستخدام استئصال الخلايا السريع بوساطة hCD59 (ihCD59) المحفز بعد إعطاء ILY. تسبب حقن ILY في الاستئصال المستهدف ل RMs التي تعبر بشكل مشروط ومحدد: hCD59 في الفئران المركبة CX3CR1CreER +/- / ihCD59 +/ . بعد الاستئصال ، راقبنا التغيرات الديناميكية للبلاعم باستخدام قياس التدفق الخلوي ووجدنا استنزافا سريعا للضامة متبوعا بتجديد RMs. تم التعبير عن ILY المؤتلف في بكتريا قولونية BL21 (DE3) تم تنقيتها باستخدام كروماتوغرافيا تقارب النيكل و NTA. تم تأكيد نقاء ووظيفة ILY المؤتلف بواسطة SDS-PAGE ، وقياس الطيف الضوئي ، ومقايسة انحلال الدم ، مما يدل على نشاط السيتوليسين المميز المعتمد على الكوليسترول. استخدمنا ILY لاستنفاد RMs في الفئران ، وتحقيق استئصال فعال من البلاعم في غضون يوم واحد من إعطاء ILY. بدأ تجديد البلاعم الكلوي في اليوم 3 بعد الاستئصال ، مع ~ 85٪ من التعافي بحلول اليوم السابع. تشير البيانات إلى أن التجديد مدفوع في المقام الأول بتوظيف الخلايا الأحادية. يوفر هذا النموذج أداة قوية لدراسة بيولوجيا البلاعم ولديه إمكانات علاجية للتلاعب المستهدف بمجموعات البلاعم في أمراض الكلى. يمكن استخدام أداة استئصال الخلايا ihCD59 / ILY لدراسة وظيفة الخلية وتجديدها في الكلى والكبد والأنسجة الدهنية والأعضاء الأخرى.

Protocol

تمت الموافقة على بروتوكولات دراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) بجامعة تولين ، كلية الطب (البروتوكول رقم 1482). تم إيواء الفئران التجريبية ، Cx3cr1CreER +/+ و ihCD59 +/+ ، التي تتراوح أعمارها بين 10 و 12 أسبوعا ووزنها 25-30 جراما ، في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) في منشأة بالجامعة. تم إجراء جميع الإجراءات التي تنطوي على عزل الكلى في بيئة معقمة ، حيث ارتدى الباحثون قفازات وأقنعة وجه لمنع التلوث. يمكن العثور على التفاصيل المتعلقة بالكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. تحضير

  1. احصل على الفئران CX3CR1CreER +/+ من مختبر جاكسون. ضع الفئران في كلية الطب بجامعة تولين (SOM) في منشأة محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF). الحفاظ على تحت دورة الضوء / الظلام 12 ساعة مع ظروف بيئية خاضعة للرقابة.
  2. استخدم الفئران التي تم إنشاؤها مسبقا ihCD59 +/+ ذات الخلفية الجينية C57BL / 6 للتكاثر. عبر الفئران المتماثلة اللواقح CX3CR1CreER +/+ (ناقصة في تعبير CX3CR1) مع الفئران ihCD59 +/- لإنتاج الأنماط الجينية التالية للنسل: CX3CR1CreER +/- / / ihCD59-/- و CX3CR1CreER +/- / ihCD59 +/-.
  3. تأكد من أن الفئران CX3CR1CreER +/- متغايرة الزيجوت تحتفظ بتعبير CX3CR1 الوظيفي ، في حين أن الفئران CX3CR1CreER +/+ متماثلة اللواقح تعاني من نقص CX3CR1 عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي باستخدام الجسم المضاد المضاد ل CX3CR19.

2. إنتاج ILY (مشتق من14،15 )

  1. اليوم 0
    1. استرجع المخزون المجمد من سلالة ILY البكتيرية BL21-DE3-RIPL التي تحمل تسلسلات ILY الموسومة به في بلازميد pTrcHis-A (الشكل التكميلي 1) المخزن عند -80 درجة مئوية. تلقيح 10 ميكرولتر من المخزون البكتيري في 40 ميكرولتر من وسط مرق لوريا (LB) الذي يحتوي على أمبيسلين بتركيز 1 ميكروغرام / مل.
    2. يوزع الخليط الملقح على طبق أجار LB مكمل بالأمبيسلين (1 ميكروغرام / مل). احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة بكتيرية.
  2. اليوم 1
    1. حدد ست مستعمرات فردية من لوحة أجار LB. تلقيح كل مستعمرة في 3.5 مل من وسط LB الذي يحتوي على الأمبيسلين. احتضان الثقافات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
  3. اليوم 2
    1. انقل كل مزرعة بادئة سعة 3.5 مل إلى 250 مل من وسط LB المكمل بالأمبيسلين. احتضان المزارع عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات مع رج عند 230 × جم للسماح بنمو البكتيريا.
    2. بعد 3 ساعات ، أضف الأيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) من محلول مخزون 1 متر (مخزن عند -20 درجة مئوية) عند تخفيف 1: 1000 لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 1 ملليمتر. استمر في الحضانة لمدة 4 ساعات إضافية للحث على التعبير عن البروتين.
    3. قم بوزن زجاجة طرد مركزي فارغة وسجل الوزن. انقل ما يقرب من 250 مل من الثقافة المستحثة إلى زجاجة أجهزة الطرد المركزي.
    4. قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، ثم قم بوزن الزجاجة التي تحتوي على الحبيبات. احسب وزن الحبيبات عن طريق طرح وزن الزجاجة الفارغة من الوزن الإجمالي بعد الطرد المركزي.
    5. قم بتخزين الحبيبات البكتيرية عند -20 درجة مئوية لاستخلاص وتنقية ILY لاحقا.
  4. يوم 3 : استخراج وتنقية ILY
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل عن طريق الجمع بين 30 مل من كاشف استخراج بروتين Bug Buster مع 30 ميكرولتر من نوكلياز البنزوناز (1200 وحدة كونيتز) و 0.9 ميكرولتر من الليزوزيم (10,000 وحدة من النشاط الأنزيمي) في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
    2. امزج المحلول برفق للتأكد من أن المخزن المؤقت للتحلل متجانس. أضف المخزن المؤقت للتحلل المحضر إلى الحبيبات البكتيرية (2-5 جم). دوامة الخليط جيدا لمدة 30-60 ثانية لإعادة تعليق الخلايا البكتيرية بالكامل.
    3. قسم المحلول المعلق بالتساوي بين أنبوبين من أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل. ضع الأنابيب على الثلج واحتضانها لمدة 30-90 دقيقة. أثناء الحضانة ، قم بهز الأنابيب برفق باستخدام شاكر مداري ودوامة لفترة وجيزة كل 5-10 دقائق لمدة 10-15 ثانية لتعزيز تحلل الخلايا.
    4. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للمحللات عند 4,900 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    5. اغسل العمود جيدا بماء الصنبور باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل لإزالة أي راتينج متبقي من الاستخدام السابق.
    6. اشطف العمود بنسبة 70٪ من الإيثانول لتعقيمه. اغسل العمود 2x-3x باستخدام ddH2O البارد لإزالة أي إيثانول متبقي. ضع العمود في الحامل.
    7. أضف 6-10 مل من ddH2O البارد لمزيد من الغسل والتوازن إلى العمود للتنقية. أضف ما يقرب من 3 مل من حبات الراتنج إلى العمود. قم بتوصيل العمود بمضخة تمعجية مضبوطة على سرعة 30.
    8. أضف 10 مل من ddH2O البارد لتعليق الراتنج بالكامل وإعداده لربط البروتين. اغسل حبات الراتنج ب 15 مل من 1x Charging Buffer لتحضير الراتنج لربط البروتين.
    9. اجمع المادة الطافية المحللة البكتيرية بعد الطرد المركزي في أنبوب جديد ، مع ضمان التخلص من الحبيبات. قم بتصفية المادة الطافية باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر مع حقنة لإزالة أي بقايا خلوية متبقية.
    10. مرر 20-25 مل من المحللة البكتيرية المفلترة عبر العمود في ثلاث جولات منفصلة. بعد كل تمريرة ، اجمع 20 ميكرولتر من التدفق وقم بتسميتها على أنها PE لقياس الكثافة الضوئية (OD) لاحقا.
    11. اغسل العمود ب 20-30 مل من Binding Buffer لإزالة البروتينات غير المرتبطة. اغسل العمود ب 20-30 مل من Wash Buffer. اجمع 20 ميكرولتر من جزء الغسيل لقياس OD.
    12. قم بإزالة البروتين المرتبط بإضافة 10-20 مل من Elution Buffer. ابدأ في جمع الشطف بعد 3-4 دقائق باستخدام أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. اجمع ما يقرب من 1 مل لكل أنبوب ، واملأ 15-17 أنبوبا.
    13. قم بقياس امتصاص كل جزء من الشطف عند A280 باستخدام مقياس الطيف الضوئي. استخدم المخزن المؤقت Elution كفراغ أثناء قراءات A280. اجمع الأنابيب ذات الامتصاص المتزايد بشكل كبير عند A280 لأنها تحتوي على بروتين ILY الموسوم به والذي يوجد عادة في أجزاء حول الأنبوب 13.
    14. قم بتخزين أجزاء الشطف (أو الأنابيب) التي تحتوي على بروتين ILY عند 4 درجات مئوية. تابع الخطوات الإضافية في اليوم التالي لضمان الاستقرار الأمثل للبروتين.
      ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات على الثلج أو عند 4 درجات مئوية حيثما أمكن ذلك للحفاظ على سلامة البروتين.
  5. اليوم 4: إزالة السموم الداخلية من الشطف
    1. اشطف عمود الراتنج لإزالة السموم الداخلية ب 6-10 مل من الماء فائق النقاء. اضغط برفق على العمود لتنظيم التدفق.
    2. اشطف العمود ب 10 مل من محلول ديوكسي كولات الصوديوم 1٪ (طازج أو لا يزيد عمره عن شهر واحد) لإزالة السموم الداخلية المقلدة. اشطف العمود مرة أخرى ب 6-10 مل من الماء فائق النقاء لإزالة أي منظف متبقي.
    3. ضع عينة البروتين المحضرة على عمود الراتنج. احتضان العينة في العمود لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) للسماح بربط السموم الداخلية الأمثل.
    4. اجمع كسر التدفق الأولي. أضف ddH2O إلى العمود لمزيد من الشطف واجمع الكسور المملوءة في حوالي 10 أنابيب (1 مل لكل أنبوب).
    5. قم بتخزين عمود الراتنج في 25٪ إيثانول عند 4 درجات مئوية للاستخدام في المستقبل. قم بقياس الكثافة البصرية (OD) لعينات البروتين المملوءة لتحديد كمية العائد. توقع استعادة ما يقرب من 50٪ -70٪ من إجمالي البروتين من دفعة الشطف الأولى.
  6. اليوم 5-6: غسيل الكلى
    1. قم بإعداد 2 لتر من عازلة غسيل الكلى عن طريق تعقيم 1600 مل من الماء المقطر منزوع الأيونات (ddH2O). أضف 200 مل من 10x PBS ، و 200 مل من الجلسرين ، و 3.5115 جم من MES (2- (N-morpholino) حمض الإيثان سلفونيك) إلى الماء المعقم.
    2. قلب الخليط باستخدام شريط تحريك مغناطيسي حتى تذوب جميع الكواشف تماما. قم بتخزين المخزن المؤقت الناتج عند 4 درجات مئوية.
    3. أضف أجزاء الشطف المخزنة إلى مجموعة غسيل الكلى ، ثم قم بإزالة الهواء من مجموعة غسيل الكلى بإبرة. غسيل الكلى بمحلول البروتين باستخدام مجموعة غسيل الكلى لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية مع ضبط سرعة التقليب على 2 تقريبا.
    4. قم بتكوين مجموعة غسيل الكلى للتأكد من غمرها بالكامل في المخزن المؤقت. استبدل مخزن غسيل الكلى في مجموعة غسيل الكلى بمخزن غسيل الكلى الجديد في حاوية سعة 2 لتر في اليوم التالي. استمر في غسيل الكلى لمدة 24 ساعة إضافية.
    5. انقل المحلول بالكامل بعناية ، بما في ذلك أي رواسب بيضاء ، إلى أنبوب معقم للحفاظ على بروتين ILY ، الذي قد يتراكم. قم بتركيز بروتين ILY باستخدام وحدة مرشح الطرد المركزي ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة للطرد المركزي.
    6. قم بتقسيم بروتين ILY المركز إلى أجزاء سعة 200 ميكرولتر في أنابيب معقمة. قم بتسمية كل أنبوب بالتاريخ والاسم. قم بتخزين الحصص عند -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل في فحوصات الرحلان الكهربائي للهلام وانحلال الدم.

3. توصيف ILY بواسطة الرحلان الكهربائي SDS-PAGE

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت لتشغيل MOPS SDS (1x) عن طريق تخفيف المخزن المؤقت للتشغيل (20x) باستخدام ddH2O.
  2. قم بإعداد المخزن المؤقت للعينة في غطاء الدخان عن طريق خلط 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل 6x مع 10 ميكرولتر من β-mercaptoethanol (β-ME). امزج المحلول جيدا لضمان التجانس الكامل.
  3. اجمع العينة المحضرة مع مخزن التحميل لتحقيق حجم نهائي يبلغ 30 ميكرولتر. قم بإذابة العينات ودوامها بقوة لضمان الخلط الكامل.
  4. سخني العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتشويه البروتينات. قم بتحميل العينات على جل SDS-PAGE بنسبة 4٪ -20٪. قم بتشغيل الرحلان الكهربائي بجهد ثابت قدره 80 فولت لمدة 90 دقيقة.
  5. افتح علبة الجل بعناية واغمر الجل في ddH2O لمدة 5 دقائق. كرر خطوة الغسيل 2x باستخدام شاكر.
  6. قم بتلطيخ الجل باستخدام Coomassie Brilliant Blue لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT). اغسل الجل لمدة 30 دقيقة في ddH2O. استبدل الماء ب ddH2O الطازج واحتضن الجل على شاكر لفترة تتراوح من بين عشية وضحاها إلى 3 أيام للتخلص الكامل.
  7. التقط صورة للهلام الملون باستخدام الكاميرا (الشكل 1 أ). قم بتحليل الجل باستخدام برنامج ImageJ للتقييمات الكمية والنوعية.

4. مقايسة انحلال لنشاط ILY

  1. قم بإذابة عينات ILY المخزنة (Intermedilysin) تماما في درجة حرارة الغرفة. قم بتدوير العينات المذابة جيدا لضمان التجانس ، حيث يمكن أن تتجمع ILY عند الذوبان.
  2. قم بإعداد لوحة 96 بئرا للتخفيفات التسلسلية. أضف 160 ميكرولتر من محلول مخزون ILY (26.7 نانوغرام / ميكرولتر) إلى البئر الأول. أضف 80 ميكرولتر من 1x PBS إلى كل من الآبار اللاحقة في نفس الصف أو العمود.
  3. انقل 80 ميكرولتر من محلول ILY من البئر الأول إلى البئر الثاني. امزج جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل للتأكد من أن المحلول متجانس. انقل 80 ميكرولتر من البئر الثاني إلى البئر الثالث واخلطه جيدا.
  4. كرر هذه العملية لكل بئر ، مع نقل 80 ميكرولتر من البئر السابق إلى التالي حتى يتم تحضير العدد المطلوب من التخفيفات. بعد نقل 80 ميكرولتر إلى آخر بئر ، تخلص من 80 ميكرولتر من تلك البئر لضمان أحجام متسقة عبر اللوحة.

5. تحضير خلايا الدم الحمراء البشرية (كرات الدم الحمراء)

  1. اسحب 1-2 مل من دم الإنسان الطازج في أنبوب يحتوي على مضاد للتخثر ، مثل EDTA. قم بالطرد المركزي للدم في درجة حرارة الغرفة عند 3,000 × جم لمدة 5 دقائق.
  2. تخلص من المادة الطافية واغسل حبيبات كرات الدم الحمراء البشرية باستخدام PBS 2x-3x حتى يصبح المادة الطافية صافية. قم بتخفيف كرات الدم الحمراء البشرية المغسولة عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء إلى 900 ميكرولتر من 1x PBS لتحقيق تخفيف 1: 100.
  3. أضف 10 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء البشرية المخففة إلى كل بئر. أضف 30 ميكرولتر من محلول ILY المخفف تسلسليا من لوحة التخفيف إلى كل بئر. أضف 160 ميكرولتر من 1x PBS ليصل الحجم النهائي إلى 200 ميكرولتر لكل بئر (تركيز البدء: 4 نانوغرام / ميكرولتر).
  4. أضف 10 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء البشرية المخففة إلى آبار التحكم. أضف 190 ميكرولتر من الماء أو 1x PBS إلى آبار التحكم للضوابط السلبية. امزج الأطباق عن طريق النقر عليها برفق.
  5. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح بحدوث انحلال الدم. قم بالطرد المركزي للألواح عند 3,000 × جم لمدة 5 دقائق لحبيبات أي كرات الدم الحمراء البشرية السليمة.
  6. انقل بعناية 100 ميكرولتر من المادة الطافية من كل بئر إلى صفيحة جديدة مسطحة القاع سعة 96 بئرا. قم بقياس امتصاص المواد الطافية عند 405 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.
  7. احسب نشاط انحلال الدم ل ILY من خلال مقارنة قيم امتصاص العينات بالتحكم16.

6. علاج تاموكسيفين ، استنفاد RM ، والتجديد

  1. يسخن زيت الذرة إلى 42 درجة مئوية. قم بإذابة 100 مجم من تاموكسيفين في 5 مل من زيت الذرة المسخن مسبقا لتحضير محلول مرق بتركيز 20 مجم / مل.
  2. يتم تطبيق تاموكسيفين داخل الصفاق (IP) للفئران الذكور CX3CR1CreER +/- /ihCD59 +/- بجرعة 100 ميكروغرام/غرام من وزن الجسم. كرر حقن تاموكسيفين لمدة 3 أيام متتالية.
  3. انتظر لمدة 15 يوما بعد حقن تاموكسيفين النهائي للسماح بتعبير hCD59 بوساطة Cre.
  4. حقن جرعة واحدة من إنترميديليسين (ILY) عن طريق الوريد في الفئران CX3CR1CreER +/- / ihCD59 +/- و CX3CR1CreER +/- / ihCD59 -/- بجرعة 120 نانوغرام / غرام من وزن الجسم.
  5. مراقبة وتأكيد استئصال RM والتجديد اللاحق عن طريق إجراء قياس التدفق الخلوي في 1 و 3 و 7 أيام بعد إعطاء ILY17.

7. القتل الرحيم للفأر

  1. ضع في غرفة مناسبة وعرضه للإيزوفلوران وفقا لبروتوكولات IACUC. تحقق من التخدير عن طريق التحقق من عدم وجود ردود أفعال، مثل منعكس سحب الدواسة.
  2. بمجرد تخدير الفأر بالكامل وعدم الاستجابة ، قم بإجراء خلع عنق الرحم لضمان القتل الرحيم. تأكد من القتل الرحيم عن طريق التحقق من عدم وجود ردود أفعال ، مثل منعكس سحب الدواسة.
  3. قم بعمل شق خط الوسط بطول 2 سم تقريبا على البطن باستخدام مشرط معقم وسحب الجلد برفق لكشف التجويف الصدري. افتح القفص الصدري على طول القص باستخدام مقص جراحي غير حاد لكشف القلب.
  4. أدخل إبرة 21G-23G في البطين الأيسر. ابدأ التروية ب 10-20 مل من PBS البارد لطرد الدم.
  5. اقطع الأذين الأيمن لفتح للسماح للدم بالتصريف من الدورة الدموية. استمر في التروية حتى تبدو الكلى شاحبة ، مما يشير إلى تصفية الدم بشكل فعال.
  6. حدد موقع الكلى على جدار الجسم الظهري. افصل الكلى برفق عن الأنسجة المحيطة باستخدام الملقط والمقص. استئصال كبسولات الكلى وضع الكلى على الفور في PBS بارد لمنع التدهور.

8. هضم الكلى

  1. تحضير كوكتيل إنزيم الهضم عن طريق خلط 9 مل من HBSS (خالي من Ca / Mg) ، و 1 مل من الكولاجيناز IV (5 مجم / مل) ، و 20 ميكرولتر من DNase I (10 مجم / مل). تحضير محلول الإنزيم طازجا واحتفظ به على الثلج حتى الاستخدام.
  2. افرم الكلى إلى أجزاء صغيرة (من الناحية المثالية ≤ 1 مم) باستخدام مقص معقم في طبق بتري يحتوي على 5 مل من HBSS. نقل شظايا أنسجة الكلى إلى أنابيب سعة 15 مل تحتوي على 10 مل من محلول الإنزيم المحضر.
  3. احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع تحريك لطيف لفصل الأنسجة. قم بتقطيع الأنسجة برفق باستخدام ماصة أو مكبس حقنة لفصل كتل الخلايا بشكل أكبر.
  4. قم بإزالة بقايا الأنسجة عن طريق تمرير معلق الخلية عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 650 × جم لمدة 10 دقائق عند 18 درجة مئوية.
  5. صب العازلة بعناية بعد الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في 5 مل من محلول التحلل واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتحلل خلايا الدم الحمراء.
  6. اغسل الخلايا باستخدام PBS لإزالة المخزن المؤقت للتحلل. حافظ على التعليق أحادي الخلية الناتج على الجليد حتى الاستخدام الآخر.

9. الطرد المركزي المتدرج الكثافة

  1. لإثراء الخلايا المكونة للدم ، أعد تعليق حبيبات الخلية من الغسيل السابق في 10 مل من محلول التدرج الكثافة بنسبة 30٪. ضع طبقة بعناية من المحلول على 3 مل من محلول التدرج الكثافة 70٪ في أنبوب الطرد المركزي.
  2. جهاز الطرد المركزي التدرج عند 500 × جم لمدة 30 دقيقة دون استخدام الفرامل. بعد الطرد المركزي ، قم بتجميع طبقة الطور البيني بعناية بين المحاليل 30٪ و 70٪ ؛ تحتوي هذه الطبقة على الخلايا المفردة المخصبة.
  3. اغسل الخلايا المجمعة 2x ب 10 مل من PBS عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 10 دقائق في كل مرة. أعد تعليق حبيبات الخلية النهائية في 1 مل من المخزن المؤقت FACS (1x PBS مع 2٪ FBS) في أنبوب 1.5 مل.
  4. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم تحت مجهر المجال الساطع. اضبط تركيز الخلية على 2 × 106 خلايا / مل.

10. تلطيخ قياس التدفق الخلوي ، الاستحواذ

  1. اضبط تركيز الخلية من معلقات الخلية المفردة المحضرة من أنسجة الكلى الفأرية إلى 2-3 × 106 خلايا / مل لتحليل قياس التدفق الخلوي.
  2. حبيبات الخلايا في أنابيب 1.5 مل عن طريق الطرد المركزي عند 650 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت FACS.
  3. أضف الجسم المضاد المضاد ل CD16 / 32 عند تخفيف 1: 200 لمنع ارتباط مستقبلات Fc غير المحدد. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. استخدم صبغة Aqua Live / Dead للتمييز بين الخلايا الحية والميتة ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  5. تلطيخ الخلايا بالأجسام المضادة المترافقة مسبقا عند تخفيف 1: 100 ، بما في ذلك CD45-e450 و CD11b-PE-Cy7 و hCD59-PE و F4 / 80-BV605. أضف كوكتيل الجسم المضاد إلى تعليق الخلية.
  6. احتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام لحماية الفلوروفورات من التبييض الضوئي. اغسل الخلايا الملطخة 2x باستخدام عازلة FACS (PBS مع 2٪ مصل بقري للجنين) عن طريق الطرد المركزي عند 650 × جم لمدة 5 دقائق.
  7. ثبت الخلايا في 1٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 30 دقيقة على الجليد. اغسل الخلايا الثابتة 2x باستخدام المخزن المؤقت FACS لإزالة PFA المتبقي.
  8. احصل على خلايا ملطخة وثابتة باستخدام مقياس التدفق الخلوي. تحليل البيانات باستخدام البرنامج.
  9. حدد الكلى وغيرها من البلاعم المقيمة في الأنسجة والخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام علامات CD45 و CD11b و F4 / 80 كما هو موضح في9 .
  10. قم بإجراء البوابة الأولية لتحديد الخلايا الحية استنادا إلى ملفات تعريف التشتت الأمامي (FSC) والمبعتت الجانبي (SSC). تخلص من المضاعفات عن طريق البوابات على منطقة التشتت الأمامية (FSC-A) مقابل ارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H). استبعاد الخلايا الميتة باستخدام صبغة البقاء LIVE / DEAD.
  11. إثراء الخلايا المناعية عن طريق البوابات على مجموعات CD45 +. حدد البلاعم المقيمة في الكلى على أنها خلايا CD11b + F4 / 80 ++ داخل مجموعة CD45 + ، كما هو موضح في استراتيجية البوابات (الشكل 2 أ).
  12. حدد مجموعات الخلايا الدبقية الصغيرة على أنها خلايا CD11b + CD45iⁿt (الشكل 2 ب). قم بإجراء الحصول على البيانات على مقياس التدفق الخلوي. قم بإجراء التحليل النهائي باستخدام البرنامج لإكمال دراسة قياس التدفق الخلوي.

النتائج

اتبعت تنقية ILY المؤتلف His-Tag نفس البروتوكول الموصوف سابقا في14. تم التعبير عن ILY بنجاح في بكتريا قولونية BL21 (DE3) الخلايا ، التي تم تحويلها باستخدام بلازميد يشفر جين ILY من Streptococcus intermedius. عند الحث باستخدام IPTG ، كان الإفراط في التعبير عن البروتين المستهدف و...

Discussion

اتبع التعبير الناجح والتنقية والتحقق الوظيفي من ILY المؤتلف الذي تم وضع علامة عليه في هذه الدراسة بروتوكولاراسخا 15. ومع ذلك ، تضمنت العملية العديد من الخطوات الحاسمة التي ضمنت إنتاجية عالية من البروتين والنقاء والنشاط البيولوجي. تم تحسين ت?...

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة أو علاقات شخصية يمكن أن يبدو أنها تؤثر على العمل المبلغ عنه في هذه المخطوطة. لم يؤثر أي تضارب في المصالح ، بما في ذلك الانتماءات المالية أو غير المالية أو المهنية أو الشخصية ، على تصميم الدراسة أو سلوكها أو تفسيرها أو عرضها.

Acknowledgements

نعرب عن امتناننا لكل من الأعضاء السابقين والحاليين في مختبر تشين لمساهماتهم في تطوير وتحسين البروتوكولات المستخدمة في هذه الدراسة. نشكر أيضا مجموعة الدكتور آر كيه تويتن في مركز العلوم الصحية بجامعة أوكلاهوما على توفير بلازميد ILY المؤتلف بسخاء ، والذي كان له دور فعال في هذا البحث. تم دعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة 5 P51OD011104-58 و R01DK129881 (Xq.) و R21OD024931 (X.Q.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 µm syringe filterMilliporeSLHVR33RS
4-15% TGX Stain-Free Protein GelsBio-Rad4568084
6X Loading bufferFisher50-103-6570
70% EthanolWWR Life Science64-17-5
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing BufferGibcoA1049201
Affinity resin beadsMillipore69670
Ampicillin sodium solutionZymo ResearchA1001-5
Anti-CD11b-PE-Cy7 (Clone M1/70)Invitrogen25-0112-82
Anti-CD16/32 (FcγRIII/II, Clone 93)eBioscience48-0161-80
Anti-CD45-e450 (Clone 30-F11)eBioscience48-0451-82
Anti-F4/80-BV605(Clone BM8)BioLegend 123133
Anti-hCD59-PE (Clone OV9A2)Invitrogen12-0596-42
Aqua Live/Dead dyeInvitrogen    L34957A
Beads (resin)Millipore69670
Benzonase NucleaseMillipore70664-10KUN
BugBuster protein extraction reagentMillipore70584-4
Centrifuge for microtubesEppendorf5424
Centrifuge for tubesThermo Scientific75-001-241
Collagenase type IVWorthington Biochemical CorporationLS004188
Corn oilSigma AldrichC8267
Deoxyribonuclease (DNAse) IWorthington Biochemical CorporationLS002007
Detoxi-Gel resin columnMillipore69670
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) solutionCorning21-031-CV
EDTA tubesBD365974
FBS (Fetal bovine serum)Gibco10082-139
GlycerolFisherBP229-1
HBSS (Hank’s Ballanced Salt Solution)Gibco24020117
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) Millipore-Sigma206-703-0
IsofluraneVET one502017
LB media
LSRFortessa flow cytometerBD Biosciences
MES [2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid]Fisher50-488-796
MOPS [3-(N-morpholino) propanesulfonic acid]Fisher50-213-522
Percoll density gradient mediaCytiva17089101
Peristaltic pumpFisher ScientificDiscontinued now, use alternative
PFA (Paraformaldehyde)Thermo ScientificI28800
Purification columnMilliporeUFC900308
rLysozyme solutionNovagen20C71110
Shaking water bath Thermo ScientificTSSB15
Slide-A-Lyzer dialysis kitThermo66107
Sodium deoxycholateFisherBP349-100Fresh made or less than a month
Sterile cell strainer (40 μm)Fisher Scientific22-363-547
TamoxifenSigma Aldrich6734
Ultra centrifugal filterMilliporeUFC900308
Ultrapure waterThermo10977-015
Vortex mixerFisher Scientific2215365
β-ME (β-mercaptoethanol)FisherBP176-100

References

  1. Epelman, S., Lavine, K. J., Randolph, G. J. Origin and functions of tissue macrophages. Immunity. 41 (1), 21-35 (2014).
  2. Nelson, P. J. et al. The renal mononuclear phagocytic system. J Am Soc Nephrol. 23 (2), 194-203 (2012).
  3. Wang, Y., Harris, D. C. Macrophages in renal disease. J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).
  4. Islamuddin, M., Qin, X. Renal macrophages and NLRP3 inflammasomes in kidney diseases and therapeutics. Cell Death Discov. 10 (1), 229 (2024).
  5. Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
  6. Mily, A. et al. Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection. J Vis Exp. (163), 61807 (2020).
  7. Huen, S. C., Cantley, L. G. Macrophages in Renal Injury and Repair. Annu Rev Physiol. 79, 449-469 (2017).
  8. Tang, P. M., Nikolic-Paterson, D. J., Lan, H. Y. Macrophages: versatile players in renal inflammation and fibrosis. Nat Rev Nephrol. 15 (3), 144-158 (2019).
  9. Liu, F. et al. Distinct fate, dynamics and niches of renal macrophages of bone marrow or embryonic origins. Nat Commun. 11 (1), 2280 (2020).
  10. Chew, C. et al. Kidney resident macrophages have distinct subsets and multifunctional roles. Matrix Biol. 127, 23-37 (2024).
  11. Cheung, M. D. et al. Resident macrophage subpopulations occupy distinct microenvironments in the kidney. JCI Insight. 7 (20), 161078 (2022).
  12. Epelman, S. et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  13. Feng, D. et al. Cre-inducible human CD59 mediates rapid cell ablation after intermedilysin administration. J Clin Invest. 126 (6), 2321-2333 (2016).
  14. Hu, W. et al. Rapid conditional targeted ablation of cells expressing human CD59 in transgenic mice by intermedilysin. Nat Med. 14 (1), 98-103 (2008).
  15. Giddings, K. S., Zhao, J., Sims, P. J., Tweten, R. K. Human CD59 is a receptor for the cholesterol-dependent cytolysin intermedilysin. Nat Struct Mol Biol. 11 (12), 1173-1178 (2004).
  16. Parkhurst, C. N. et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  17. Cao, Q., Harris, D. C., Wang, Y. Macrophages in kidney injury, inflammation, and fibrosis. Physiology. 30 (3), 183-194 (2015).
  18. Li, G. et al. The role of macrophages in fibrosis of chronic kidney disease. Biomed Pharmacother. 177, 117079 (2024).
  19. Liu, F. et al. Versatile cell ablation tools and their applications to study loss of cell functions. Cell Mol Life Sci. 76 (23), 4725-4743 (2019).
  20. Yashchenko, A. et al. Cx3cr1 controls kidney resident macrophage heterogeneity. Front Immunol. 14, 1082078 (2023).
  21. Duffield, J. S. Macrophages and immunologic inflammation of the kidney. Semin Nephrol. 30 (3), 234-254 (2010).
  22. Lee, S. et al. Distinct macrophage phenotypes contribute to kidney injury and repair. J Am Soc Nephrol. 22 (2), 317-326 (2011).
  23. Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in Tissue Repair, Regeneration, and Fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
  24. Guo, C. et al. Crosstalk between proximal tubular epithelial cells and other interstitial cells in tubulointerstitial fibrosis after renal injury. Front Endocrinol. 14, 1256375 (2023).
  25. Guillot, A. et al. Bile acid-activated macrophages promote biliary epithelial cell proliferation through integrin αvβ6 upregulation following liver injury. J Clin Invest. 131 (9), 132305 (2021).
  26. Kim, S. J. et al. Adipocyte Death Preferentially Induces Liver Injury and Inflammation Through the Activation of Chemokine (C-C Motif) Receptor 2-Positive Macrophages and Lipolysis. Hepatology. 69 (5), 1965-1982 (2019).
  27. Saxena, V. et al. Generation of Atp6v1g3-Cre mice for investigation of intercalated cells and the collecting duct. Am J Physiol Renal Physiol. 325 (6), F770-f778 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved