Agotamiento rápido de macrófagos renales utilizando la herramienta de ablación celular humana CD59/Intermedilysin

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para la ablación selectiva de macrófagos renales con el fin de estudiar su regeneración utilizando la herramienta de ablación celular CD59/intermedilisina humana. Este método también es aplicable para estudiar la función y la regeneración de las otras poblaciones celulares en el riñón, el hígado y el tejido graso.

Resumen

Los macrófagos renales (RM) son esenciales para la salud renal, ya que orquestan la vigilancia inmunitaria, la homeostasis de los tejidos y las respuestas a las lesiones. Anteriormente, informamos sobre el uso de una herramienta de ablación de células humanas CD59 (hCD59)/intermedilisina (ILY) para estudiar el destino, la dinámica y los nichos distintivos de las RM de origen embrionario o de médula ósea. Los RM se originan a partir de macrófagos derivados del saco vitelino, monocitos hepáticos fetales y monocitos derivados de la médula ósea y se mantienen en la edad adulta a través de la proliferación local y el reclutamiento de monocitos circulantes. Aquí, reportamos un protocolo detallado para la ablación selectiva de RMs para estudiar su regeneración, incluyendo 1) la generación y caracterización de la expresión inducible de Cre-inducible de hCD59 en RMs de ratón, 2) la purificación de ILY y la caracterización de la actividad de ILY, 3) la inducción de la expresión de hCD59 en RMs en ratones compuestos, y 4) la caracterización de la regeneración después de la ablación de RM mediada por ILY. ILY agota específica y rápidamente los RM en ratones compuestos, con una ablación eficiente de macrófagos dentro de 1 día de la administración de ILY. La regeneración de los macrófagos renales comenzó el día 3 después de la ablación, con una recuperación de ~88% el día 7. Este modelo ofrece una poderosa herramienta para estudiar la biología de los macrófagos y se puede utilizar para ablar selectivamente otras poblaciones celulares en el riñón, el hígado y los tejidos grasos para investigar su función y regeneración.

Introducción

Los macrófagos renales (RM) son células inmunitarias esenciales que mantienen la homeostasis renal, regulan las respuestas inmunitarias y promueven la reparación de tejidos después de una lesión. Realizan una variedad de funciones, incluyendo la fagocitosis, la presentación de antígenos y la orquestación de respuestas inflamatorias y antiinflamatorias ^1,2,3. Dependiendo del entorno local, los RM pueden polarizarse en fenotipos proinflamatorios (M1) o antiinflamatorios (M2), ya sea exacerbando la lesión o facilitando la curación ^4,5,6. La desregulación de los RM se ha implicado en la aparición y progresión de la lesión renal aguda (IRA) y la enfermedad renal crónica (ERC), lo que los convierte en actores críticos en la salud y la patología renal ^7,8. Los RM surgen de varias fuentes, incluidos los macrófagos derivados del saco vitelino durante la embriogénesis, los monocitos hepáticos fetales y los monocitos derivados de la médula ósea en la edad adulta. Los RM se expanden y maduran en paralelo con el crecimiento renal postnatal, originándose principalmente en los monocitos hepáticos fetales antes del nacimiento, con automantenimiento hasta la edad adulta complementado por monocitos periféricos⁹. En los adultos, los monocitos circulantes son reclutados por el riñón mediante señales homeostáticas o de lesión, diferenciándose en macrófagos bajo las influencias microambientales locales. El mantenimiento de la RM se sostiene a través de la proliferación local y la reposición periódica de los monocitos circulantes 9,10,11,12.

Previamente demostramos el uso del sistema de ablación celular humano CD59 (hCD59)/intermedilisina (ILY) como herramienta^13,14 para investigar los distintos destinos, dinámicas y nichos microambientales de las RM derivadas de la médula ósea o de origen embrionario⁹. ILY lisa selectivamente células humanas en cuestión de segundos mediante la formación de poros en las membranas celulares objetivo¹⁵. Esta especificidad surge de la afinidad de unión exclusiva de ILY por CD59 humano (hCD59), sin interacción ni efecto lítico sobre células de otras especies que carecen de este receptor¹⁵. Sobre la base de este concepto, diseñamos una herramienta que permite la ablación rápida, condicional y dirigida de células humanas que expresan CD59 en modelos de ratones transgénicos mediante la aplicación de intermedilisina (ILY)¹⁴. Para facilitar el uso de esta herramienta, desarrollamos un modelo de ablación celular condicional y dirigida mediante la generación de ratones knockin STOP-CD59 floxados (ihCD59), en los que la expresión de CD59 humano solo ocurre después de la recombinación mediada por Cre¹³. Previamente, se encontró el gen CX3CR1cre-EFP expresado exclusivamente en CD11bintF480hi, definidos como macrófagos renales⁹. Por lo tanto, utilizamos las líneas CX3CR1CreER2^+/+  para cruzarlas con ratones ihCD59 para expresar hCD59 en macrófagos renales. Generamos con éxito ratones compuestos con el genotipo ihCD59^+/-/CX3CR1CreER^+/-9 (+/-, +/+ y -/- indican los ratones homocigotos, hemizigotos y transgénicos no portadores, respectivamente). Administración de tamoxifeno en ratones con el compuesto ihCD59^+/-/CX3CR1CreER^+/- marcados condicionalmente y RMs marcados por la expresión de hCD59⁹. Tras el agotamiento del nicho de RM mediante el tratamiento con ILY, los monocitos periféricos se diferenciaron rápidamente en RM derivados de la médula ósea, repoblando efectivamente el nicho como se describió anteriormente en⁹. Esta regeneración dependió críticamente del eje de señalización CX3CR1/CX3CL1, lo que subraya su papel esencial tanto en el mantenimiento como en la restauración de la población de RM⁹. También demostramos que, debido a sus distintas capacidades glucolíticas, los RM de origen embrionario tienen una mayor capacidad para eliminar complejos inmunes y son más sensibles a los desafíos inmunológicos que los RM derivados de la médula ósea⁹.

Presentamos un protocolo detallado para la ablación selectiva de RMs con el fin de investigar su regeneración mediante la ablación celular rápida mediada por Cre-inducible hCD59 (ihCD59) tras la administración de ILY. La inyección de ILY provocó la ablación dirigida de RMs que expresan condicional y específicamente hCD59 en ratones CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/--.  Después de la ablación, monitoreamos los cambios dinámicos de los macrófagos mediante citometría de flujo y encontramos un rápido agotamiento de los macrófagos seguido de la regeneración de los RM. El ILY recombinante se expresó en células de E. coli BL21(DE3) y se purificó mediante cromatografía de afinidad de níquel-NTA. La pureza y funcionalidad del ILY recombinante se confirmaron mediante SDS-PAGE, espectrofotometría y un ensayo de hemólisis, demostrando su actividad característica de citolisina dependiente del colesterol. Utilizamos ILY para agotar los RM en los ratones, logrando una ablación eficiente de macrófagos dentro de 1 día de la administración de ILY. La regeneración de los macrófagos renales comenzó el día 3 después de la ablación, con una recuperación de ~85% el día 7. Los datos sugieren que la regeneración está impulsada principalmente por el reclutamiento de monocitos. Este modelo ofrece una poderosa herramienta para estudiar la biología de los macrófagos y tiene potencial terapéutico para la manipulación dirigida de las poblaciones de macrófagos en las enfermedades renales. La herramienta de ablación celular ihCD59/ILY se puede utilizar para estudiar la función celular y la regeneración en el riñón, el hígado, el tejido graso y otros órganos.

Protocolo

Los protocolos de estudio en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Tulane (Protocolo número 1482). Los ratones experimentales, Cx3cr1CreER^+/+ e ihCD59^+/+, de 10 a 12 semanas de edad y con un peso de 25 a 30 g, se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) en el animalario de la universidad. Todos los procedimientos relacionados con el aislamiento renal se llevaron a cabo en un ambiente estéril, y los investigadores usaron guantes y máscaras faciales para evitar la contaminación. Los detalles sobre los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se pueden encontrar en la Tabla de Materiales.

1. Preparación animal

1. Obtén ratones CX3CR1CreER^+/+ del Laboratorio Jackson. Aloje a los ratones en la Facultad de Medicina de la Universidad de Tulane (SOM) en una instalación específica libre de patógenos (SPF). Mantener a los animales bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con condiciones ambientales controladas.
2. Utilice ratones ihCD59+/+ generados previamente con un fondo genético C57BL/6 para la cría. Cruza ratones homocigotos CX3CR1CreER^+/+ (deficientes en la expresión de CX3CR1) con ratones ihCD59^+/- para producir los siguientes genotipos de descendencia: CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^-/-y CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/-.
3. Asegúrese de que los ratones heterocigotos CX3CR1CreER^+/- conserven la expresión funcional de CX3CR1, mientras que los ratones homocigotos CX3CR1CreER^+/+ son deficientes en CX3CR1 mediante análisis de citometría de flujo con anticuerpo Anti-CX3CR1⁹.

2. Producción ILY (derivado de^14,15 )

1. Día 0
   1. Recuperar existencias congeladas de la cepa bacteriana ILY BL21-DE3-RIPL portadora de secuencias ILY marcadas con His en el plásmido pTrcHis-A (Figura suplementaria 1) almacenado a -80 °C. Inocular 10 μL del stock bacteriano en 40 μL de medio de caldo Luria (LB) que contenga ampicilina a una concentración de 1 μg/mL.
   2. Extienda la mezcla inoculada sobre una placa de agar LB suplementada con ampicilina (1 μg/mL). Incubar la placa durante la noche a 37 °C en una incubadora bacteriana.
2. Día 1
   1. Seleccione seis colonias individuales de la placa de agar LB. Inocular cada colonia en 3,5 mL de medio LB que contenga ampicilina. Incubar los cultivos durante la noche a 37 °C.
3. Día 2
   1. Transfiera cada cultivo iniciador de 3,5 mL a 250 mL de medio LB suplementado con ampicilina. Incubar los cultivos a 37 °C durante 3 h con agitación a 230 x g para permitir el crecimiento bacteriano.
   2. Después de 3 h, añadir isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) de una solución madre de 1 M (almacenada a -20 °C) en una dilución de 1:1000 para lograr una concentración final de 1 mM. Continúe la incubación durante 4 h adicionales para inducir la expresión de proteínas.
   3. Pese una botella de centrífuga vacía y registre el peso. Transfiera aproximadamente 250 mL del cultivo inducido a la botella de centrífuga.
   4. Granular las células centrifugando a 10.000 x g durante 15 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante, luego pese la botella que contiene el pellet. Calcule el peso del pellet restando el peso de la botella vacía del peso total después de la centrifugación.
   5. Almacene el pellet bacteriano a -20 °C para su posterior extracción y purificación de ILY.
4. Día 3 : Extracción y purificación de ILY
   1. Prepare el tampón de lisis combinando 30 ml de reactivo de extracción de proteínas Bug Buster con 30 μL de benzonasa nucleasa (1200 unidades de Kunitz) y 0,9 μL de lisozima (10.000 unidades de actividad enzimática) en un tubo de centrífuga de 50 mL.
   2. Mezcle la solución suavemente para asegurarse de que el tampón de lisis sea homogéneo. Añadir el tampón de lisis preparado al pellet bacteriano (2-5 g). Agite la mezcla a fondo durante 30-60 s para resuspender completamente las células bacterianas.
   3. Divida la solución resuspendida en partes iguales entre dos tubos de centrífuga de 50 ml. Coloque los tubos en hielo e incube durante 30-90 min. Durante la incubación, agite suavemente los tubos con un agitador orbital y un vórtice brevemente cada 5-10 minutos durante 10-15 s para mejorar la lisis celular.
   4. Después de la incubación, centrifugar los lisados a 4.900 x g durante 30 min a 4 °C.
   5. Lave la columna a fondo con agua del grifo con una punta de pipeta de 1 ml para eliminar cualquier resto de resina del uso anterior.
   6. Enjuague la columna con etanol al 70% para desinfectarla. Lave la columna 2x-3x con ddH₂O frío para eliminar cualquier etanol residual. Coloque la columna en el soporte.
   7. Añadir 6-10 mL de ddH₂O en frío para seguir lavando y equilibrar la columna para la purificación. Añade aproximadamente 3 mL de perlas de resina a la columna. Conecte la columna a una bomba peristáltica ajustada a una velocidad de 30.
   8. Añadir 10 mL de ddH₂O frío para suspender completamente la resina y prepararla para la unión de proteínas. Lava las perlas de resina con 15 ml de 1x tampón de carga para preparar la resina para la unión de proteínas.
   9. Recoja el sobrenadante de lisado bacteriano después de la centrifugación en un tubo nuevo, asegurándose de que se deseche el pellet. Filtre el sobrenadante con un filtro de 0,45 μm con una jeringa para eliminar cualquier residuo celular restante.
   10. Pase 20-25 mL del lisado bacteriano filtrado a través de la columna en tres rondas separadas. Después de cada pasada, recoja 20 μL del flujo y etiquételo como P.E. para la medición posterior de la densidad óptica (OD).
   11. Lave la columna con 20-30 ml de tampón de unión para eliminar las proteínas no unidas. Lave la columna con 20-30 mL de tampón de lavado. Recoja 20 μL de la fracción de lavado para la medición de OD.
   12. Eluir la proteína unida añadiendo 10-20 mL de tampón de elución. Comience a recoger la elución después de 3-4 minutos utilizando tubos de microcentrífuga. Recoja aproximadamente 1 ml por tubo, llenando de 15 a 17 tubos.
   13. Mida la absorbancia de cada fracción de elución en A280 utilizando un espectrofotómetro. Utilice el tampón de elución como blanco durante las lecturas de A280. Recoja los tubos con una absorbancia drásticamente aumentada en A280, ya que contienen la proteína ILY marcada con His que generalmente se encuentra en fracciones alrededor del tubo 13.
   14. Almacene las fracciones de elución (o tubos) que contienen la proteína ILY a 4 °C. Continúe con los pasos adicionales al día siguiente para garantizar una estabilidad óptima de la proteína.
       NOTA: Realice todos los pasos en hielo o a 4 °C siempre que sea posible para mantener la integridad de la proteína.
5. Día 4: Eliminación de endotoxinas de la elución
   1. Enjuague la columna de resina que elimina endotoxinas con 6-10 ml de agua ultrapura. Presione suavemente la columna para regular el flujo.
   2. Enjuague la columna con 10 mL de solución de desoxicolato de sodio al 1% (recién hecha o no más de 1 mes) para eliminar las endotoxinas unidas. Vuelva a enjuagar la columna con 6-10 ml de agua ultrapura para eliminar cualquier residuo de detergente.
   3. Aplique la muestra de proteína preparada a la columna de resina. Incubar la muestra en la columna durante 1 h a temperatura ambiente (RT) para permitir una unión óptima de endotoxinas.
   4. Recoja la fracción de flujo inicial. Agregue ddH₂O a la columna para una mayor elución y recoja las fracciones eluidas en aproximadamente 10 tubos (1 mL por tubo).
   5. Almacene la columna de resina en etanol al 25% a 4 °C para su uso futuro. Mida la densidad óptica (O.D.) de las muestras de proteínas eluidas para cuantificar el rendimiento. Espere recuperar aproximadamente el 50%-70% de la proteína total del primer lote de elución.
6. Día 5-6: Diálisis
   1. Prepare 2 L de tampón de diálisis esterilizando en autoclave 1600 mL de agua destilada y desionizada (ddH₂O). Agregue 200 mL de PBS 10x, 200 mL de glicerol y 3,5115 g de MES (ácido etanosulfónico 2-(N-morfolino)) al agua esterilizada en autoclave.
   2. Agite la mezcla con una barra magnética hasta que todos los reactivos se hayan disuelto por completo. Almacene el tampón resultante a 4 °C.
   3. Agregue las fracciones de elución almacenadas al kit de diálisis, luego elimine el aire del kit de diálisis con una aguja. Diálisis de la solución proteica con el kit de diálisis durante 24 h a 4 °C con una velocidad de agitación ajustada a aproximadamente 2.
   4. Configure el kit de diálisis para asegurarse de que esté completamente sumergido en el tampón. Al día siguiente, sustituya el tampón de diálisis del kit de diálisis por un tampón de diálisis nuevo en un recipiente de 2 L. Continuar la diálisis durante 24 h adicionales.
   5. Transfiera con cuidado toda la solución, incluidos los precipitados blancos, a un tubo estéril para preservar la proteína ILY, que puede agregarse. Concentre la proteína ILY utilizando una unidad de filtro centrífugo, siguiendo las instrucciones del fabricante para la centrifugación.
   6. Alícuota de la proteína ILY concentrada en porciones de 200 μL en tubos estériles. Etiquete cada tubo con la fecha y el nombre. Almacene las alícuotas a -80 °C para su uso futuro en ensayos de electroforesis en gel y hemólisis.

3. Caracterización de ILY por electroforesis SDS-PAGE

1. Prepare el tampón de ejecución de MOPS SDS (1x) diluyendo el tampón de ejecución (20x) con ddH₂O.
2. Prepare el tampón de muestra en una campana extractora mezclando 90 μL de tampón de carga 6x con 10 μL de β-mercaptoetanol (β-ME). Mezcle bien la solución para asegurar una homogeneización completa.
3. Combine la muestra preparada con el tampón de carga para lograr un volumen final de 30 μL. Descongele las muestras y vórtelas vigorosamente para asegurar una mezcla completa.
4. Calentar las muestras a 95 °C durante 5 min para desnaturalizar las proteínas. Cargue las muestras en un gel SDS-PAGE al 4%-20%. Ejecute la electroforesis a un voltaje constante de 80 V durante 90 min.
5. Abra con cuidado el casete de gel y sumerja el gel en ddH₂O durante 5 min. Repita el paso de lavado 2 veces con una coctelera.
6. Teñir el gel con Coomassie Brilliant Blue durante 1 h a temperatura ambiente (RT). Lave el gel durante 30 minutos en ddH₂O. Reemplace el agua con ddH₂O fresco e incube el gel en un agitador durante un período que oscila entre toda la noche y 3 días para eliminar completamente las manchas.
7. Capture una imagen del gel teñido con una cámara (Figura 1A). Analice el gel con el software ImageJ para evaluaciones cuantitativas y cualitativas.

4. Ensayo hemolítico para la actividad ILY

1. Descongele las muestras almacenadas de ILY (Intermedilysin) completamente a temperatura ambiente. Agite minuciosamente las muestras descongeladas para garantizar la homogeneidad, ya que ILY puede agregarse al descongelarse.
2. Configure una placa de 96 pocillos para diluciones en serie. Agregue 160 μL de la solución madre ILY (26,7 ng/μL) al primer pocillo. Agregue 80 μL de 1x PBS a cada uno de los pocillos subsiguientes en la misma fila o columna.
3. Transfiera 80 μL de la solución ILY del primer pocillo al segundo pocillo. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que la solución sea homogénea. Transfiera 80 μL del segundo pocillo al tercer pocillo y mezcle bien.
4. Repita este proceso para cada pocillo, transfiriendo 80 μL del pocillo anterior al siguiente hasta que se prepare el número deseado de diluciones. Después de transferir 80 μL al último pocillo, deseche 80 μL de ese pocillo para garantizar volúmenes consistentes en toda la placa.

5. Preparación de glóbulos rojos humanos (RBC)

1. Extraiga de 1 a 2 ml de sangre humana fresca en un tubo que contenga un anticoagulante, como EDTA. Centrifugar la sangre a temperatura ambiente a 3.000 x g durante 5 min.
2. Deseche el sobrenadante y lave el gránulo de glóbulos rojos humanos con PBS 2x-3x hasta que el sobrenadante esté claro. Diluya los glóbulos rojos humanos lavados añadiendo 10 μL de glóbulos rojos a 900 μL de 1x PBS para lograr una dilución de 1:100.
3. Agregue 10 μL de los glóbulos rojos humanos diluidos a cada pocillo. Añadir 30 μL de la solución ILY diluida en serie de la placa de dilución a cada pocillo. Agregue 160 μL de PBS 1x para llevar el volumen final a 200 μL por pocillo (concentración inicial: 4 ng/μL).
4. Añada 10 μl de los glóbulos rojos humanos diluidos a los pocillos de control. Agregue 190 μL de agua o 1x PBS a los pozos de control para controles negativos. Mezcle los platos golpeándolos suavemente.
5. Incubar las placas a 37 °C durante 30 min para permitir que se produzca la hemólisis. Centrifugar las placas a 3.000 x g durante 5 minutos para pellet cualquier glóbulo rojo humano intacto.
6. Transfiera con cuidado 100 μL del sobrenadante de cada pocillo a una nueva placa de fondo plano de 96 pocillos. Mida la absorbancia de los sobrenadantes a 405 nm utilizando un lector de microplacas.
7. Calcular la actividad hemolítica de ILY comparando los valores de absorbancia de las muestras con los del control¹⁶.

6. Tratamiento con tamoxifeno, agotamiento y regeneración de RM

1. Precalienta el aceite de maíz a 42 °C. Disuelva 100 mg de tamoxifeno en 5 mL de aceite de maíz precalentado para preparar una solución madre con una concentración de 20 mg/mL.
2. Administrar tamoxifeno por vía intraperitoneal (i.p.) a ratones machos CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- de 10-12 semanas de edad a una dosis de 100 μg/g de peso corporal. Repita la inyección de tamoxifeno durante 3 días consecutivos.
3. Espere 15 días después de la última inyección de tamoxifeno para permitir la expresión de hCD59 mediada por Cre.
4. Inyecte una dosis única de intermedilisina (ILY) por vía intravenosa en ratones CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- y controles CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^-/- a una dosis de 120 ng/g de peso corporal.
5. Monitorizar y confirmar la ablación de RM y su posterior regeneración mediante la realización de citometría de flujo a los 1, 3 y 7 días post-ILY¹⁷.

7. Eutanasia de ratones

1. Coloque al animal en una cámara apropiada y exponga al isoflurano de acuerdo con los protocolos de la IACUC. Verifique la anestesia verificando la ausencia de reflejos, como el reflejo de retirada del pedal.
2. Una vez que el ratón esté completamente anestesiado y no responda, realice la luxación cervical para asegurar la eutanasia. Confirmar la eutanasia verificando la ausencia de reflejos, como el reflejo de retirada del pedal.
3. Realice una incisión en la línea media de aproximadamente 2 cm en el abdomen con un bisturí estéril y retraiga suavemente la piel para exponer la cavidad torácica. Abra la caja torácica a lo largo del esternón con unas tijeras quirúrgicas de punta roma para exponer el corazón.
4. Inserte una aguja 21G-23G en el ventrículo izquierdo. Comience la perfusión con 10-20 ml de PBS frío para eliminar la sangre.
5. Corta la aurícula derecha para permitir que la sangre drene de la circulación. Continúe la perfusión hasta que los riñones se vean pálidos, lo que indica una eliminación efectiva de la sangre.
6. Ubica los riñones contra la pared dorsal del cuerpo. Separe suavemente los riñones de los tejidos circundantes con pinzas y tijeras. Extraiga las cápsulas de riñón e inmediatamente coloque los riñones en PBS frío para evitar la degradación.

8. Digestión renal

1. Prepare el cóctel de enzimas para la digestión mezclando 9 mL de HBSS (libre de Ca/Mg), 1 mL de colagenasa IV (5 mg/mL) y 20 μL de DNasa I (10 mg/mL). Prepare la solución enzimática fresca y manténgala en hielo hasta su uso.
2. Picar los riñones en fragmentos diminutos (idealmente ≤ 1 mm) con tijeras estériles en una placa de Petri que contenga 5 mL de HBSS. Transfiera los fragmentos de tejido renal a tubos de 15 mL que contengan 10 mL de la solución enzimática preparada.
3. Incubar los tubos a 37 °C durante 30 min con una suave agitación para disociar el tejido. Triture el tejido suavemente con una pipeta o un émbolo de jeringa para disociar aún más los grupos de células.
4. Elimine los restos de tejido pasando la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 μm. Centrifugar la suspensión de la célula a 650 x g durante 10 min a 18 °C.
5. Decantar cuidadosamente el tampón después de la centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en 5 mL de tampón de lisis e incube durante 5 min a temperatura ambiente para lisar los glóbulos rojos.
6. Lave las células con PBS para eliminar el tampón de lisis. Mantenga la suspensión de una sola celda resultante en hielo hasta su uso posterior.

9. Centrifugación en gradiente de densidad

1. Para enriquecer las células hematopoyéticas, vuelva a suspender el pellet celular del lavado anterior en 10 mL de solución de gradiente de densidad al 30%. Coloque cuidadosamente la solución en capas sobre 3 mL de solución de gradiente de densidad al 70% en un tubo de centrífuga.
2. Centrifugar el gradiente a 500 x g durante 30 min sin aplicar un freno. Después de la centrifugación, recoja cuidadosamente la capa de interfase entre las soluciones al 30% y al 70%; Esta capa contiene las células individuales enriquecidas.
3. Lave las células recolectadas 2 veces con 10 mL de PBS centrifugando a 500 x g durante 10 min cada vez. Vuelva a suspender el pellet de celda final en 1 mL de tampón FACS (1x PBS con 2% de FBS) en un tubo de 1,5 mL.
4. Cuente las células usando un hemocitómetro bajo un microscopio de campo claro. Ajuste la concentración de células a 2 x 10⁶ células/mL.

10. Tinción por citometría de flujo, adquisición

1. Ajuste la concentración celular de suspensiones unicelulares preparadas a partir de tejido renal de ratón a 2-3 x 10⁶ células/mL para el análisis de citometría de flujo.
2. Granular las células en tubos de 1,5 mL centrifugando a 650 x g durante 5 min. Vuelva a suspender el pellet de celda en 1 mL de tampón FACS.
3. Agregue el anticuerpo anti-CD16/32 en una dilución de 1:200 para bloquear la unión al receptor Fc no específico. Incubar las células durante 15 minutos a temperatura ambiente.
4. Use el tinte Aqua Live/Dead para distinguir las células vivas de las muertas, siguiendo las instrucciones del fabricante.
5. Tiñir las células con anticuerpos preconjugados en una dilución de 1:100, incluidos CD45-e450, CD11b-PE-Cy7, hCD59-PE y F4/80-BV605. Agregue el cóctel de anticuerpos a la suspensión celular.
6. Incubar la muestra durante 30 min a 4 °C en la oscuridad para proteger los fluoróforos del fotoblanqueo. Lavar las células teñidas 2 veces con tampón FACS (PBS con 2% de suero fetal bovino) centrifugando a 650 x g durante 5 min.
7. Fije las células en paraformaldehído (PFA) al 1% durante 30 minutos en hielo. Lave las celdas fijas 2 veces con tampón FACS para eliminar el PFA residual.
8. Adquiera células teñidas y fijadas utilizando un citómetro de flujo. Analice los datos utilizando el software.
9. Identificar los macrófagos renales y otros tejidos residentes en el tejido y la microglía utilizando los marcadores CD45, CD11b y F4/80 como se describe en⁹ .
10. Realice la compuerta inicial para seleccionar celdas activas en función de los perfiles de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC). Elimine los dobletes mediante la compuerta en el área de dispersión hacia adelante (FSC-A) frente a la altura de dispersión hacia adelante (FSC-H). Excluya las células muertas utilizando el tinte de viabilidad VIVO/MUERTO.
11. Enriquezca las células inmunitarias al dirigirse a las poblaciones CD45+. Defina los macrófagos residentes en el riñón como células CD11b+F4/80++ dentro de la población CD45+, como se muestra en la estrategia de compuerta (Figura 2A).
12. Defina las poblaciones de microglía como células CD11b+CD45ⁱⁿt (Figura 2B). Realice la adquisición de datos en el citómetro de flujo. Realizar el análisis final utilizando el software para completar el estudio de citometría de flujo.

Resultados

La purificación de His-Tag recombinante ILY siguió el mismo protocolo descrito anteriormente en¹⁴. ILY se expresó con éxito en células BL21 (DE3) de E . coli , transformadas con un plásmido que codifica el gen ILY de Streptococcus intermedius. Tras la inducción con IPTG, la sobreexpresión de la proteína diana fue evidente. Después de la expresión, ILY se purificó mediante cromatografía de afinidad de níquel-NTA, explotando una etiqu...

Discusión

El éxito de la expresión, purificación y validación funcional de ILY recombinante marcado con His en este estudio siguió un protocolo bien establecido¹⁵. Sin embargo, el proceso implicaba varios pasos críticos que garantizaban un alto rendimiento de proteínas, pureza y actividad biológica. La inducción de células de E. coli BL21 (DE3) con IPTG se optimizó para equilibrar los niveles de expresión de proteínas y...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm syringe filter	Millipore	SLHVR33RS
4-15% TGX Stain-Free Protein Gels	Bio-Rad	4568084
6X Loading buffer	Fisher	50-103-6570
70% Ethanol	WWR Life Science	64-17-5
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer	Gibco	A1049201
Affinity resin beads	Millipore	69670
Ampicillin sodium solution	Zymo Research	A1001-5
Anti-CD11b-PE-Cy7 (Clone M1/70)	Invitrogen	25-0112-82
Anti-CD16/32 (FcγRIII/II, Clone 93)	eBioscience	48-0161-80
Anti-CD45-e450 (Clone 30-F11)	eBioscience	48-0451-82
Anti-F4/80-BV605(Clone BM8)	BioLegend	123133
Anti-hCD59-PE (Clone OV9A2)	Invitrogen	12-0596-42
Aqua Live/Dead dye	Invitrogen	L34957A
Beads (resin)	Millipore	69670
Benzonase Nuclease	Millipore	70664-10KUN
BugBuster protein extraction reagent	Millipore	70584-4
Centrifuge for microtubes	Eppendorf	5424
Centrifuge for tubes	Thermo Scientific	75-001-241
Collagenase type IV	Worthington Biochemical Corporation	LS004188
Corn oil	Sigma Aldrich	C8267
Deoxyribonuclease (DNAse) I	Worthington Biochemical Corporation	LS002007
Detoxi-Gel resin column	Millipore	69670
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) solution	Corning	21-031-CV
EDTA tubes	BD	365974
FBS (Fetal bovine serum)	Gibco	10082-139
Glycerol	Fisher	BP229-1
HBSS (Hank’s Ballanced Salt Solution)	Gibco	24020117
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)	Millipore-Sigma	206-703-0
Isoflurane	VET one	502017
LB media
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences
MES [2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid]	Fisher	50-488-796
MOPS [3-(N-morpholino) propanesulfonic acid]	Fisher	50-213-522
Percoll density gradient media	Cytiva	17089101
Peristaltic pump	Fisher Scientific		Discontinued now, use alternative
PFA (Paraformaldehyde)	Thermo Scientific	I28800
Purification column	Millipore	UFC900308
rLysozyme solution	Novagen	20C71110
Shaking water bath	Thermo Scientific	TSSB15
Slide-A-Lyzer dialysis kit	Thermo	66107
Sodium deoxycholate	Fisher	BP349-100	Fresh made or less than a month
Sterile cell strainer (40 μm)	Fisher Scientific	22-363-547
Tamoxifen	Sigma Aldrich	6734
Ultra centrifugal filter	Millipore	UFC900308
Ultrapure water	Thermo	10977-015
Vortex mixer	Fisher Scientific	2215365
β-ME (β-mercaptoethanol)	Fisher	BP176-100