Schnelle Depletion von Nierenmakrophagen mit humanem CD59/Intermedilysin-Zellablationswerkzeug

Zusammenfassung

Hier wird über ein Protokoll für die selektive Ablation von Nierenmakrophagen berichtet, um deren Regeneration mit dem humanen CD59/Intermedilysin-Zellablationswerkzeug zu untersuchen. Diese Methode ist auch anwendbar, um die Funktion und Regeneration der anderen Zellpopulationen in der Niere, der Leber und dem Fettgewebe zu untersuchen.

Zusammenfassung

Nierenmakrophagen (RMs) sind für die Nierengesundheit unerlässlich und orchestrieren die Immunüberwachung, die Gewebehomöostase und die Reaktion auf Verletzungen. Zuvor haben wir über die Verwendung eines humanen CD59 (hCD59)/Intermedilysin (ILY) Zellablationswerkzeugs berichtet, um das unterschiedliche Schicksal, die Dynamik und die Nischen von RMs aus dem Knochenmark oder embryonalen Ursprungs zu untersuchen. RMs stammen aus aus Dottersack-abgeleiteten Makrophagen, fetalen Lebermonozyten und aus dem Knochenmark stammenden Monozyten und werden im Erwachsenenalter durch lokale Proliferation und Rekrutierung von zirkulierenden Monozyten aufrechterhalten. In dieser Arbeit berichten wir über ein detailliertes Protokoll für die selektive Ablation von RMs, um ihre Regeneration zu untersuchen, einschließlich 1) Generierung und Charakterisierung der Cre-induzierbaren Expression von hCD59 in Maus-RMs, 2) Reinigung von ILY und Charakterisierung der IEL-Aktivität, 3) Induktion der hCD59-Expression an RMs in zusammengesetzten Mäusen und 4) Charakterisierung der Regeneration nach ILY-vermittelter RM-Ablation. ILY depletiert RMs in zusammengesetzten Mäusen spezifisch und schnell mit effizienter Makrophagenablation innerhalb von 1 Tag nach der IGY-Verabreichung. Die Regeneration der renalen Makrophagen begann am 3. Tag nach der Ablation und erholte sich bis zum 7. Tag zu ~88 %. Dieses Modell bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Makrophagenbiologie und kann für die selektive Ablation anderer Zellpopulationen im Nieren-, Leber- und Fettgewebe verwendet werden, um deren Funktion und Regeneration zu untersuchen.

Einleitung

Nierenmakrophagen (RMs) sind essentielle Immunzellen, die die Homöostase der Niere aufrechterhalten, Immunreaktionen regulieren und die Gewebereparatur nach Verletzungen fördern. Sie erfüllen eine Vielzahl von Funktionen, darunter Phagozytose, Antigenpräsentation und die Orchestrierung von Entzündungs- und Entzündungshemmerreaktionen ^1,2,3. Abhängig von der lokalen Umgebung können RMs entweder in proinflammatorische (M1) oder antiinflammatorische (M2) Phänotypen polarisieren, die entweder die Verletzung verschlimmern oder die Heilung erleichtern ^4,5,6. Eine Dysregulation von RMs wurde mit dem Auftreten und Fortschreiten von akutem Nierenversagen (AKI) und chronischer Nierenerkrankung (CKD) in Verbindung gebracht, was sie zu einer entscheidenden Rolle für die Nierengesundheit und -pathologie macht ^7,8. RMs stammen aus verschiedenen Quellen, darunter aus Dottersack gewonnene Makrophagen während der Embryogenese, fetale Lebermonozyten und aus Knochenmark gewonnene Monozyten im Erwachsenenalter. RMs expandieren und reifen postnatal parallel zum Nierenwachstum, hauptsächlich aus fetalen Lebermonozyten vor der Geburt, mit Selbsterhaltung bis zum Erwachsenenalter, ergänzt durch periphere Monozyten⁹. Bei Erwachsenen werden zirkulierende Monozyten durch homöostatische oder Verletzungssignale in die Niere rekrutiert und differenzieren sich unter lokalen Mikroumwelteinflüssen zu Makrophagen. Die RM-Aufrechterhaltung wird durch lokale Proliferation und periodische Auffüllung aus zirkulierenden Monozyten^{aufrechterhalten} 9,10,11,12.

Wir haben zuvor die Verwendung des humanen CD59 (hCD59)/Intermedilysin (ILY)-Zellablationssystems als Werkzeug^13,14 demonstriert, um die unterschiedlichen Schicksale, Dynamiken und Mikroumgebungsnischen von RMs zu untersuchen, die entweder aus dem Knochenmark oder embryonalen Ursprungs stammen⁹. ILY lysiert menschliche Zellen selektiv innerhalb von Sekunden, indem es Poren in gezielten Zellmembranen bildet¹⁵. Diese Spezifität ergibt sich aus der exklusiven Bindungsaffinität von ILY für humanes CD59 (hCD59), ohne Wechselwirkung oder lytische Wirkung auf Zellen anderer Spezies, denen dieser Rezeptor^{fehlt 15}. Basierend auf diesem Konzept haben wir ein Werkzeug entwickelt, das die schnelle, bedingte und gezielte Ablation von humanen CD59-exprimierenden Zellen in transgenen Mausmodellen durch die Anwendung von Intermedilysin (ILY)¹⁴ ermöglicht. Um die Verwendung dieses Werkzeugs zu erleichtern, haben wir ein Modell der bedingten und gezielten Zellablation entwickelt, indem wir floxierte STOP-CD59-Knockin-Mäuse (ihCD59) erzeugt haben, bei denen die Expression von humanem CD59 erst nach Cre-vermittelter Rekombination erfolgt¹³. Zuvor wurde festgestellt, dass das CX3CR1cre-EFP-Gen ausschließlich auf CD11bintF480hi exprimiert wird, definiert als Nierenmakrophagen⁹. Daher haben wir CX3CR1CreER2^+/+ -Linien verwendet, um mit ihCD59-Mäusen zu kreuzen, um hCD59 auf Nierenmakrophagen zu exprimieren. Wir haben erfolgreich zusammengesetzte Mäuse mit dem Genotyp ihCD59^+/-/CX3CR1CreER^+/-9 (+/-, +/+ und -/- für homozygote, hemizygote bzw. nicht-trägergebundene transgene Mäuse generiert). Die Verabreichung von Tamoxifen an ihCD59^+/-/CX3CR1CreER^+/- Compound-Mäusen, die durch hCD59-Expression bedingt markierte und markierte RMs^{waren 9}. Nach der Erschöpfung der RM-Nische durch die ily-Behandlung differenzierten sich periphere Monozyten prompt zu Knochenmark-RMs, wodurch die Nische effektiv wieder bevölkert wurde, wie zuvor in⁹ beschrieben. Diese Regeneration hing entscheidend von der Signalachse CX3CR1/CX3CL1 ab, was ihre wesentliche Rolle sowohl bei der Erhaltung als auch bei der Wiederherstellung der RM-Population unterstreicht⁹. Wir zeigen auch, dass RMs embryonalen Ursprungs aufgrund ihrer unterschiedlichen glykolytischen Kapazitäten eine höhere Kapazität zum Abfangen von Immunkomplexen haben und empfindlicher auf Immunherausforderungen reagieren als RMs aus dem Knochenmark⁹.

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für die selektive Ablation von RMs, um deren Regeneration mittels Cre-induzierbarer hCD59 (ihCD59)-vermittelter Schnellzellablation nach Verabreichung von ILY zu untersuchen. Die Injektion von ILY bewirkte die gezielte Ablation von RMs, die bedingt und spezifisch hCD59 in CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^{+/-compound-Mäusen}  exprimieren. Nach der Ablation überwachten wir die dynamischen Veränderungen der Makrophagen mittels Durchflusszytometrie und fanden eine schnelle Depletion der Makrophagen, gefolgt von der Regeneration der RMs. Rekombinante ILY wurde in E. coli BL21(DE3)-Zellen exprimiert und mittels Nickel-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Die Reinheit und Funktionalität des rekombinanten ILY wurde durch SDS-PAGE, Spektrophotometrie und einen Hämolyse-Assay bestätigt, der seine charakteristische cholesterinabhängige Cytolysin-Aktivität nachweist. Wir verwendeten LILY, um die RMs in den Mäusen zu depletieren und eine effiziente Makrophagenablation innerhalb von 1 Tag nach der Ily-Verabreichung zu erreichen. Die Regeneration der Nierenmakrophagen begann am Tag 3 nach der Ablation und erholte sich bis zum 7. Tag zu ~85%. Die Daten deuten darauf hin, dass die Regeneration in erster Linie durch die Rekrutierung von Monozyten angetrieben wird. Dieses Modell bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Makrophagenbiologie und hat therapeutisches Potenzial für die gezielte Manipulation von Makrophagenpopulationen bei Nierenerkrankungen. Das ihCD59/ily-Zellablationswerkzeug kann verwendet werden, um die Zellfunktion und -regeneration in Niere, Leber, Fettgewebe und anderen Organen zu untersuchen.

Protokoll

Die Tierstudienprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Tulane University, School of Medicine, genehmigt (Protokollnummer 1482). Die Versuchsmäuse Cx3cr1CreER^+/+ und ihCD59^+/+ im Alter von 10-12 Wochen und mit einem Gewicht von 25-30 g wurden unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen in der Tierhaltung der Universität untergebracht. Alle Eingriffe, bei denen die Nieren isoliert wurden, wurden in einer sterilen Umgebung durchgeführt, wobei die Forscher Handschuhe und Gesichtsmasken trugen, um eine Kontamination zu vermeiden. Einzelheiten zu den in der Studie verwendeten Reagenzien und Geräten finden Sie in der Materialtabelle.

1. Vorbereitung der Tiere

1. Beziehen Sie CX3CR1CreER^+/+Mäuse aus dem Jackson Laboratory. Halten Sie die Mäuse an der Tulane University School of Medicine (SOM) in einer spezifischen pathogenfreien (SPF) Einrichtung unter. Halten Sie die Tiere unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit kontrollierten Umgebungsbedingungen.
2. Für die Zucht werden zuvor erzeugte ihCD59+/+ Mäuse mit einem genetischen Hintergrund von C57BL/6 verwendet. Kreuzung homozygoter CX3CR1CreER^+/+ Mäuse (mangelhaft in der CX3CR1-Expression) mit ihCD59^+/- Mäusen, um die folgenden Nachkommengenotypen zu erzeugen: CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^-/-und CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/-.
3. Stellen Sie sicher, dass heterozygote CX3CR1CreER^+-Mäuse die funktionelle CX3CR1-Expression beibehalten, während homozygote CX3CR1CreER^+/+-Mäuse durch durchflusszytometrische Analyse mit Anti-CX3CR1-Antikörper 9 CX3CR1-defizient^sind.

2. Ily-Produktion (abgeleitet von^14,15 )

1. Tag 0
   1. Entnommener gefrorener Bestand des iY-Bakterienstamms BL21-DE3-RIPL mit His-markierten ILY-Sequenzen in pTrcHis-A-Plasmid (Ergänzende Abbildung 1), gelagert bei -80 °C. 10 μl des Bakterienbestands werden in 40 μl Luria-Bouillon-Medium (LB) mit Ampicillin in einer Konzentration von 1 μg/ml inokuliert.
   2. Verteilen Sie die inokulierte Mischung auf einer LB-Agarplatte, die mit Ampicillin (1 μg/ml) ergänzt ist. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 °C in einem Bakterieninkubator.
2. Tag 1
   1. Wählen Sie sechs einzelne Kolonien aus der LB-Agarplatte aus. Impfen Sie jede Kolonie in 3,5 ml LB-Medium, das Ampicillin enthält. Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei 37 °C.
3. Tag 2
   1. Übertragen Sie jede 3,5-ml-Starterkultur in 250 ml LB-Medium, das mit Ampicillin ergänzt wird. Inkubieren Sie die Kulturen 3 h lang bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 230 x g , um das Bakterienwachstum zu ermöglichen.
   2. Nach 3 h Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) aus einer 1 M Stammlösung (gelagert bei -20 °C) in einer Verdünnung von 1:1000 zugeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erreichen. Die Inkubation für weitere 4 Stunden fortsetzen, um die Proteinexpression zu induzieren.
   3. Wiegen Sie eine leere Zentrifugenflasche und notieren Sie das Gewicht. Übertragen Sie ca. 250 mL der induzierten Kultur in die Zentrifugenflasche.
   4. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 10.000 x g für 15 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und wiegen Sie dann die Flasche mit dem Pellet. Berechnen Sie das Pelletgewicht, indem Sie das Gewicht der leeren Flasche vom Gesamtgewicht nach der Zentrifugation abziehen.
   5. Lagern Sie das Bakterienpellet bei -20 °C für die anschließende Extraktion und Reinigung von ILY.
4. Tag 3 : Extraktion und Reinigung von ILY
   1. Bereiten Sie den Lysepuffer vor, indem Sie 30 ml Bug Buster Protein Extraction Reagenz mit 30 μl Benzonase-Nuklease (1200 Kunitz-Einheiten) und 0,9 μl Lysozym (10.000 Einheiten enzymatischer Aktivität) in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen kombinieren.
   2. Mischen Sie die Lösung vorsichtig, um sicherzustellen, dass der Lysepuffer homogen ist. Geben Sie den vorbereiteten Lysepuffer zum Bakterienpellet (2-5 g). Wirbeln Sie die Mischung 30-60 s lang gründlich ein, um die Bakterienzellen vollständig zu resuspendieren.
   3. Die resuspendierte Lösung wird gleichmäßig auf zwei 50-ml-Zentrifugenröhrchen verteilt. Legen Sie die Röhrchen auf Eis und inkubieren Sie sie 30-90 min. Schütteln Sie die Röhrchen während der Inkubation vorsichtig mit einem Orbitalschüttler und wirbeln Sie sie alle 5-10 Minuten kurz für 10-15 s auf, um die Zelllyse zu verbessern.
   4. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Lysate bei 4.900 x g für 30 min bei 4 °C.
   5. Waschen Sie die Säule gründlich mit Leitungswasser und verwenden Sie eine 1-ml-Pipettenspitze, um das restliche Harz der vorherigen Verwendung zu entfernen.
   6. Spülen Sie die Säule mit 70 % Ethanol, um sie zu desinfizieren. Waschen Sie die Säule 2x-3x mit kaltem ddH₂O, um Ethanolreste zu entfernen. Setzen Sie die Säule in die Halterung ein.
   7. Fügen Sie 6-10 mL kaltes ddH₂O hinzu, um die Säule für die Reinigung weiter zu waschen und auszugleichen. Geben Sie ca. 3 ml Harzkügelchen in die Säule. Schließen Sie die Säule an eine Schlauchpumpe an, die auf eine Drehzahl von 30 eingestellt ist.
   8. Fügen Sie 10 ml kaltes ddH₂O hinzu, um das Harz vollständig zu suspendieren und für die Proteinbindung vorzubereiten. Waschen Sie die Harzkügelchen mit 15 mL 1x Charging Buffer, um das Harz für die Proteinbindung vorzubereiten.
   9. Sammeln Sie den bakteriellen Lysatüberstand nach der Zentrifugation in einem frischen Röhrchen und stellen Sie sicher, dass das Pellet verworfen wird. Filtrieren Sie den Überstand mit einem 0,45-μm-Filter mit einer Spritze, um verbleibende Zelltrümmer zu entfernen.
   10. 20-25 ml des filtrierten Bakterienlysats werden in drei separaten Runden durch die Säule geleitet. Sammeln Sie nach jedem Durchgang 20 μl des Durchflusses und markieren Sie ihn als PE für eine spätere Messung der optischen Dichte (OD).
   11. Waschen Sie die Säule mit 20-30 ml Bindungspuffer, um ungebundene Proteine zu entfernen. Waschen Sie die Säule mit 20-30 ml Waschpuffer. Sammeln Sie 20 μl der Waschfraktion für die Außendurchmessermessung.
   12. Eluieren Sie das gebundene Protein durch Zugabe von 10-20 ml Elutionspuffer. Beginnen Sie nach 3-4 Minuten mit der Entnahme der Elution mit Mikrozentrifugenröhrchen. Sammeln Sie ca. 1 ml pro Röhrchen und füllen Sie 15-17 Röhrchen.
   13. Messen Sie die Extinktion jeder Elutionsfraktion an A280 mit einem Spektralphotometer. Verwenden Sie den Elutionspuffer als Leerzeichen während der A280-Messungen. Sammeln Sie die Röhrchen mit dramatisch erhöhter Extinktion bei A280, da sie das His-markierte ILY Protein enthalten, das typischerweise in Fraktionen um Röhrchen 13 vorkommt.
   14. Die Elutionsfraktionen (oder Röhrchen), die das IELY-Protein enthalten, werden bei 4 °C gelagert. Fahren Sie innerhalb des folgenden Tages mit weiteren Schritten fort, um eine optimale Proteinstabilität zu gewährleisten.
       HINWEIS: Führen Sie alle Schritte auf Eis oder bei 4 °C durch, wenn möglich, um die Proteinintegrität zu erhalten.
5. Tag 4: Entfernung von Endotoxinen aus der Elution
   1. Spülen Sie die Säule des Endotoxinentfernungsharzes mit 6-10 ml Reinstwasser. Drücken Sie vorsichtig auf die Säule, um den Durchfluss zu regulieren.
   2. Spülen Sie die Säule mit 10 ml 1%iger Natriumdesoxycholatlösung (frisch hergestellt oder nicht älter als 1 Monat), um gebundene Endotoxine zu entfernen. Spülen Sie die Säule erneut mit 6-10 ml Reinstwasser, um alle Reinigungsmittelreste zu entfernen.
   3. Tragen Sie die vorbereitete Proteinprobe auf die Harzsäule auf. Inkubieren Sie die Probe 1 h lang bei Raumtemperatur (RT) in der Säule, um eine optimale Endotoxinbindung zu ermöglichen.
   4. Sammeln Sie die anfängliche Durchflussfraktion. Geben Sie ddH₂O zur weiteren Elution in die Säule und sammeln Sie die eluierten Fraktionen in etwa 10 Röhrchen (1 mL pro Röhrchen).
   5. Lagern Sie die Harzsäule in 25 % Ethanol bei 4 °C für die zukünftige Verwendung. Messen Sie die optische Dichte (O.D.) der eluierten Proteinproben, um die Ausbeute zu quantifizieren. Erwarten Sie eine Rückgewinnung von etwa 50 % bis 70 % des Gesamtproteins aus der ersten Elutionscharge.
6. Tag 5-6: Dialyse
   1. Bereiten Sie 2 l Dialysepuffer vor, indem Sie 1600 ml destilliertes, deionisiertes Wasser (ddH₂O) autoklavieren. Geben Sie 200 ml 10x PBS, 200 ml Glycerin und 3,5115 g MES (2-(N-Morpholino)-Ethansulfonsäure) in das autoklavierte Wasser.
   2. Rühren Sie die Mischung mit einem magnetischen Rührstab um, bis sich alle Reagenzien vollständig aufgelöst haben. Den entstandenen Puffer bei 4 °C lagern.
   3. Geben Sie die gespeicherten Elutionsfraktionen in das Dialyse-Kit und entfernen Sie dann mit einer Nadel Luft aus dem Dialyse-Kit. Die Proteinlösung wird mit dem Dialysekit 24 h lang bei 4 °C dialysiert, wobei die Rührgeschwindigkeit auf ca. 2 eingestellt ist.
   4. Konfigurieren Sie das Dialysekit so, dass es vollständig in den Puffer eingetaucht ist. Ersetzen Sie am nächsten Tag den Dialysepuffer im Dialysekit durch frischen Dialysepuffer in einem 2-Liter-Behälter. Setzen Sie die Dialyse für weitere 24 Stunden fort.
   5. Übertragen Sie die gesamte Lösung, einschließlich aller weißen Ausfällungen, vorsichtig in ein steriles Röhrchen, um das ily-Protein zu erhalten, das sich ansammeln kann. Konzentrieren Sie das RILY-Protein mit einer Zentrifugalfiltereinheit gemäß den Anweisungen des Herstellers für die Zentrifugation.
   6. Aliquotieren Sie das konzentrierte ily-Protein in sterilen Röhrchen in 200-μl-Portionen. Beschriften Sie jede Tube mit dem Datum und dem Namen. Lagern Sie die Aliquote bei -80 °C für die zukünftige Verwendung in Gelelektrophorese- und Hämolyse-Assays.

3. Ily-Charakterisierung mittels SDS-PAGE-Elektrophorese

1. Bereiten Sie den MOPS SDS-Laufpuffer (1x) vor, indem Sie den Laufpuffer (20x) mit ddH₂O verdünnen.
2. Bereiten Sie den Probenpuffer in einem Abzug vor, indem Sie 90 μl 6x Ladepuffer mit 10 μl β-Mercaptoethanol (β-ME) mischen. Mischen Sie die Lösung gründlich, um eine vollständige Homogenisierung zu gewährleisten.
3. Kombinieren Sie die vorbereitete Probe mit dem Ladepuffer, um ein Endvolumen von 30 μl zu erreichen. Tauen Sie die Proben auf und wirbeln Sie sie kräftig ein, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten.
4. Erhitzen Sie die Proben 5 Minuten lang auf 95 °C, um die Proteine zu denaturieren. Laden Sie die Proben auf ein 4%-20% SDS-PAGE-Gel. Lassen Sie die Elektrophorese 90 min lang mit einer konstanten Spannung von 80 V laufen.
5. Öffnen Sie vorsichtig die Gelkassette und tauchen Sie das Gel für 5 min in ddH₂O ein. Wiederholen Sie den Waschschritt 2x mit einem Shaker.
6. Färben Sie das Gel 1 h lang bei Raumtemperatur (RT) mit Coomassie Brilliant Blue ein. Waschen Sie das Gel 30 Minuten lang in ddH₂O. Ersetzen Sie das Wasser durch frisches ddH₂O und inkubieren Sie das Gel auf einem Shaker für einen Zeitraum von über Nacht bis 3 Tage, um es vollständig zu entfärben.
7. Nehmen Sie mit einer Kamera ein Bild des gefärbten Gels auf (Abbildung 1A). Analysieren Sie das Gel mit der ImageJ-Software für quantitative und qualitative Bewertungen.

4. Hämolytischer Assay für die LILY-Aktivität

1. Tauen Sie die gelagerten ILY (Intermedilysin)-Proben vollständig bei Raumtemperatur auf. Vortex die aufgetauten Proben gründlich, um die Homogenität zu gewährleisten, da ILY beim Auftauen aggregieren kann.
2. Richten Sie eine 96-Well-Platte für serielle Verdünnungen ein. Geben Sie 160 μl der ily-Stammlösung (26,7 ng/μl) in die erste Vertiefung. Geben Sie 80 μl 1x PBS in jede der nachfolgenden Vertiefungen in derselben Zeile oder Spalte.
3. Übertragen Sie 80 μl der ily-Lösung aus der ersten Vertiefung in die zweite Vertiefung. Gründlich mischen, indem Sie auf und ab pipettieren, um sicherzustellen, dass die Lösung homogen ist. Übertragen Sie 80 μl von der zweiten Vertiefung in die dritte Vertiefung und mischen Sie sie gründlich.
4. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Vertiefung und übertragen Sie 80 μl von der vorherigen Vertiefung in die nächste, bis die gewünschte Anzahl von Verdünnungen vorbereitet ist. Nachdem Sie 80 μl in die letzte Vertiefung überführt haben, verwerfen Sie 80 μl aus dieser Vertiefung, um ein gleichmäßiges Volumen auf der Platte zu gewährleisten.

5. Aufbereitung der menschlichen roten Blutkörperchen (RBCs)

1. Ziehen Sie 1-2 ml frisches menschliches Blut in ein Röhrchen, das ein Antikoagulans wie EDTA enthält. Zentrifugieren Sie das Blut bei Raumtemperatur bei 3.000 x g für 5 min.
2. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das menschliche RBC-Pellet mit PBS 2x-3x, bis der Überstand klar ist. Verdünnen Sie die gewaschenen humanen Erythrozyten, indem Sie 10 μl Erythrozyten zu 900 μl 1x PBS hinzufügen, um eine Verdünnung von 1:100 zu erreichen.
3. Geben Sie 10 μl der verdünnten menschlichen Erythrozyten in jede Vertiefung. Geben Sie 30 μl der seriell verdünnten ily-Lösung aus der Verdünnungsplatte in jede Vertiefung. Fügen Sie 160 μl 1x PBS hinzu, um das endgültige Volumen auf 200 μl pro Vertiefung zu bringen (Ausgangskonzentration: 4 ng/μl).
4. Geben Sie 10 μl der verdünnten humanen Erythrozyten in die Kontrollvertiefungen. Geben Sie 190 μl Wasser oder 1x PBS in die Kontrollvertiefungen für Negativkontrollen. Mischen Sie die Teller, indem Sie vorsichtig darauf klopfen.
5. Inkubieren Sie die Platten 30 Minuten lang bei 37 °C, damit die Hämolyse stattfinden kann. Zentrifugieren Sie die Platten 5 Minuten lang bei 3.000 x g , um alle intakten menschlichen Erythrozyten zu pelletieren.
6. Übertragen Sie vorsichtig 100 μl des Überstands aus jeder Vertiefung auf eine neue 96-Well-Platte mit flachem Boden. Messen Sie die Extinktion der Überstände bei 405 nm mit einem Mikroplatten-Reader.
7. Die hämolytische Aktivität von ILY wird berechnet, indem die Absorptionswerte der Proben mit denen der Kontrolle¹⁶ verglichen werden.

6. Tamoxifen-Behandlung, RM-Abbau und Regeneration

1. Maisöl auf 42 °C vorheizen. 100 mg Tamoxifen in 5 ml vorgewärmtem Maisöl auflösen, um eine Stammlösung mit einer Konzentration von 20 mg/ml herzustellen.
2. Verabreichen Sie Tamoxifen intraperitoneal (i.p.) an 10-12 Wochen alte männliche CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- Mäuse in einer Dosis von 100 μg/g Körpergewicht. Wiederholen Sie die Tamoxifen-Injektion an 3 aufeinanderfolgenden Tagen.
3. Warten Sie 15 Tage nach der letzten Tamoxifen-Injektion, um eine Cre-vermittelte hCD59-Expression zu ermöglichen.
4. Injizieren Sie eine Einzeldosis Intermedilysin (ILY) intravenös in CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- Mäuse und CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^-/- Wurfgeschwisterkontrollen in einer Dosis von 120 ng/g Körpergewicht.
5. Überwachen und bestätigen Sie die RM-Ablation und die anschließende Regeneration durch Durchflusszytometrie 1, 3 und 7 Tage nach der Ily-Verabreichung¹⁷.

7. Euthanasie von Mäusen

1. Setzen Sie das Tier in eine geeignete Kammer und setzen Sie es gemäß den IACUC-Protokollen Isofluran aus. Überprüfen Sie die Anästhesie, indem Sie überprüfen, ob keine Reflexe vorhanden sind, wie z. B. der Pedalzurückzugsreflex.
2. Sobald die Maus vollständig betäubt und nicht mehr ansprechbar ist, führen Sie eine Gebärmutterhalsluxation durch, um die Euthanasie sicherzustellen. Bestätigen Sie die Euthanasie, indem Sie das Fehlen von Reflexen, wie z. B. dem Pedalrückzugsreflex, überprüfen.
3. Machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen Schnitt von ca. 2 cm in der Mittellinie am Bauch und ziehen Sie die Haut vorsichtig zurück, um die Brusthöhle freizulegen. Öffnen Sie den Brustkorb entlang des Brustbeins mit einer chirurgischen Schere mit stumpfer Spitze, um das Herz freizulegen.
4. Führen Sie eine 21G-23G-Nadel in den linken Ventrikel ein. Beginnen Sie die Durchblutung mit 10-20 ml kaltem PBS, um das Blut auszuspülen.
5. Schneide den rechten Vorhof auf, damit das Blut aus dem Blutkreislauf abfließen kann. Setzen Sie die Perfusion fort, bis die Nieren blass erscheinen, was auf eine effektive Blutreinigung hinweist.
6. Lokalisieren Sie die Nieren an der dorsalen Körperwand. Trennen Sie die Nieren vorsichtig mit einer Pinzette und einer Schere vom umgebenden Gewebe. Schneiden Sie die Nierenkapseln heraus und legen Sie die Nieren sofort in kaltes PBS, um einen Abbau zu verhindern.

8. Verdauung der Nieren

1. Bereiten Sie den Verdauungsenzymcocktail vor, indem Sie 9 ml HBSS (Ca/Mg-frei), 1 ml Kollagenase IV (5 mg/ml) und 20 μl DNase I (10 mg/ml) mischen. Bereiten Sie die Enzymlösung frisch vor und bewahren Sie sie bis zur Verwendung auf Eis auf.
2. Zerkleinern Sie die Nieren mit einer sterilen Schere in einer Petrischale, die 5 ml HBSS enthält, in winzige Fragmente (idealerweise ≤ 1 mm). Die Nierengewebefragmente werden in 15-ml-Röhrchen mit 10 ml der vorbereiteten Enzymlösung überführt.
3. Inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei 37 °C unter leichtem Rühren, um das Gewebe zu dissoziieren. Zerreiben Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Pipette oder einem Spritzenkolben, um die Zellklumpen weiter zu dissoziieren.
4. Entfernen Sie Gewebereste, indem Sie die Zellsuspension durch ein 40-μm-Zellsieb leiten. Die Zellsuspension bei 650 x g für 10 min bei 18 °C zentrifugieren.
5. Dekantieren Sie den Puffer nach der Zentrifugation vorsichtig. Resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml Lysepuffer und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die roten Blutkörperchen zu lysieren.
6. Waschen Sie die Zellen mit PBS, um den Lysepuffer zu entfernen. Bewahren Sie die resultierende einzellige Suspension bis zur weiteren Verwendung auf Eis auf.

9. Zentrifugation des Dichtegradienten

1. Um hämatopoetische Zellen anzureichern, resuspendieren Sie das Zellpellet aus der vorherigen Wäsche in 10 ml 30%iger Dichtegradientenlösung. Schichten Sie die Lösung vorsichtig über 3 ml 70%ige Dichtegradientenlösung in einem Zentrifugenröhrchen.
2. Zentrifugieren Sie das Gefälle bei 500 x g für 30 min, ohne eine Bremse zu betätigen. Nach dem Zentrifugieren die Zwischenphasenschicht zwischen den 30%igen und 70%igen Lösungen vorsichtig sammeln; Diese Schicht enthält die angereicherten Einzelzellen.
3. Waschen Sie die gesammelten Zellen 2x mit 10 mL PBS, indem Sie bei 500 x g jeweils 10 min zentrifugieren. Resuspendieren Sie das endgültige Zellpellet in 1 mL FACS-Puffer (1x PBS mit 2 % FBS) in einem 1,5 mL Röhrchen.
4. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer unter einem Hellfeldmikroskop. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 2 x 10⁶ Zellen/ml ein.

10. Durchflusszytometrische Färbung, Erfassung

1. Passen Sie die Zellkonzentration aus Einzelzellsuspensionen, die aus Nierengewebe der Maus hergestellt wurden, auf 2-3 x 10⁶ Zellen/ml für die durchflusszytometrische Analyse an.
2. Pelletieren Sie die Zellen in 1,5 mL Röhrchen, indem Sie 5 Minuten lang bei 650 x g zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml FACS-Puffer.
3. Fügen Sie Anti-CD16/32-Antikörper in einer Verdünnung von 1:200 hinzu, um die unspezifische Bindung an den Fc-Rezeptor zu blockieren. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
4. Verwenden Sie Aqua Live/Dead Farbstoff, um lebende von toten Zellen zu unterscheiden, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
5. Färben Sie die Zellen mit vorkonjugierten Antikörpern in einer Verdünnung von 1:100, einschließlich CD45-e450, CD11b-PE-Cy7, hCD59-PE und F4/80-BV605. Geben Sie den Antikörpercocktail in die Zellsuspension.
6. Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln, um die Fluorophore vor Photobleiche zu schützen. Waschen Sie die gefärbten Zellen 2x mit FACS-Puffer (PBS mit 2% fötalem Rinderserum) durch Zentrifugieren bei 650 x g für 5 min.
7. Fixieren Sie die Zellen in 1% Paraformaldehyd (PFA) für 30 min auf Eis. Waschen Sie die fixierten Zellen 2x mit FACS-Puffer, um PFA-Reste zu entfernen.
8. Erfassen Sie gefärbte und fixierte Zellen mit einem Durchflusszytometer. Analysieren Sie die Daten mit der Software.
9. Identifizieren Sie Nieren- und andere geweberesidente Makrophagen und Mikroglia mit den Markern CD45, CD11b und F4/80, wie in⁹ beschrieben.
10. Führen Sie ein anfängliches Gating durch, um lebende Zellen basierend auf Forward-Scatter- (FSC) und Side-Scatter-Profilen (SSC) auszuwählen. Eliminieren Sie Dubletten, indem Sie die Forward-Scatter-Area (FSC-A) im Vergleich zur Forward-Scatter-Höhe (FSC-H) ansteuern. Schließen Sie tote Zellen mit dem Lebensfähigkeitsfarbstoff LIVE/DEAD aus.
11. Anreicherung von Immunzellen durch Gating auf CD45+-Populationen. Definieren Sie nierenresidente Makrophagen als CD11b+F4/80++-Zellen innerhalb der CD45+-Population, wie in der Gating-Strategie gezeigt (Abbildung 2A).
12. Definieren Sie Mikroglia-Populationen als CD11b+CD45ⁱⁿt Zellen (Abbildung 2B). Führen Sie die Datenerfassung am Durchflusszytometer durch. Führen Sie die abschließende Analyse mit der Software durch, um die durchflusszytometrische Studie abzuschließen.

Ergebnisse

Die Aufreinigung von rekombinanter His-Tag-ILY erfolgte nach dem gleichen Protokoll wie zuvor in^{Nummer 14} beschrieben. ILY wurde erfolgreich in E. coli BL21(DE3)-Zellen exprimiert, transformiert mit einem Plasmid, das für das ily-Gen von Streptococcus intermedius kodiert. Bei der Induktion mit IPTG war eine Überexpression des Zielproteins offensichtlich. Nach der Expression wurde die ILY mittels Nickel-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinig...

Diskussion

Die erfolgreiche Expression, Reinigung und funktionelle Validierung von His-markiertem rekombinantem ILY in dieser Studie folgte einem etablierten Protokoll¹⁵. Der Prozess umfasste jedoch mehrere kritische Schritte, die eine hohe Proteinausbeute, Reinheit und biologische Aktivität gewährleisteten. Die Induktion von E. coli BL21 (DE3)-Zellen mit IPTG wurde optimiert, um die Proteinexpressionsniveaus auszugleichen und glei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm syringe filter	Millipore	SLHVR33RS
4-15% TGX Stain-Free Protein Gels	Bio-Rad	4568084
6X Loading buffer	Fisher	50-103-6570
70% Ethanol	WWR Life Science	64-17-5
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer	Gibco	A1049201
Affinity resin beads	Millipore	69670
Ampicillin sodium solution	Zymo Research	A1001-5
Anti-CD11b-PE-Cy7 (Clone M1/70)	Invitrogen	25-0112-82
Anti-CD16/32 (FcγRIII/II, Clone 93)	eBioscience	48-0161-80
Anti-CD45-e450 (Clone 30-F11)	eBioscience	48-0451-82
Anti-F4/80-BV605(Clone BM8)	BioLegend	123133
Anti-hCD59-PE (Clone OV9A2)	Invitrogen	12-0596-42
Aqua Live/Dead dye	Invitrogen	L34957A
Beads (resin)	Millipore	69670
Benzonase Nuclease	Millipore	70664-10KUN
BugBuster protein extraction reagent	Millipore	70584-4
Centrifuge for microtubes	Eppendorf	5424
Centrifuge for tubes	Thermo Scientific	75-001-241
Collagenase type IV	Worthington Biochemical Corporation	LS004188
Corn oil	Sigma Aldrich	C8267
Deoxyribonuclease (DNAse) I	Worthington Biochemical Corporation	LS002007
Detoxi-Gel resin column	Millipore	69670
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) solution	Corning	21-031-CV
EDTA tubes	BD	365974
FBS (Fetal bovine serum)	Gibco	10082-139
Glycerol	Fisher	BP229-1
HBSS (Hank’s Ballanced Salt Solution)	Gibco	24020117
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)	Millipore-Sigma	206-703-0
Isoflurane	VET one	502017
LB media
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences
MES [2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid]	Fisher	50-488-796
MOPS [3-(N-morpholino) propanesulfonic acid]	Fisher	50-213-522
Percoll density gradient media	Cytiva	17089101
Peristaltic pump	Fisher Scientific		Discontinued now, use alternative
PFA (Paraformaldehyde)	Thermo Scientific	I28800
Purification column	Millipore	UFC900308
rLysozyme solution	Novagen	20C71110
Shaking water bath	Thermo Scientific	TSSB15
Slide-A-Lyzer dialysis kit	Thermo	66107
Sodium deoxycholate	Fisher	BP349-100	Fresh made or less than a month
Sterile cell strainer (40 μm)	Fisher Scientific	22-363-547
Tamoxifen	Sigma Aldrich	6734
Ultra centrifugal filter	Millipore	UFC900308
Ultrapure water	Thermo	10977-015
Vortex mixer	Fisher Scientific	2215365
β-ME (β-mercaptoethanol)	Fisher	BP176-100