JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, insan CD59 / intermedilysin hücre ablasyon aracı kullanılarak rejenerasyonlarını incelemek için renal makrofajların seçici ablasyonu için bir protokol bildirilmiştir. Bu yöntem aynı zamanda böbrek, karaciğer ve yağ dokusundaki diğer hücre popülasyonlarının işlevini ve yenilenmesini incelemek için de geçerlidir.

Özet

Renal makrofajlar (RM'ler) böbrek sağlığı, bağışıklık sürveyansının düzenlenmesi, doku homeostazı ve yaralanmaya verilen yanıtlar için gereklidir. Daha önce, kemik iliği veya embriyonik kökenli RM'lerin farklı kaderini, dinamiklerini ve nişlerini incelemek için bir insan CD59 (hCD59)/intermedilysin (ILY) hücre ablasyon aracının kullanıldığını bildirmiştik. RM'ler, yolk kesesi kaynaklı makrofajlardan, fetal karaciğer monositlerinden ve kemik iliği kaynaklı monositlerden köken alır ve yetişkinlikte lokal proliferasyon ve dolaşımdaki monositlerin toplanması yoluyla korunur. Burada, 1) fare RM'lerinde hCD59'un Cre ile indüklenebilir ekspresyonunun üretilmesi ve karakterizasyonu, 2) ILY'nin saflaştırılması ve ILY aktivitesinin karakterizasyonu, 3) bileşik farelerde RM'lerde hCD59 ekspresyonunun indüksiyonu ve 4) ILY aracılı RM ablasyonundan sonra rejenerasyonun karakterizasyonu dahil olmak üzere, RM'lerin rejenerasyonlarını incelemek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. ILY, ILY uygulamasından sonraki 1 gün içinde verimli makrofaj ablasyonu ile bileşik farelerde RM'leri spesifik ve hızlı bir şekilde tüketir. Renal makrofaj rejenerasyonu, ablasyondan sonraki 3. günde başladı ve 7. günde ~% 88 iyileşme ile başladı. Bu model, makrofaj biyolojisini incelemek için güçlü bir araç sunar ve işlevlerini ve rejenerasyonlarını araştırmak için böbrek, karaciğer ve yağ dokularındaki diğer hücre popülasyonlarını seçici olarak ablasyon yapmak için kullanılabilir.

Giriş

Renal makrofajlar (RM'ler), böbrek homeostazını koruyan, bağışıklık tepkilerini düzenleyen ve yaralanma sonrası doku onarımını destekleyen temel bağışıklık hücreleridir. Fagositoz, antijen sunumu ve hem enflamatuar hem de antienflamatuar yanıtların düzenlenmesi dahil olmak üzere çeşitli işlevleri yerine getirirler 1,2,3. Yerel ortama bağlı olarak, RM'ler pro-inflamatuar (M1) veya anti-inflamatuar (M2) fenotiplere polarize olabilir, bu da yaralanmayı şiddetlendirir veya iyileşmeyi kolaylaştırır 4,5,6. RM'lerin düzensizliği, akut böbrek hasarı (ABH) ve kronik böbrek hastalığının (KBH) başlangıcında ve ilerlemesinde rol oynamıştır ve bu da onları böbrek sağlığı ve patolojisinde kritik oyuncular haline getirmektedir 7,8. RM'ler, embriyogenez sırasında yolk kesesi kaynaklı makrofajlar, fetal karaciğer monositleri ve yetişkinlikte kemik iliği kaynaklı monositler dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan kaynaklanır. RM'ler doğum sonrası böbrek büyümesine paralel olarak genişler ve olgunlaşır, esas olarak doğumdan önce fetal karaciğer monositlerinden kaynaklanır ve periferik monositler tarafından desteklenen yetişkinlik boyunca kendi kendini idame ettirir9. Yetişkinlerde, dolaşımdaki monositler, homeostatik veya yaralanma sinyalleri ile böbreğe alınır ve yerel mikroçevresel etkiler altında makrofajlara farklılaşır. RM bakımı, lokal proliferasyon ve dolaşımdaki monositlerdenperiyodik olarak ikmal yoluyla sürdürülür 9,10,11,12.

Daha önce, kemik iliği veya embriyonik kökenlerdentüretilen RM'lerin farklı kaderlerini, dinamiklerini ve mikroçevresel nişlerini araştırmak için insan CD59 (hCD59)/ara madde (ILY) hücre ablasyon sisteminin bir araç13,14 olarak kullanıldığını göstermiştik 9. ILY, hedeflenen hücre zarlarında gözenekler oluşturarak insan hücrelerini saniyeler içinde seçici olarak parçalar15. Bu özgüllük, ILY'nin insan CD59'a (hCD59) özel bağlanma afinitesinden kaynaklanır ve bu reseptörden yoksun diğer türlerden hücreler üzerinde hiçbir etkileşim veya litik etki yoktur15. Bu konsepte dayanarak, intermedilizin (ILY)14 uygulaması yoluyla transgenik fare modellerinde insan CD59 eksprese eden hücrelerin hızlı, koşullu ve hedefli ablasyonuna izin veren bir araç tasarladık. Bu aracın kullanımını kolaylaştırmak için, insan CD59 ekspresyonunun yalnızca Cre aracılı rekombinasyon13'ten sonra meydana geldiği, floxed STOP-CD59 knockin fareleri (ihCD59) üreterek koşullu ve hedeflenmiş hücre ablasyonu modeli geliştirdik. Daha önce, renal makrofajlar9 olarak tanımlanan CD11bintF480hi'de yalnızca eksprese edilen CX3CR1cre-EFP geni bulunmuştu. Bu nedenle, renal makrofajlarda hCD59'u eksprese etmek için ihCD59 fareleri ile çaprazlamak için CX3CR1CreER2 +/+  hatlarını kullandık. ihCD59 +/-/CX3CR1CreER +/- 9 genotipine sahip bileşik fareleri başarıyla oluşturduk (+/-, +/+ ve -/- sırasıyla homozigot, hemizigot ve taşıyıcı olmayan transgenik fareleri gösterir). ihCD59 +/-/ CX3CR1CreER +/- bileşik farelerde tamoksifen uygulaması, hCD59 ekspresyonu9 ile RM'leri şartlı olarak etiketlenmiş ve işaretlenmiştir. ILY tedavisi ile RM nişinin tükenmesini takiben, periferik monositler derhal kemik iliği kaynaklı RM'lere farklılaştı ve daha önce9'da tarif edildiği gibi nişi etkili bir şekilde yeniden doldurdu. Bu rejenerasyon, kritik bir şekilde CX3CR1/CX3CL1 sinyal eksenine bağlıydı ve RM popülasyonu9'un hem bakımı hem de restorasyonundaki temel rolünün altını çizdi. Ayrıca, farklı glikolitik kapasiteleri nedeniyle, embriyonik kökenli RM'lerin bağışıklık komplekslerini temizlemek için daha yüksek bir kapasiteye sahip olduğunu ve kemik iliği kaynaklı RM'lere göre bağışıklık zorluklarına daha duyarlı olduklarını gösteriyoruz9.

Bu çalışmada, RM'lerin seçici ablasyonu için ayrıntılı bir protokol sunulduğunda, ILY uygulamasını takiben Cre ile indüklenebilir hCD59 (ihCD59) aracılı hızlı hücre ablasyonu kullanılarak rejenerasyonları araştırılmıştır. ILY enjeksiyonu, CX3CR1CreER +/-/ihCD59 +/-  bileşik farelerde şartlı ve spesifik olarak hCD59'u eksprese eden RM'lerin hedefli ablasyonuna neden oldu. Ablasyondan sonra, akış sitometrisi kullanarak makrofaj dinamik değişikliklerini izledik ve makrofajların hızlı bir şekilde tükendiğini ve ardından RM'lerin rejenerasyonunu bulduk. Rekombinant ILY, E. coli BL21 (DE3) hücrelerinde eksprese edildi ve nikel-NTA afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı. Rekombinant ILY'nin saflığı ve işlevselliği, karakteristik kolesterole bağımlı sitolizin aktivitesini gösteren SDS-PAGE, spektrofotometri ve bir hemoliz testi ile doğrulandı. Farelerdeki RM'leri tüketmek için ILY kullandık ve ILY uygulamasından sonraki 1 gün içinde verimli makrofaj ablasyonu elde ettik. Renal makrofaj rejenerasyonu, ablasyondan sonraki 3. günde başladı ve 7. günde ~% 85 iyileşme ile başladı. Veriler, rejenerasyonun öncelikle monosit alımı tarafından yönlendirildiğini göstermektedir. Bu model, makrofaj biyolojisini incelemek için güçlü bir araç sunar ve böbrek hastalıklarında makrofaj popülasyonlarının hedefli manipülasyonu için terapötik potansiyele sahiptir. ihCD59/ILY hücre ablasyon aracı, böbrek, karaciğer, yağ dokusu ve diğer organlarda hücre fonksiyonunu ve yenilenmesini incelemek için kullanılabilir.

Protokol

Hayvan çalışma protokolleri, Tulane Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (Protokol numarası 1482). 10-12 haftalık ve 25-30 g ağırlığındaki deney fareleri, Cx3cr1CreER+/+ ve ihCD59+/+, üniversitenin hayvan tesisinde belirli patojen içermeyen (SPF) koşullar altında barındırıldı. Böbrek izolasyonunu içeren tüm prosedürler steril bir ortamda, araştırmacıların kontaminasyonu önlemek için eldiven ve yüz maskeleri takmasıyla gerçekleştirildi. Çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosunda bulunabilir.

1. Hayvan hazırlama

  1. Jackson Laboratuvarı'ndan CX3CR1CreER+/+fareler edinin. Fareleri Tulane Üniversitesi Tıp Fakültesi'nde (SOM) belirli bir patojen içermeyen (SPF) tesiste barındırın. Hayvanları kontrollü çevre koşulları ile 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsü altında tutun.
  2. Üreme için C57BL/6 genetik geçmişine sahip önceden oluşturulmuş ihCD59 +/+ fareleri kullanın. Aşağıdaki yavru genotiplerini üretmek için homozigot CX3CR1CreER +/+ fareleri (CX3CR1 ekspresyonunda eksik) ihCD59 +/- farelerle çaprazlayın: CX3CR1CreER+/-/ihCD59-/- ve CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/-.
  3. Anti-CX3CR1 antikoru 9 ile akış sitometrisi analizi ile heterozigot CX3CR1CreER+/- farelerin fonksiyonel CX3CR1 ekspresyonunu koruduğundan, homozigot CX1CreER+/+ farelerin ise CX3CR1 eksikliği olduğundan eminolun.

2. ILY üretimi (14,15'ten türetilmiştir)

  1. Gün 0
    1. -80 ° C'de saklanan pTrcHis-A plazmidinde (Ek Şekil 1) His etiketli ILY dizilerini taşıyan ILY bakteri suşu BL21-DE3-RIPL'in donmuş stoğunu alın. 10 μL bakteri stoğunu 1 μg/mL konsantrasyonda ampisilin içeren 40 μL Luria suyu (LB) ortamına aşılayın.
    2. Aşılanmış karışımı, ampisilin (1 μg/mL) ile takviye edilmiş bir LB agar plakasına yayın. Plakayı gece boyunca 37 °C'de bir bakteri inkübatörde inkübe edin.
  2. 1. Gün
    1. LB agar plakasından altı ayrı koloni seçin. Her koloniyi ampisilin içeren 3.5 mL LB ortamına aşılayın. Kültürleri gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
  3. 2. Gün
    1. Her 3.5 mL başlangıç kültürünü, ampisilin ile desteklenmiş 250 mL LB ortamına aktarın. Bakteri üremesine izin vermek için kültürleri 37 ° C'de 3 saat boyunca 230 x g'da çalkalayarak inkübe edin.
    2. 3 saat sonra, 1 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 1:1000 seyreltmede 1 M'lik bir stok çözeltisinden (-20 ° C'de saklanır) izopropil β-D-1-tiyokalaktopiranosit (IPTG) ekleyin. Protein ekspresyonunu indüklemek için 4 saat daha inkübasyona devam edin.
    3. Boş bir santrifüj şişesini tartın ve ağırlığı kaydedin. İndüklenen kültürün yaklaşık 250 mL'sini santrifüj şişesine aktarın.
    4. Hücreleri 10.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyerek peletleyin. Süpernatanı atın, ardından peleti içeren şişeyi tartın. Santrifüjlemeden sonra boş şişe ağırlığını toplam ağırlıktan çıkararak pelet ağırlığını hesaplayın.
    5. Bakteri peletini daha sonra ILY'nin ekstraksiyonu ve saflaştırılması için -20 °C'de saklayın.
  4. 3. Gün : ILY'nin ekstraksiyonu ve saflaştırılması
    1. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 30 mL Böcek Buster Protein Ekstraksiyon Reaktifini 30 μL benzonaz nükleaz (1200 Kunitz birimi) ve 0.9 μL lizozim (10.000 birim enzimatik aktivite) ile birleştirerek lizis tamponunu hazırlayın.
    2. Lizis tamponunun homojen olduğundan emin olmak için çözeltiyi hafifçe karıştırın. Hazırlanan lizis tamponunu bakteri peletine (2-5 g) ekleyin. Bakteri hücrelerini tamamen yeniden süspanse etmek için karışımı 30-60 saniye boyunca iyice vorteksleyin.
    3. Yeniden süspanse edilmiş çözeltiyi iki 50 mL santrifüj tüpü arasında eşit olarak bölün. Tüpleri buzun üzerine yerleştirin ve 30-90 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, bir orbital çalkalayıcı kullanarak tüpleri hafifçe çalkalayın ve hücre lizizini arttırmak için her 5-10 dakikada bir 10-15 saniye boyunca kısaca girdap yapın.
    4. İnkübasyondan sonra, lizatları 4,900 x g'da 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin.
    5. Önceki kullanımdan kalan reçineyi çıkarmak için 1 mL pipet ucu kullanarak sütunu musluk suyuyla iyice yıkayın.
    6. Sterilize etmek için sütunu% 70 etanol ile durulayın. Kalan etanolü çıkarmak için sütunu 2x-3x'i soğuk ddH2O ile yıkayın. Sütunu tutucuya yerleştirin.
    7. Saflaştırma için sütunu daha fazla yıkamak ve dengelemek için 6-10 mL soğuk ddH2O ekleyin. Sütuna yaklaşık 3 mL reçine boncuk ekleyin. Kolonu 30 hıza ayarlanmış bir peristaltik pompaya bağlayın.
    8. Reçineyi tamamen süspanse etmek ve protein bağlanmasına hazırlamak için 10 mL soğuk ddH2O ekleyin. Reçineyi protein bağlanmasına hazırlamak için reçine boncuklarını 15 mL 1x Şarj Tamponu ile yıkayın.
    9. Santrifüjlemeden sonra bakteriyel lizat süpernatantını taze bir tüpte toplayın ve peletin atıldığından emin olun. Kalan hücresel kalıntıları temizlemek için bir şırınga ile 0.45 μm'lik bir filtre kullanarak süpernatanı filtreleyin.
    10. Filtrelenmiş bakteri lizatının 20-25 mL'sini üç ayrı turda kolondan geçirin. Her geçişten sonra, 20 μL akış toplayın ve daha sonraki optik yoğunluk (OD) ölçümü için PE olarak etiketleyin.
    11. Bağlanmamış proteinleri çıkarmak için kolonu 20-30 mL Bağlayıcı Tampon ile yıkayın. Kolonu 20-30 mL Yıkama Tamponu ile yıkayın. OD ölçümü için 20 μL yıkama fraksiyonu toplayın.
    12. 10-20 mL Elüsyon Tamponu ekleyerek bağlı proteini elute edin. Mikrosantrifüj tüpleri kullanarak 3-4 dakika sonra elüsyonu toplamaya başlayın. 15-17 tüpü doldurarak tüp başına yaklaşık 1 mL toplayın.
    13. Bir spektrofotometre kullanarak A280'deki her bir elüsyon fraksiyonunun absorbansını ölçün. A280 okumaları sırasında Elüsyon Tamponunu boş olarak kullanın. A280'de önemli ölçüde artan emiciliğe sahip tüpleri toplayın, çünkü bunlar tipik olarak tüp 13 etrafındaki fraksiyonlarda bulunan His etiketli ILY proteinini içerir.
    14. ILY proteini içeren elüsyon fraksiyonlarını (veya tüpleri) 4 ° C'de saklayın. Optimum protein stabilitesini sağlamak için ertesi gün içinde daha fazla adımla devam edin.
      NOT: Protein bütünlüğünü korumak için tüm adımları buz üzerinde veya mümkünse 4 °C'de gerçekleştirin.
  5. 4. Gün: Elüsyondan endotoksin uzaklaştırılması
    1. Endotoksin giderici reçine kolonunu 6-10 mL ultra saf su ile durulayın. Akışı düzenlemek için sütuna hafifçe basın.
    2. Bağlı endotoksinleri uzaklaştırmak için sütunu 10 mL% 1 sodyum deoksikolat çözeltisi (taze yapılmış veya 1 aydan eski olmayan) ile durulayın. Kalan deterjanı çıkarmak için sütunu 6-10 mL ultra saf suyla tekrar durulayın.
    3. Hazırlanan protein örneğini reçine kolonuna uygulayın. Optimum endotoksin bağlanmasını sağlamak için numuneyi oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca kolonda inkübe edin.
    4. İlk akış fraksiyonunu toplayın. Daha fazla elüsyon için kolona ddH2O ekleyin ve elüsyonlu fraksiyonları yaklaşık 10 tüpte (tüp başına 1 mL) toplayın.
    5. Reçine kolonunu ileride kullanmak üzere 4 °C'de% 25 etanol içinde saklayın. Verimi ölçmek için ayrıştırılan protein örneklerinin optik yoğunluğunu (OD) ölçün. İlk elüsyon partisinden toplam proteinin yaklaşık% 50 -% 70'ini geri kazanmayı bekleyin.
  6. 5-6. Gün: Diyaliz
    1. 1600 mL damıtılmış, deiyonize suyu (ddH2O) otoklavlayarak 2 L diyaliz tamponu hazırlayın. Otoklavlanmış suya 200 mL 10x PBS, 200 mL gliserol ve 3.5115 g MES (2- (N-morfolino) etansülfonik asit) ekleyin.
    2. Tüm reaktifler tamamen eriyene kadar karışımı manyetik bir karıştırma çubuğu ile karıştırın. Elde edilen tamponu 4 °C'de saklayın.
    3. Depolanan elüsyon fraksiyonlarını diyaliz kitine ekleyin, ardından diyaliz kitindeki havayı bir iğne ile alın. Diyaliz kitini kullanarak protein solüsyonunu 4 ° C'de 24 saat boyunca yaklaşık 2'ye ayarlanmış bir çalkalama hızıyla diyalize edin.
    4. Diyaliz kitini, tampona tamamen daldırıldığından emin olacak şekilde yapılandırın. Diyaliz kitindeki diyaliz tamponunu ertesi gün 2 L'lik bir kapta taze diyaliz tamponu ile değiştirin. Diyalize 24 saat daha devam edin.
    5. Beyaz çökeltiler de dahil olmak üzere tüm çözeltiyi, toplanabilen ILY proteinini korumak için steril bir tüpe dikkatlice aktarın. ILY proteinini, üreticinin santrifüjleme talimatlarını izleyerek bir santrifüj filtre ünitesi kullanarak konsantre edin.
    6. Konsantre ILY proteinini steril tüplerde 200 μL'lik porsiyonlara ayırın. Her tüpü tarih ve adla etiketleyin. Alikotları ileride jel elektroforezi ve hemoliz tahlillerinde kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.

3. SDS-PAGE elektroforezi ile ILY karakterizasyonu

  1. Çalışan arabelleği (20x) ddH2O ile seyrelterek MOPS SDS çalışma arabelleğini (1x) hazırlayın.
  2. 90 μL 6x yükleme tamponunu 10 μL β-merkaptoetanol (β-ME) ile karıştırarak numune tamponunu bir çeker ocakta hazırlayın. Tam homojenizasyonu sağlamak için çözeltiyi iyice karıştırın.
  3. 30 μL'lik bir nihai hacim elde etmek için hazırlanan numuneyi yükleme tamponu ile birleştirin. Numuneleri çözün ve tam karışımı sağlamak için kuvvetlice vorteksleyin.
  4. Proteinleri denatüre etmek için numuneleri 95 °C'de 5 dakika ısıtın. Numuneleri %4-20'lik bir SDS-PAGE jel üzerine yükleyin. Elektroforezi 90 dakika boyunca 80 V'luk sabit bir voltajda çalıştırın.
  5. Jel kasetini dikkatlice açın ve jeli 5 dakika boyunca ddH2O'ya daldırın. Bir çalkalayıcı kullanarak yıkama adımını 2x tekrarlayın.
  6. Jeli Coomassie Brilliant Blue ile oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyayın. Jeli ddH2O'da 30 dakika boyunca yıkayın. Suyu taze ddH2O ile değiştirin ve jeli tamamen lekelenme için gece boyunca 3 gün arasında değişen bir süre boyunca bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
  7. Bir kamera kullanarak lekeli jelin bir görüntüsünü yakalayın (Şekil 1A). Nicel ve nitel değerlendirmeler için ImageJ yazılımını kullanarak jeli analiz edin.

4. ILY aktivitesi için hemolitik test

  1. Saklanan ILY (Intermedilysin) örneklerini oda sıcaklığında tamamen çözdürün. Homojenliği sağlamak için çözülen numuneleri iyice vorteksleyin, çünkü ILY çözüldükten sonra toplanabilir.
  2. Seri seyreltmeler için 96 oyuklu bir plaka ayarlayın. İlk kuyucuğa 160 μL ILY stok çözeltisi (26.7 ng/μL) ekleyin. Aynı satır veya sütundaki sonraki kuyucukların her birine 80 μL 1x PBS ekleyin.
  3. ILY çözeltisinin 80 μL'sini birinci kuyucuktan ikinci kuyucuğa aktarın. Çözeltinin homojen olmasını sağlamak için yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. 80 μL'yi ikinci kuyucuktan üçüncü kuyucuğa aktarın ve iyice karıştırın.
  4. İstenilen seyreltme sayısı hazırlanana kadar 80 μL'yi önceki kuyudan diğerine aktararak her kuyucuk için bu işlemi tekrarlayın. 80 μL'yi son kuyucuğa aktardıktan sonra, plaka boyunca tutarlı hacimler sağlamak için o kuyudan 80 μL'yi atın.

5. İnsan kırmızı kan hücrelerinin (RBC'ler) hazırlanması

  1. EDTA gibi bir antikoagülan içeren bir tüpe 1-2 mL taze insan kanı çekin. Kanı oda sıcaklığında 3.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  2. Süpernatanı atın ve insan RBC peletini süpernatan berraklaşana kadar PBS 2x-3x ile yıkayın. 1:100 seyreltme elde etmek için yıkanmış insan RBC'lerini 900 μL 1x PBS'ye 10 μL RBC ekleyerek seyreltin.
  3. Her kuyucuğa 10 μL seyreltilmiş insan RBC'leri ekleyin. Seyreltme plakasından her bir oyuğa 30 μL seri olarak seyreltilmiş ILY çözeltisi ekleyin. Nihai hacmi kuyu başına 200 μL'ye getirmek için 160 μL 1x PBS ekleyin (başlangıç konsantrasyonu: 4 ng/μL).
  4. Kontrol kuyularına 10 μL seyreltilmiş insan RBC'leri ekleyin. Negatif kontroller için kontrol kuyularına 190 μL su veya 1x PBS ekleyin. Plakaları hafifçe vurarak karıştırın.
  5. Hemolizin oluşmasına izin vermek için plakaları 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Sağlam insan RBC'lerini peletlemek için plakaları 5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin.
  6. Her bir oyuktan 100 μL süpernatanı dikkatlice yeni bir düz tabanlı 96 oyuklu plakaya aktarın. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak süpernatanların emilimini 405 nm'de ölçün.
  7. Numunelerin absorbans değerlerini kontrol16 ile karşılaştırarak ILY'nin hemolitik aktivitesini hesaplayın.

6. Tamoksifen tedavisi, RM tükenmesi ve rejenerasyonu

  1. Mısır yağını önceden 42 °C'ye ısıtın. 20 mg / mL konsantrasyonda bir stok çözeltisi hazırlamak için 100 mg tamoksifeni 5 mL önceden ısıtılmış mısır yağında çözün.
  2. 100 μg / g vücut ağırlığı dozunda 10-12 haftalık erkek CX3CR1CreER +/- / ihCD59 +/- farelere intraperitoneal (ip) tamoksifen uygulayın. Tamoksifen enjeksiyonunu art arda 3 gün boyunca tekrarlayın.
  3. Cre aracılı hCD59 ekspresyonuna izin vermek için son tamoksifen enjeksiyonundan sonra 15 gün bekleyin.
  4. 120 ng / g vücut ağırlığı dozunda CX3CR1CreER +/- / ihCD59 +/- farelere ve CX3CR1CreER +/- / ihCD59-/- littermat kontrollerine intravenöz olarak tek bir doz intermedilizin (ILY) enjekte edin.
  5. ILY uygulamasından 1, 3 ve 7 gün sonra akış sitometrisi yaparak RM ablasyonunu ve müteakip rejenerasyonu izleyin ve onaylayın17.

7. Fare ötenazisi

  1. Hayvanı uygun bir odaya yerleştirin ve IACUC protokollerine uygun olarak izoflurana maruz bırakın. Pedal çekme refleksi gibi reflekslerin olup olmadığını kontrol ederek anesteziyi doğrulayın.
  2. Fare tamamen uyuşturulduğunda ve yanıt vermediğinde, ötenaziyi sağlamak için servikal çıkık yapın. Pedal çekme refleksi gibi reflekslerin olmadığını doğrulayarak ötenaziyi onaylayın.
  3. Steril bir neşter kullanarak karın üzerinde yaklaşık 2 cm'lik bir orta hat kesisi yapın ve göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için cildi nazikçe geri çekin. Kalbi ortaya çıkarmak için künt uçlu cerrahi makas kullanarak göğüs kafesini sternum boyunca açın.
  4. Sol ventriküle 21G-23G iğnesi yerleştirin. Kanı temizlemek için 10-20 mL soğuk PBS ile perfüzyona başlayın.
  5. Kanın dolaşımdan akmasını sağlamak için sağ atriyumu kesin. Böbrekler soluk görünene kadar perfüzyona devam edin, bu da etkili kan temizliğini gösterir.
  6. Böbrekleri sırt vücut duvarına karşı yerleştirin. Forseps ve makas kullanarak böbrekleri çevre dokulardan nazikçe ayırın. Böbrek kapsüllerini eksize edin ve bozulmayı önlemek için böbrekleri hemen soğuk PBS'ye yerleştirin.

8. Böbrek sindirimi

  1. 9 mL HBSS (Ca/Mg içermez), 1 mL kollajenaz IV (5 mg/mL) ve 20 μL DNaz I (10 mg/mL) karıştırarak sindirim enzimi kokteylini hazırlayın. Enzim çözeltisini taze olarak hazırlayın ve kullanana kadar buz üzerinde tutun.
  2. 5 mL HBSS içeren bir Petri kabında steril makas kullanarak böbrekleri küçük parçalara (ideal olarak 1 mm'≤) doğrayın. Böbrek dokusu parçalarını, hazırlanan enzim çözeltisinin 10 mL'sini içeren 15 mL'lik tüplere aktarın.
  3. Dokuyu ayırmak için tüpleri 37 ° C'de 30 dakika boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin. Hücre kümelerini daha da ayırmak için bir pipet veya şırınga pistonu kullanarak dokuyu nazikçe ezin.
  4. Hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek doku kalıntılarını temizleyin. Hücre süspansiyonunu 18 ° C'de 10 dakika boyunca 650 x g'da santrifüjleyin.
  5. Santrifüjlemeden sonra tamponu dikkatlice boşaltın. Peletleri 5 mL lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve kırmızı kan hücrelerini parçalamak için oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  6. Lizis tamponunu çıkarmak için hücreleri PBS ile yıkayın. Elde edilen tek hücreli süspansiyonu daha fazla kullanıma kadar buz üzerinde tutun.

9. Yoğunluk gradyan santrifüjleme

  1. Hematopoietik hücreleri zenginleştirmek için, hücre peletini önceki yıkamadan 10 mL% 30 yoğunluk gradyan çözeltisinde yeniden süspanse edin. Çözeltiyi bir santrifüj tüpünde 3 mL% 70 yoğunluk gradyan çözeltisinin üzerine dikkatlice katmanlayın.
  2. Gradyanı 500 x g'da fren uygulamadan 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, %30 ila %70 çözeltiler arasındaki ara faz katmanını dikkatlice toplayın; Bu katman, zenginleştirilmiş tek hücreleri içerir.
  3. Toplanan hücreleri her seferinde 10 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyerek 10 mL PBS ile 2x yıkayın. Son hücre peletini 1.5 mL'lik bir tüpte 1 mL FACS tamponunda (% 2 FBS ile 1x PBS) yeniden süspanse edin.
  4. Parlak alan mikroskobu altında bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Hücre konsantrasyonunu 2 x 106 hücre / mL'ye ayarlayın.

10. Akış sitometrisi boyama, edinme

  1. Akış sitometrik analizi için fare böbrek dokusundan hazırlanan tek hücreli süspansiyonlardan hücre konsantrasyonunu 2-3 x 106 hücre / mL'ye ayarlayın.
  2. Hücreleri 1.5 mL'lik tüplerde 650 x g'da 5 dakika santrifüjleyerek peletleyin. Hücre peletini 1 mL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
  3. Spesifik olmayan Fc reseptör bağlanmasını bloke etmek için 1:200 seyreltmede anti-CD16 / 32 antikoru ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
  4. Üreticinin talimatlarını izleyerek canlı hücreleri ölü hücrelerden ayırt etmek için Aqua Live/Dead boyasını kullanın.
  5. Hücreleri, CD45-e450, CD11b-PE-Cy7, hCD59-PE ve F4 / 80-BV605 dahil olmak üzere 1: 100 seyreltmede önceden konjuge antikorlarla boyayın. Antikor kokteylini hücre süspansiyonuna ekleyin.
  6. Floroforları foto ağartmadan korumak için numuneyi karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin. Lekeli hücreleri 2x FACS tamponu (% 2 fetal sığır serumu içeren PBS) ile 650 x g'da 5 dakika santrifüjleyerek yıkayın.
  7. Hücreleri buz üzerinde 30 dakika boyunca %1 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin. Artık PFA'yı çıkarmak için sabit hücreleri 2x FACS tamponu ile yıkayın.
  8. Bir akış sitometresi kullanarak lekeli ve sabit hücreler elde edin. Yazılımı kullanarak verileri analiz edin.
  9. Böbrek ve diğer dokuda yerleşik makrofajları ve mikrogliaları CD45, CD11b ve F4 / 80 belirteçlerini kullanarak9'da tarif edildiği gibi tanımlayın.
  10. İleri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) profillerine dayalı olarak canlı hücreleri seçmek için ilk geçitleme işlemini gerçekleştirin. İleri saçılma yüksekliğine (FSC-H) karşı ileri saçılma alanı (FSC-A) üzerinde geçit yaparak çiftleri ortadan kaldırın. CANLI/ÖLÜ canlılık boyasını kullanarak ölü hücreleri hariç tutun.
  11. CD45+ popülasyonları üzerinde geçit yaparak bağışıklık hücrelerini zenginleştirin. Böbrekte yerleşik makrofajları, geçit stratejisinde gösterildiği gibi, CD45+ popülasyonu içinde CD11b+F4/80++ hücreleri olarak tanımlayın (Şekil 2A).
  12. Mikroglia popülasyonlarını CD11b+CD45iⁿt hücreleri olarak tanımlayın (Şekil 2B). Akış sitometresinde veri toplama işlemini gerçekleştirin. Akış sitometrik çalışmasını tamamlamak için yazılımı kullanarak son analizi yapın.

Sonuçlar

His-Tag rekombinant ILY'nin saflaştırılması, daha önce14'te tarif edilenle aynı protokolü izledi. ILY, E. coli BL21 (DE3) hücrelerinde başarılı bir şekilde eksprese edildi ve Streptococcus intermedius'tan ILY genini kodlayan bir plazmit ile dönüştürüldü. IPTG ile indüksiyon üzerine, hedef proteinin aşırı ekspresyonu belirgindi. Ekspresyon sonrası, ILY, nikel-NTA afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı ve spe...

Tartışmalar

Bu çalışmada His etiketli rekombinant ILY'nin başarılı ekspresyonu, saflaştırılması ve fonksiyonel validasyonu, iyi kurulmuş bir protokolü takip etmiştir15. Bununla birlikte, süreç, yüksek protein verimi, saflık ve biyolojik aktivite sağlayan birkaç kritik adımı içeriyordu. IPTG ile E. coli BL21 (DE3) hücrelerinin indüksiyonu, inklüzyon cisimciği oluşumunu en aza indirirken protein ekspresyon sev...

Açıklamalar

Yazarlar, bu yazıda rapor edilen çalışmayı etkilemiş gibi görünebilecek hiçbir rekabet eden mali çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan ederler. Finansal, finansal olmayan, profesyonel veya kişisel bağlantılar dahil olmak üzere hiçbir çıkar çatışması, çalışmanın tasarımını, yürütülmesini, yorumlanmasını veya sunumunu etkilememiştir.

Teşekkürler

Bu çalışmada kullanılan protokollerin geliştirilmesi ve iyileştirilmesine katkılarından dolayı Qin Lab'ın hem geçmiş hem de mevcut üyelerine şükranlarımızı sunuyoruz. Ayrıca, Dr. RK Tweten'in Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi'ndeki grubuna, bu araştırmada etkili olan rekombinant ILY plazmidini cömertçe sağladıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından NIH 5 P51OD011104-58, R01DK129881 (X.Q.) ve R21OD024931 (X.Q.) hibesi ile desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 µm syringe filterMilliporeSLHVR33RS
4-15% TGX Stain-Free Protein GelsBio-Rad4568084
6X Loading bufferFisher50-103-6570
70% EthanolWWR Life Science64-17-5
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing BufferGibcoA1049201
Affinity resin beadsMillipore69670
Ampicillin sodium solutionZymo ResearchA1001-5
Anti-CD11b-PE-Cy7 (Clone M1/70)Invitrogen25-0112-82
Anti-CD16/32 (FcγRIII/II, Clone 93)eBioscience48-0161-80
Anti-CD45-e450 (Clone 30-F11)eBioscience48-0451-82
Anti-F4/80-BV605(Clone BM8)BioLegend 123133
Anti-hCD59-PE (Clone OV9A2)Invitrogen12-0596-42
Aqua Live/Dead dyeInvitrogen    L34957A
Beads (resin)Millipore69670
Benzonase NucleaseMillipore70664-10KUN
BugBuster protein extraction reagentMillipore70584-4
Centrifuge for microtubesEppendorf5424
Centrifuge for tubesThermo Scientific75-001-241
Collagenase type IVWorthington Biochemical CorporationLS004188
Corn oilSigma AldrichC8267
Deoxyribonuclease (DNAse) IWorthington Biochemical CorporationLS002007
Detoxi-Gel resin columnMillipore69670
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) solutionCorning21-031-CV
EDTA tubesBD365974
FBS (Fetal bovine serum)Gibco10082-139
GlycerolFisherBP229-1
HBSS (Hank’s Ballanced Salt Solution)Gibco24020117
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) Millipore-Sigma206-703-0
IsofluraneVET one502017
LB media
LSRFortessa flow cytometerBD Biosciences
MES [2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid]Fisher50-488-796
MOPS [3-(N-morpholino) propanesulfonic acid]Fisher50-213-522
Percoll density gradient mediaCytiva17089101
Peristaltic pumpFisher ScientificDiscontinued now, use alternative
PFA (Paraformaldehyde)Thermo ScientificI28800
Purification columnMilliporeUFC900308
rLysozyme solutionNovagen20C71110
Shaking water bath Thermo ScientificTSSB15
Slide-A-Lyzer dialysis kitThermo66107
Sodium deoxycholateFisherBP349-100Fresh made or less than a month
Sterile cell strainer (40 μm)Fisher Scientific22-363-547
TamoxifenSigma Aldrich6734
Ultra centrifugal filterMilliporeUFC900308
Ultrapure waterThermo10977-015
Vortex mixerFisher Scientific2215365
β-ME (β-mercaptoethanol)FisherBP176-100

Referanslar

  1. Epelman, S., Lavine, K. J., Randolph, G. J. Origin and functions of tissue macrophages. Immunity. 41 (1), 21-35 (2014).
  2. Nelson, P. J. et al. The renal mononuclear phagocytic system. J Am Soc Nephrol. 23 (2), 194-203 (2012).
  3. Wang, Y., Harris, D. C. Macrophages in renal disease. J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).
  4. Islamuddin, M., Qin, X. Renal macrophages and NLRP3 inflammasomes in kidney diseases and therapeutics. Cell Death Discov. 10 (1), 229 (2024).
  5. Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
  6. Mily, A. et al. Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection. J Vis Exp. (163), 61807 (2020).
  7. Huen, S. C., Cantley, L. G. Macrophages in Renal Injury and Repair. Annu Rev Physiol. 79, 449-469 (2017).
  8. Tang, P. M., Nikolic-Paterson, D. J., Lan, H. Y. Macrophages: versatile players in renal inflammation and fibrosis. Nat Rev Nephrol. 15 (3), 144-158 (2019).
  9. Liu, F. et al. Distinct fate, dynamics and niches of renal macrophages of bone marrow or embryonic origins. Nat Commun. 11 (1), 2280 (2020).
  10. Chew, C. et al. Kidney resident macrophages have distinct subsets and multifunctional roles. Matrix Biol. 127, 23-37 (2024).
  11. Cheung, M. D. et al. Resident macrophage subpopulations occupy distinct microenvironments in the kidney. JCI Insight. 7 (20), 161078 (2022).
  12. Epelman, S. et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  13. Feng, D. et al. Cre-inducible human CD59 mediates rapid cell ablation after intermedilysin administration. J Clin Invest. 126 (6), 2321-2333 (2016).
  14. Hu, W. et al. Rapid conditional targeted ablation of cells expressing human CD59 in transgenic mice by intermedilysin. Nat Med. 14 (1), 98-103 (2008).
  15. Giddings, K. S., Zhao, J., Sims, P. J., Tweten, R. K. Human CD59 is a receptor for the cholesterol-dependent cytolysin intermedilysin. Nat Struct Mol Biol. 11 (12), 1173-1178 (2004).
  16. Parkhurst, C. N. et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  17. Cao, Q., Harris, D. C., Wang, Y. Macrophages in kidney injury, inflammation, and fibrosis. Physiology. 30 (3), 183-194 (2015).
  18. Li, G. et al. The role of macrophages in fibrosis of chronic kidney disease. Biomed Pharmacother. 177, 117079 (2024).
  19. Liu, F. et al. Versatile cell ablation tools and their applications to study loss of cell functions. Cell Mol Life Sci. 76 (23), 4725-4743 (2019).
  20. Yashchenko, A. et al. Cx3cr1 controls kidney resident macrophage heterogeneity. Front Immunol. 14, 1082078 (2023).
  21. Duffield, J. S. Macrophages and immunologic inflammation of the kidney. Semin Nephrol. 30 (3), 234-254 (2010).
  22. Lee, S. et al. Distinct macrophage phenotypes contribute to kidney injury and repair. J Am Soc Nephrol. 22 (2), 317-326 (2011).
  23. Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in Tissue Repair, Regeneration, and Fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
  24. Guo, C. et al. Crosstalk between proximal tubular epithelial cells and other interstitial cells in tubulointerstitial fibrosis after renal injury. Front Endocrinol. 14, 1256375 (2023).
  25. Guillot, A. et al. Bile acid-activated macrophages promote biliary epithelial cell proliferation through integrin αvβ6 upregulation following liver injury. J Clin Invest. 131 (9), 132305 (2021).
  26. Kim, S. J. et al. Adipocyte Death Preferentially Induces Liver Injury and Inflammation Through the Activation of Chemokine (C-C Motif) Receptor 2-Positive Macrophages and Lipolysis. Hepatology. 69 (5), 1965-1982 (2019).
  27. Saxena, V. et al. Generation of Atp6v1g3-Cre mice for investigation of intercalated cells and the collecting duct. Am J Physiol Renal Physiol. 325 (6), F770-f778 (2023).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarSay 219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır