Depleção rápida de macrófagos renais usando a ferramenta de ablação de células CD59/Intermedilisina humana

Resumo

Um protocolo é relatado aqui para a ablação seletiva de macrófagos renais para estudar sua regeneração usando a ferramenta de ablação de células CD59/intermedilisina humana. Este método também é aplicável para estudar a função e regeneração de outras populações de células no rim, fígado e tecido adiposo.

Resumo

Os macrófagos renais (MRs) são essenciais para a saúde renal, orquestrando a vigilância imunológica, a homeostase tecidual e as respostas à lesão. Anteriormente, relatamos o uso de uma ferramenta de ablação de células CD59 (hCD59) / intermedilisina (ILY) humana para estudar o destino, a dinâmica e os nichos distintos de MRs de medula óssea ou origem embrionária. As MRs se originam de macrófagos derivados do saco vitelino, monócitos do fígado fetal e monócitos derivados da medula óssea e são mantidos na idade adulta por meio da proliferação local e recrutamento de monócitos circulantes. Aqui, relatamos um protocolo detalhado para a ablação seletiva de MRs para estudar sua regeneração, incluindo 1) geração e caracterização da expressão de hCD59 induzida por CR em RMs de camundongos, 2) purificação de ILY e caracterização da atividade de ILY, 3) indução da expressão de hCD59 em RMs em camundongos compostos e 4) caracterização da regeneração após ablação de RM mediada por ILY. O ILY esgota específica e rapidamente os MRs em camundongos compostos, com ablação eficiente de macrófagos dentro de 1 dia após a administração de ILY. A regeneração renal dos macrófagos começou no dia 3 após a ablação, com ~ 88% de recuperação no dia 7. Este modelo oferece uma ferramenta poderosa para estudar a biologia dos macrófagos e pode ser usado para ablação seletiva de outras populações de células nos rins, fígado e tecidos adiposos para investigar sua função e regeneração.

Introdução

Os macrófagos renais (MRs) são células imunes essenciais que mantêm a homeostase renal, regulam as respostas imunes e promovem o reparo tecidual após a lesão. Eles desempenham uma variedade de funções, incluindo fagocitose, apresentação de antígenos e orquestração de respostas inflamatórias e anti-inflamatórias ^1,2,3. Dependendo do ambiente local, os MRs podem se polarizar em fenótipos pró-inflamatórios (M1) ou anti-inflamatórios (M2), exacerbando a lesão ou facilitando a cicatrização ^4,5,6. A desregulação dos MRs tem sido implicada no aparecimento e progressão da lesão renal aguda (LRA) e da doença renal crônica (DRC), tornando-os atores críticos na saúde e patologia renal ^7,8. Os MRs surgem de várias fontes, incluindo macrófagos derivados do saco vitelino durante a embriogênese, monócitos do fígado fetal e monócitos derivados da medula óssea na idade adulta. Os MRs se expandem e amadurecem paralelamente ao crescimento renal pós-natal, originando-se principalmente de monócitos hepáticos fetais antes do nascimento, com automanutenção até a idade adulta complementada por monócitos periféricos⁹. Em adultos, os monócitos circulantes são recrutados para o rim por sinais homeostáticos ou de lesão, diferenciando-se em macrófagos sob influências microambientais locais. A manutenção da RM é sustentada por meio de proliferação local e reposição periódica de monócitos circulantes 9,10,11,12.

Demonstramos anteriormente o uso do sistema de ablação celular CD59 humano (hCD59) / intermedilisina (ILY) como uma ferramenta^13,14 para investigar os destinos distintos, dinâmicas e nichos microambientais de MRs derivados da medula óssea ou de origens embrionárias⁹. ILY lisa seletivamente células humanas em segundos, formando poros em membranas celulares direcionadas¹⁵. Essa especificidade decorre da afinidade de ligação exclusiva do LIY para o CD59 humano (hCD59), sem interação ou efeito lítico em células de outras espécies sem esse receptor¹⁵. Com base nesse conceito, projetamos uma ferramenta que permite a ablação rápida, condicional e direcionada de células humanas que expressam CD59 em modelos de camundongos transgênicos por meio da aplicação de intermedilisina (ILY)¹⁴. Para facilitar o uso dessa ferramenta, desenvolvemos um modelo de ablação celular condicional e direcionada gerando camundongos knockin STOP-CD59 floxed (ihCD59), nos quais a expressão de CD59 humano ocorre apenas após a recombinação mediada por Cre¹³. Anteriormente, foi encontrado o gene CX3CR1cre-EFP expresso exclusivamente em CD11bintF480hi, definido como macrófagos renais⁹. Portanto, usamos as linhas CX3CR1CreER2^+/+  para cruzar com camundongos ihCD59 para expressar hCD59 em macrófagos renais. Geramos com sucesso camundongos compostos com o genótipo ihCD59^+/-/CX3CR1CreER^+/-9 (+/-, +/+ e -/- indicam os camundongos transgênicos homozigotos, hemizigotos e não portadores, respectivamente). Administração de tamoxifeno em camundongos compostos ihCD59^+/-/CX3CR1CreER^+/- condicionalmente marcados e marcados com RMs pela expressão de hCD59⁹. Após a depleção do nicho de RM por meio do tratamento com ILY, os monócitos periféricos prontamente se diferenciaram em MRs derivados da medula óssea, repovoando efetivamente o nicho conforme descrito anteriormente em⁹. Essa regeneração foi criticamente dependente do eixo de sinalização CX3CR1 / CX3CL1, ressaltando seu papel essencial na manutenção e restauração da população de MR⁹. Também mostramos que, devido às suas capacidades glicolíticas distintas, os MRs de origem embrionária têm maior capacidade de eliminar complexos imunes e são mais sensíveis a desafios imunológicos do que os MRs derivados da medula óssea⁹.

Apresentamos um protocolo detalhado para a ablação seletiva de RMs para investigar sua regeneração usando ablação celular rápida mediada por hCD59 (ihCD59) induzível por Cre após a administração de ILY. A injeção de ILY causou a ablação direcionada de RMs que expressam condicional e especificamente hCD59 em camundongos CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- composto. Após a ablação, monitoramos as mudanças dinâmicas dos macrófagos usando citometria de fluxo e encontramos rápida depleção de macrófagos seguida pela regeneração de RMs. A ILY recombinante foi expressa em células E . coli BL21 (DE3) e purificada usando cromatografia de afinidade níquel-NTA. A pureza e a funcionalidade da ILY recombinante foram confirmadas por SDS-PAGE, espectrofotometria e um ensaio de hemólise, demonstrando sua atividade característica de citolisina dependente de colesterol. Usamos ILY para esgotar os RMs nos camundongos, alcançando uma ablação eficiente de macrófagos dentro de 1 dia após a administração de ILY. A regeneração renal dos macrófagos começou no dia 3 após a ablação, com recuperação de ~ 85% no dia 7. Os dados sugerem que a regeneração é impulsionada principalmente pelo recrutamento de monócitos. Este modelo oferece uma ferramenta poderosa para estudar a biologia de macrófagos e tem potencial terapêutico para a manipulação direcionada de populações de macrófagos em doenças renais. A ferramenta de ablação celular ihCD59/ILY pode ser usada para estudar a função e regeneração celular no rim, fígado, tecido adiposo e outros órgãos.

Protocolo

Os protocolos de estudo em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Tulane University, School of Medicine (Protocolo número 1482). Os camundongos experimentais, Cx3cr1CreER^+/+ e ihCD59^+/+, com idades entre 10 e 12 semanas e pesando 25-30 g, foram alojados em condições específicas livres de patógenos (FPS) no biotério da universidade. Todos os procedimentos envolvendo isolamento renal foram realizados em ambiente estéril, com os pesquisadores usando luvas e máscaras faciais para evitar contaminação. Detalhes sobre os reagentes e equipamentos utilizados no estudo podem ser encontrados na Tabela de Materiais.

1. Preparação animal

1. Obtenha CX3CR1CreER^+/+ratos do Laboratório Jackson. Alojar os camundongos na Escola de Medicina da Universidade de Tulane (SOM) em uma instalação específica livre de patógenos (SPF). Manter os animais em um ciclo claro/escuro de 12 h com condições ambientais controladas.
2. Use camundongos ihCD59 + / + gerados anteriormente com um fundo genético C57BL / 6 para reprodução. Cruze camundongos CX3CR1CreER^+/+ homozigotos (deficientes na expressão de CX3CR1) com camundongos ihCD59^+/- para produzir os seguintes genótipos descendentes: CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^-/- e CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/-.
3. Certifique-se de que os camundongos CX3CR1CreER^+/- heterozigotos retenham a expressão funcional de CX3CR1, enquanto os camundongos CX3CR1CreER^+/+ homozigotos são deficientes em CX3CR1 por análise de citometria de fluxo com anticorpo anti-CX3CR1⁹.

2. Produção de ILY (derivada de^14,15 )

1. Dia 0
   1. Recuperar a massa congelada da estirpe bacteriana ILY BL21-DE3-RIPL portadora de sequências ILY marcadas com His no plasmídeo pTrcHis-A (figura suplementar 1) armazenadas a -80 °C. Inocular 10 μL do estoque bacteriano em 40 μL de meio de caldo Luria (LB) contendo ampicilina na concentração de 1 μg / mL.
   2. Espalhar a mistura inoculada numa placa de ágar-LB suplementada com ampicilina (1 μg/ml). Incubar a placa durante a noite a 37 °C numa incubadora bacteriana.
2. Dia 1
   1. Selecione seis colônias individuais da placa de ágar LB. Inocular cada colónia em 3,5 ml de meio LB contendo ampicilina. Incubar as culturas durante a noite a 37 °C.
3. Dia 2
   1. Transfira cada cultura inicial de 3,5 mL para 250 mL de meio LB suplementado com ampicilina. Incubar as culturas a 37 °C durante 3 h com agitação a 230 x g para permitir o crescimento bacteriano.
   2. Após 3 h, adicionar β-D-1-tiogalactopiranosídeo isopropílico (IPTG) a partir de uma solução-mãe 1 M (conservada a -20 °C) a uma diluição de 1:1000 para atingir uma concentração final de 1 mM. Continue a incubação por mais 4 h para induzir a expressão da proteína.
   3. Pese um frasco de centrífuga vazio e registre o peso. Transfira aproximadamente 250 mL da cultura induzida para o frasco da centrífuga.
   4. Pulverizar as células centrifugando a 10.000 x g durante 15 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e pesar o frasco que contém o sedimento. Calcule o peso do pellet subtraindo o peso da garrafa vazia do peso total após a centrifugação.
   5. Armazenar o sedimento bacteriano a -20 °C para posterior extração e purificação de ILY.
4. Dia 3: Extração e purificação de ILY
   1. Prepare o tampão de lise combinando 30 mL de reagente de extração de proteína Bug Buster com 30 μL de nuclease benzonase (1200 unidades Kunitz) e 0,9 μL de lisozima (10.000 unidades de atividade enzimática) em um tubo de centrífuga de 50 mL.
   2. Misture a solução suavemente para garantir que o tampão de lise seja homogêneo. Adicione o tampão de lise preparado ao pellet bacteriano (2-5 g). Vortex a mistura completamente por 30-60 s para ressuspender totalmente as células bacterianas.
   3. Divida a solução ressuspensa igualmente entre dois tubos de centrifugação de 50 ml. Coloque os tubos no gelo e incube por 30-90 min. Durante a incubação, agite suavemente os tubos usando um agitador orbital e um vórtice brevemente a cada 5-10 minutos por 10-15 s para aumentar a lise celular.
   4. Após a incubação, centrifugue os lisados a 4.900 x g por 30 min a 4 °C.
   5. Lave bem a coluna com água da torneira usando uma ponta de pipeta de 1 mL para remover qualquer resina restante do uso anterior.
   6. Enxágue a coluna com etanol 70% para higienizá-la. Lavar a coluna 2x-3x com ddH₂O frio para remover qualquer etanol residual. Coloque a coluna no suporte.
   7. Adicione 6-10 mL de ddH₂O frio para lavar e equilibrar ainda mais a coluna para purificação. Adicione aproximadamente 3 mL de grânulos de resina à coluna. Conecte a coluna a uma bomba peristáltica ajustada para uma velocidade de 30.
   8. Adicione 10 mL de ddH₂O frio para suspender totalmente a resina e prepará-la para a ligação às proteínas. Lave as esferas de resina com 15 mL de 1x Charging Buffer para preparar a resina para a ligação às proteínas.
   9. Colete o sobrenadante do lisado bacteriano após centrifugação em um tubo novo, garantindo que o pellet seja descartado. Filtrar o sobrenadante utilizando um filtro de 0,45 μm com uma seringa para remover quaisquer restos celulares remanescentes.
   10. Passe 20-25 mL do lisado bacteriano filtrado pela coluna em três rodadas separadas. Após cada passagem, colete 20 μL do fluxo e rotule-o como PE para medição posterior da densidade óptica (OD).
   11. Lave a coluna com 20-30 mL de tampão de ligação para remover as proteínas não ligadas. Lave a coluna com 20-30 mL de tampão de lavagem. Colete 20 μL da fração de lavagem para medição de OD.
   12. Eluir a proteína ligada adicionando 10-20 mL de tampão de eluição. Comece a coletar a eluição após 3-4 min usando tubos de microcentrífuga. Colete aproximadamente 1 mL por tubo, enchendo 15-17 tubos.
   13. Medir a absorvância de cada fracção de eluição em A280 utilizando um espectrofotómetro. Use o tampão de eluição como o branco durante as leituras de A280. Colete os tubos com absorbância dramaticamente aumentada em A280, pois eles contêm a proteína ILY marcada com His que é normalmente encontrada em frações ao redor do tubo 13.
   14. Conservar as fracções de eluição (ou tubos) contendo a proteína ILY a 4 °C. Prossiga com outras etapas no dia seguinte para garantir a estabilidade ideal da proteína.
       NOTA: Execute todas as etapas no gelo ou a 4 ° C sempre que possível para manter a integridade da proteína.
5. Dia 4: Remoção de endotoxinas da eluição
   1. Enxágue a coluna de resina removedora de endotoxinas com 6-10 mL de água ultrapura. Pressione suavemente a coluna para regular o fluxo.
   2. Enxágue a coluna com 10 mL de solução de desoxicolato de sódio a 1% (recém-fabricada ou não mais de 1 mês) para remover as endotoxinas ligadas. Enxágue a coluna novamente com 6-10 mL de água ultrapura para remover qualquer detergente residual.
   3. Aplicar a amostra de proteínas preparada na coluna de resina. Incube a amostra na coluna por 1 h à temperatura ambiente (RT) para permitir a ligação ideal da endotoxina.
   4. Recolha a fração de escoamento inicial. Adicione ddH₂O à coluna para eluição adicional e colete as frações eluídas em aproximadamente 10 tubos (1 mL por tubo).
   5. Armazene a coluna de resina em etanol a 25% a 4 °C para uso futuro. Meça a densidade óptica (OD) das amostras de proteína eluída para quantificar o rendimento. Espere recuperar aproximadamente 50% -70% da proteína total do primeiro lote de eluição.
6. Dia 5-6: Diálise
   1. Prepare 2 L de tampão de diálise autoclavando 1600 mL de água destilada e deionizada (ddH₂O). Adicione 200 mL de 10x PBS, 200 mL de glicerol e 3,5115 g de MES (ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico) à água autoclavada.
   2. Mexa a mistura com uma barra de agitação magnética até que todos os reagentes estejam completamente dissolvidos. Conservar o tampão resultante a 4 °C.
   3. Adicione as frações de eluição armazenadas ao kit de diálise e, em seguida, remova o ar do kit de diálise com uma agulha. Diálise
   4. Configure o kit de diálise para garantir que ele esteja totalmente submerso no tampão. Substitua o tampão de diálise no kit de diálise por um novo tampão de diálise em um recipiente de 2 L no dia seguinte. Continue a diálise por mais 24 horas.
   5. Transfira cuidadosamente toda a solução, incluindo quaisquer precipitados brancos, para um tubo estéril para preservar a proteína ILY, que pode se agregar. Concentrar a proteína ILY utilizando uma unidade de filtro centrífugo, seguindo as instruções do fabricante para centrifugação.
   6. Alíquota da proteína ILY concentrada em porções de 200 μL em tubos estéreis. Rotule cada tubo com a data e o nome. Armazenar as alíquotas a -80 °C para utilização futura em ensaios de electroforese em gel e hemólise.

3. Caracterização de ILY por eletroforese SDS-PAGE

1. Prepare o buffer de corrida MOPS SDS (1x) diluindo o buffer de corrida (20x) com ddH₂O.
2. Preparar o tampão de amostra numa hotte misturando 90 μL de tampão de carga 6x com 10 μL de β-mercaptoetanol (β-ME). Misturar bem a solução para assegurar uma homogeneização completa.
3. Combine a amostra preparada com o tampão de carregamento para obter um volume final de 30 μL. Descongele as amostras e vortexe-as vigorosamente para garantir uma mistura completa.
4. Aqueça as amostras a 95 °C por 5 min para desnaturar as proteínas. Carregue as amostras em um gel SDS-PAGE de 4% a 20%. Execute a eletroforese a uma tensão constante de 80 V por 90 min.
5. Abra cuidadosamente o de gel e mergulhe o gel em ddH₂O por 5 min. Repita a etapa de lavagem 2x usando um shaker.
6. Manchar o gel com Coomassie Brilliant Blue por 1 h em temperatura ambiente (RT). Lave o gel por 30 min em ddH₂O. Substitua a água por ddH₂O fresco e incube o gel em um agitador por um período que varia de uma noite a 3 dias para uma descoloração completa.
7. Capture uma imagem do gel corado usando uma câmera (Figura 1A). Analise o gel usando o software ImageJ para avaliações quantitativas e qualitativas.

4. Ensaio hemolítico para atividade de ILY

1. Descongele as amostras ILY (Intermedilisina) armazenadas completamente à temperatura ambiente. Vortex as amostras descongeladas completamente para garantir a homogeneidade, pois o ILY pode agregar após o descongelamento.
2. Configure uma placa de 96 poços para diluições em série. Adicione 160 μL da solução estoque ILY (26,7 ng/μL) ao primeiro poço. Adicione 80 μL de 1x PBS a cada um dos poços subsequentes na mesma linha ou coluna.
3. Transferir 80 μL da solução ILY do primeiro poço para o segundo poço. Misture bem pipetando para cima e para baixo para garantir que a solução seja homogênea. Transferir 80 μL do segundo alvéolo para o terceiro alvéolo e homogeneizar.
4. Repita este processo para cada poço, transferindo 80 μL do poço anterior para o próximo até que o número desejado de diluições seja preparado. Depois de transferir 80 μL para o último poço, descarte 80 μL desse poço para garantir volumes consistentes na placa.

5. Preparação de glóbulos vermelhos humanos (hemácias)

1. Retire 1-2 mL de sangue humano fresco em um tubo contendo um anticoagulante, como o EDTA. Centrifugue o sangue à temperatura ambiente a 3.000 x g por 5 min.
2. Rejeitar o sobrenadante e lavar o sedimento de hemácias humanas com PBS 2x-3x até que o sobrenadante esteja límpido. Dilua as hemácias humanas lavadas adicionando 10 μL de hemácias a 900 μL de 1x PBS para obter uma diluição de 1:100.
3. Adicione 10 μL das hemácias humanas diluídas a cada poço. Adicionar 30 μl da solução de ILY diluída em série da placa de diluição a cada alvéolo. Adicione 160 μL de 1x PBS para trazer o volume final para 200 μL por poço (concentração inicial: 4 ng/μL).
4. Adicione 10 μL das hemácias humanas diluídas aos alvéolos de controle. Adicione 190 μL de água ou 1x PBS aos poços de controle para controles negativos. Misture os pratos batendo suavemente neles.
5. Incubar as placas a 37 °C durante 30 min para permitir a ocorrência de hemólise. Centrifugue as placas a 3.000 x g por 5 min para peletar quaisquer hemácias humanas intactas.
6. Transfira cuidadosamente 100 μL do sobrenadante de cada poço para uma nova placa de fundo plano de 96 poços. Medir a absorvância dos sobrenadantes a 405 nm utilizando um leitor de microplacas.
7. Calcular a atividade hemolítica da ILY comparando os valores de absorbância das amostras com o controle¹⁶.

6. Tratamento com tamoxifeno, depleção de RM e regeneração

1. Pré-aqueça o óleo de milho a 42 °C. Dissolva 100 mg de tamoxifeno em 5 mL de óleo de milho pré-aquecido para preparar uma solução estoque com concentração de 20 mg / mL.
2. Administrar tamoxifeno por via intraperitoneal (i.p.) a ratinhos CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- machos com 10-12 semanas de idade na dose de 100 μg/g de peso corporal. Repita a injeção de tamoxifeno por 3 dias consecutivos.
3. Aguarde 15 dias após a injeção final de tamoxifeno para permitir a expressão de hCD59 mediada por Cre.
4. Injete uma dose única de intermedilisina (ILY) por via intravenosa em camundongos CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- e controles CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^-/- irmãos de ninhada na dose de 120 ng/g de peso corporal.
5. Monitore e confirme a ablação por RM e a regeneração subsequente realizando citometria de fluxo 1, 3 e 7 dias após a administração de ILY¹⁷.

7. Eutanásia de camundongos

1. Coloque o animal em uma câmara apropriada e exponha-o ao isoflurano de acordo com os protocolos da IACUC. Verifique a anestesia verificando a ausência de reflexos, como o reflexo de retirada do pedal.
2. Assim que o camundongo estiver totalmente anestesiado e sem resposta, realize a luxação cervical para garantir a eutanásia. Confirme a eutanásia verificando a ausência de reflexos, como o reflexo de retirada do pedal.
3. Faça uma incisão na linha média de aproximadamente 2 cm no abdômen usando um bisturi estéril e retraia suavemente a pele para expor a cavidade torácica. Abra a caixa torácica ao longo do esterno usando uma tesoura cirúrgica de ponta romba para expor o coração.
4. Insira uma agulha 21G-23G no ventrículo esquerdo. Comece a perfusão com 10-20 mL de PBS frio para eliminar o sangue.
5. Abra o átrio direito para permitir que o sangue seja drenado da circulação. Continue a perfusão até que os rins pareçam pálidos, indicando uma depuração sanguínea eficaz.
6. Localize os rins contra a parede dorsal do corpo. Separe suavemente os rins dos tecidos circundantes usando uma pinça e uma tesoura. Extirpar as cápsulas renais e colocar imediatamente os rins em PBS frio para evitar a degradação.

8. Digestão renal

1. Prepare o coquetel de enzimas de digestão misturando 9 mL de HBSS (livre de Ca / Mg), 1 mL de colagenase IV (5 mg / mL) e 20 μL de DNase I (10 mg / mL). Prepare a solução enzimática fresca e mantenha-a no gelo até o uso.
2. Pique os rins em pequenos fragmentos (idealmente ≤ 1 mm) usando uma tesoura estéril em uma placa de Petri contendo 5 mL de HBSS. Transfira os fragmentos de tecido renal para tubos de 15 mL contendo 10 mL da solução enzimática preparada.
3. Incubar os tubos a 37 °C durante 30 min com agitação suave para dissociar o tecido. Triture o tecido suavemente usando uma pipeta ou êmbolo de seringa para dissociar ainda mais os aglomerados de células.
4. Remover os restos de tecido passando a suspensão celular através de um filtro de células de 40 μm. Centrifugar a suspensão da célula a 650 x g durante 10 min a 18 °C.
5. Decantar cuidadosamente o tampão após centrifugação. Ressuspenda o pellet em 5 mL de tampão de lise e incube por 5 min em temperatura ambiente para lisar os glóbulos vermelhos.
6. Lave as células com PBS para remover o tampão de lise. Mantenha a suspensão unicelular resultante no gelo até uso posterior.

centrifugação do inclinação 9.Density

1. Para enriquecer as células hematopoiéticas, ressuspenda o pellet celular da lavagem anterior em 10 mL de solução de gradiente de densidade a 30%. Coloque cuidadosamente a solução em camadas sobre 3 mL de solução de gradiente de densidade a 70% em um tubo de centrífuga.
2. Centrifugue o gradiente a 500 x g por 30 min sem aplicar um freio. Após a centrifugação, colete cuidadosamente a camada interfásica entre as soluções de 30% e 70%; Esta camada contém as células individuais enriquecidas.
3. Lave as células coletadas 2x com 10 mL de PBS centrifugando a 500 x g por 10 min de cada vez. Ressuspenda o pellet celular final em 1 mL de tampão FACS (1x PBS com 2% de FBS) em um tubo de 1,5 mL.
4. Conte as células usando um hemocitômetro sob um microscópio de campo claro. Ajuste a concentração da célula para 2 x 10⁶ células / mL.

10. Coloração por citometria de fluxo, aquisição

1. Ajuste a concentração celular de suspensões unicelulares preparadas a partir de tecido renal de camundongo para 2-3 x 10⁶ células/mL para análise por citometria de fluxo.
2. Pellet as células em tubos de 1,5 mL centrifugando a 650 x g por 5 min. Ressuspenda o pellet celular em 1 mL de tampão FACS.
3. Adicione o anticorpo anti-CD16/32 em uma diluição de 1:200 para bloquear a ligação não específica do receptor Fc. Incube as células por 15 min em temperatura ambiente.
4. Use o corante Aqua Live/Dead para distinguir as células vivas das mortas, seguindo as instruções do fabricante.
5. Corar as células com anticorpos pré-conjugados em uma diluição de 1:100, incluindo CD45-e450, CD11b-PE-Cy7, hCD59-PE e F4/80-BV605. Adicione o coquetel de anticorpos à suspensão celular.
6. Incubar a amostra durante 30 min a 4 °C no escuro para proteger os fluoróforos do fotobranqueamento. Lave as células coradas 2x com tampão FACS (PBS com soro bovino fetal a 2%) centrifugando a 650 x g por 5 min.
7. Fixe as células em paraformaldeído a 1% (PFA) por 30 min no gelo. Lave as células fixas 2x com tampão FACS para remover o PFA residual.
8. Adquira células coradas e fixas usando um citômetro de fluxo. Analise os dados usando o software.
9. Identifique os macrófagos e micróglias renais e outros tecidos residentes usando os marcadores CD45, CD11b e F4/80, conforme descrito em⁹ .
10. Execute o gating inicial para selecionar células vivas com base nos perfis de dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC). Elimine os dupletos bloqueando a área de dispersão direta (FSC-A) versus a altura de dispersão direta (FSC-H). Exclua as células mortas usando o corante de viabilidade LIVE/DEAD.
11. Enriqueça as células imunológicas bloqueando as populações CD45+. Defina macrófagos residentes nos rins como células CD11b + F4 / 80 ++ dentro da população CD45 +, conforme mostrado na estratégia de gating (Figura 2A).
12. Defina as populações de microglia como células CD11b + CD45ⁱⁿt (Figura 2B). Realize a aquisição de dados no citômetro de fluxo. Realize a análise final usando o software para concluir o estudo de citometria de fluxo.

Resultados

A purificação da ILY recombinante His-Tag seguiu o mesmo protocolo descrito anteriormente em¹⁴. ILY foi expresso com sucesso em células E. coli BL21 (DE3), transformadas com um plasmídeo que codifica o gene ILY de Streptococcus intermedius. Após a indução com IPTG, a superexpressão da proteína alvo foi evidente. Após a expressão, ILY foi purificada usando cromatografia de afinidade níquel-NTA, explorando uma etiqueta His C-terminal pa...

Discussão

A expressão, purificação e validação funcional bem-sucedidas da ILY recombinante marcada com His neste estudo seguiram um protocolo bem estabelecido¹⁵. No entanto, o processo envolveu várias etapas críticas que garantiram alto rendimento de proteína, pureza e atividade biológica. A indução de células E . coli BL21 (DE3) com IPTG foi otimizada para equilibrar os níveis de expressão de proteínas, minimizando a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm syringe filter	Millipore	SLHVR33RS
4-15% TGX Stain-Free Protein Gels	Bio-Rad	4568084
6X Loading buffer	Fisher	50-103-6570
70% Ethanol	WWR Life Science	64-17-5
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer	Gibco	A1049201
Affinity resin beads	Millipore	69670
Ampicillin sodium solution	Zymo Research	A1001-5
Anti-CD11b-PE-Cy7 (Clone M1/70)	Invitrogen	25-0112-82
Anti-CD16/32 (FcγRIII/II, Clone 93)	eBioscience	48-0161-80
Anti-CD45-e450 (Clone 30-F11)	eBioscience	48-0451-82
Anti-F4/80-BV605(Clone BM8)	BioLegend	123133
Anti-hCD59-PE (Clone OV9A2)	Invitrogen	12-0596-42
Aqua Live/Dead dye	Invitrogen	L34957A
Beads (resin)	Millipore	69670
Benzonase Nuclease	Millipore	70664-10KUN
BugBuster protein extraction reagent	Millipore	70584-4
Centrifuge for microtubes	Eppendorf	5424
Centrifuge for tubes	Thermo Scientific	75-001-241
Collagenase type IV	Worthington Biochemical Corporation	LS004188
Corn oil	Sigma Aldrich	C8267
Deoxyribonuclease (DNAse) I	Worthington Biochemical Corporation	LS002007
Detoxi-Gel resin column	Millipore	69670
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) solution	Corning	21-031-CV
EDTA tubes	BD	365974
FBS (Fetal bovine serum)	Gibco	10082-139
Glycerol	Fisher	BP229-1
HBSS (Hank’s Ballanced Salt Solution)	Gibco	24020117
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)	Millipore-Sigma	206-703-0
Isoflurane	VET one	502017
LB media
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences
MES [2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid]	Fisher	50-488-796
MOPS [3-(N-morpholino) propanesulfonic acid]	Fisher	50-213-522
Percoll density gradient media	Cytiva	17089101
Peristaltic pump	Fisher Scientific		Discontinued now, use alternative
PFA (Paraformaldehyde)	Thermo Scientific	I28800
Purification column	Millipore	UFC900308
rLysozyme solution	Novagen	20C71110
Shaking water bath	Thermo Scientific	TSSB15
Slide-A-Lyzer dialysis kit	Thermo	66107
Sodium deoxycholate	Fisher	BP349-100	Fresh made or less than a month
Sterile cell strainer (40 μm)	Fisher Scientific	22-363-547
Tamoxifen	Sigma Aldrich	6734
Ultra centrifugal filter	Millipore	UFC900308
Ultrapure water	Thermo	10977-015
Vortex mixer	Fisher Scientific	2215365
β-ME (β-mercaptoethanol)	Fisher	BP176-100