JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной статье представлен протокол селективной абляции почечных макрофагов для изучения их регенерации с использованием инструмента для абляции клеток CD59/интермедилизина человека. Этот метод также применим для изучения функции и регенерации других клеточных популяций в почках, печени и жировой ткани.

Аннотация

Почечные макрофаги (РМ) необходимы для здоровья почек, организуя иммунный надзор, гомеостаз тканей и реакцию на травму. Ранее мы сообщали об использовании инструмента для абляции клеток CD59 (hCD59)/интермедилизина (ILY) человека для изучения различной судьбы, динамики и ниш РМ костного мозга или эмбрионального происхождения. РМ происходят из макрофагов, полученных из желточного мешка, моноцитов печени плода и моноцитов, полученных из костного мозга, и поддерживаются во взрослом возрасте за счет местной пролиферации и рекрутирования циркулирующих моноцитов. В данной статье мы сообщаем о подробном протоколе селективной абляции РМ для изучения их регенерации, включая 1) генерацию и характеристику Cre-индуцируемой экспрессии hCD59 у мышиных РМ, 2) очистку ILY и характеристику активности ILY, 3) индукцию экспрессии hCD59 на РМ у сложных мышей и 4) характеристику регенерации после ILY-опосредованной абляции РМ. ILY специфически и быстро истощает RM у сложных мышей с эффективной абляцией макрофагов в течение 1 дня после введения ILY. Регенерация почечных макрофагов началась на 3-й день после абляции, с ~88% восстановлением к 7-му дню. Эта модель предлагает мощный инструмент для изучения биологии макрофагов и может быть использована для селективной абляции других клеточных популяций в почках, печени и жировых тканях для исследования их функции и регенерации.

Введение

Почечные макрофаги (РМ) являются важными иммунными клетками, которые поддерживают гомеостаз почек, регулируют иммунные реакции и способствуют восстановлению тканей после травмы. Они выполняют различные функции, включая фагоцитоз, презентацию антигена и оркестрацию как воспалительных, так и противовоспалительных реакций 1,2,3. В зависимости от местной среды, РМ могут поляризоваться либо на провоспалительный (М1), либо на противовоспалительный (М2) фенотипы, либо усугубляя травму, либо способствуя заживлению 4,5,6. Нарушение регуляции РМ связано с возникновением и прогрессированием острого повреждения почек (ОПП) и хронической болезни почек (ХБП), что делает их критически важными факторами в здоровье и патологии почек 7,8. РМ возникают из различных источников, включая макрофаги, полученные из желточного мешка во время эмбриогенеза, моноциты печени плода и моноциты, полученные из костного мозга во взрослом возрасте. РМ расширяются и созревают параллельно с ростом почек постнатально, в основном из моноцитов печени плода до рождения, с самоподдержанием в зрелом возрасте, дополненным периферическими моноцитами9. У взрослых особей циркулирующие моноциты рекрутируются в почку гомеостатическими сигналами или сигналами повреждения, дифференцироваясь в макрофаги под воздействием местной микросреды. Поддержание РМ поддерживается за счет локальной пролиферации и периодического пополнения за счет циркулирующих моноцитов 9,10,11,12.

Ранее мы продемонстрировали использование системы абляции клеток человека CD59 (hCD59)/интермедилизина (ILY) в качестве инструмента13,14 для исследования различных судеб, динамики и микроэкологических ниш RM, полученных из костного мозга или эмбрионального происхождения9. ILY селективно лизирует клетки человека в течение нескольких секунд, формируя поры в целевых клеточных мембранах15. Эта специфичность обусловлена исключительным сродством связывания ILY с человеческим CD59 (hCD59), без взаимодействия или литического эффекта на клетки других видов, лишенных этого рецептора15. Основываясь на этой концепции, мы разработали инструмент, позволяющий проводить быструю, условную и целенаправленную абляцию клеток, экспрессирующих CD59 человека, в трансгенных моделях мышей с помощью интермедилизина (ILY)14. Чтобы облегчить использование этого инструмента, мы разработали модель условной и целевой клеточной абляции путем создания мышей с выбиванием STOP-CD59 (ihCD59), у которых экспрессия человеческого CD59 происходит только после Cre-опосредованной рекомбинации13. Ранее было обнаружено, что ген CX3CR1cre-EFP экспрессируется исключительно на CD11bintF480hi, определяемом как почечныемакрофаги9. Поэтому мы использовали CX3CR1CreER2+/+ линии для скрещивания с мышами ihCD59 для экспрессии hCD59 на почечных макрофагах. Мы успешно сгенерировали сложных мышей с генотипом ihCD59+/-/CX3CR1CreER+/-9 (+/-, +/+ и -/- указывают на гомозиготу, гемизиготу и ненесущих трансгенных мышей соответственно). Введение тамоксифена мышам с соединением ihCD59+/-/CX3CR1CreER+/- условно меченым и маркированным RM по экспрессии hCD599. После истощения ниши RM с помощью лечения ILY, периферические моноциты быстро дифференцировались в RM, полученные из костного мозга, эффективно повторно заполняя нишу, как описано ранее впункте 9. Эта регенерация в значительной степени зависела от сигнальной оси CX3CR1/CX3CL1, что подчеркивает ее важную роль как в поддержании, так и в восстановлении популяции RM9. Мы также показываем, что из-за их различных гликолитических способностей РМ эмбрионального происхождения обладают более высокой способностью поглощать иммунные комплексы и более чувствительны к иммунным проблемам, чем РМ, полученные из костного мозга9.

Мы представляем подробный протокол селективной абляции RM для исследования их регенерации с помощью Cre-индуцируемой hCD59 (ihCD59)-опосредованной быстрой клеточной абляции после введения ILY. Введение ILY вызывало целенаправленную абляцию RM, которые условно и специфически экспрессируют hCD59 у мышей CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/- compound. После абляции мы наблюдали за динамическими изменениями макрофагов с помощью проточной цитометрии и обнаружили быстрое истощение макрофагов с последующей регенерацией RMs. Рекомбинантный ILY экспрессировали в клетках E. coli BL21(DE3) и очищали с помощью аффинной хроматографии никель-NTA. Чистота и функциональность рекомбинантного ILY были подтверждены с помощью SDS-PAGE, спектрофотометрии и анализа гемолиза, продемонстрировав его характерную холестерин-зависимую цитолизиновую активность. Мы использовали ILY для истощения RM у мышей, достигнув эффективной абляции макрофагов в течение 1 дня после введения ILY. Регенерация почечных макрофагов началась на 3-й день после абляции, с ~85% восстановлением к 7-му дню. Данные свидетельствуют о том, что регенерация в первую очередь обусловлена рекрутингом моноцитов. Эта модель предлагает мощный инструмент для изучения биологии макрофагов и обладает терапевтическим потенциалом для целенаправленного манипулирования популяциями макрофагов при заболеваниях почек. Инструмент для абляции клеток ihCD59/ILY может быть использован для изучения функции и регенерации клеток в почках, печени, жировой ткани и других органах.

протокол

Протоколы исследований на животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского факультета Университета Тулейна (протокол No 1482). Экспериментальные мыши Cx3cr1CreER+/+ и ihCD59+/+ в возрасте 10-12 недель и массой 25-30 г были размещены в специфических условиях, свободных от патогенов (SPF) в университетском животноводческом комплексе. Все процедуры, связанные с изоляцией почек, проводились в стерильной среде, при этом исследователи носили перчатки и маски для лица для предотвращения заражения. Подробную информацию о реагентах и оборудовании, использованных в исследовании, можно найти в Таблице материалов.

1. Подготовка животных

  1. Получите CX3CR1CreER+/+мыши из лаборатории Джексона. Разместите мышей в Медицинской школе Тулейнского университета (SOM) в специальном помещении, свободном от патогенов (SPF). Поддерживайте животных в 12-часовом цикле свет/темнота с контролируемыми условиями окружающей среды.
  2. Для разведения используйте ранее сгенерированных мышей ihCD59+/+ с генетическим фоном C57BL/6. Скрещивание гомозиготных мышей CX3CR1CreER+/+ (с дефицитом экспрессии CX3CR1) с мышами ihCD59+/- для получения следующих генотипов потомства: CX3CR1CreER+/-/ihCD59-/-и CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/-.
  3. Убедитесь, что гетерозиготные мыши CX3CR1CreER+/- сохраняют функциональную экспрессию CX3CR1, в то время как гомозиготные мыши CX3CR1CreER+/+ испытывают дефицит CX3CR1, с помощью анализа проточной цитометрии с антителом Anti-CX3CR19.

2. Производство ILY (производное от14,15)

  1. День 0
    1. Извлечение замороженного исходного материала бактериального штамма ILY BL21-DE3-RIPL, содержащего помеченные His-мечкой последовательности ILY в плазмиде pTrcHis-A (дополнительный рисунок 1), хранящемся при -80 °C. Инокулировать 10 мкл бактериального запаса в 40 мкл среды бульона Лурии (ЛБ), содержащей ампициллин в концентрации 1 мкг/мл.
    2. Разложите инокулированную смесь на пластину с агаром LB с добавлением ампициллина (1 мкг/мл). Инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 37 °C в бактериальном инкубаторе.
  2. День 1
    1. Выберите шесть отдельных колоний из агаровой пластины LB. Инокулируйте каждую колонию в 3,5 мл LB среды, содержащей ампициллин. Инкубируйте культуры в течение ночи при температуре 37 °C.
  3. День 2
    1. Перенесите каждую 3,5 мл закваски в 250 мл LB среды с добавлением ампициллина. Инкубируйте культуры при 37 °C в течение 3 ч с встряхиванием при 230 x g , чтобы обеспечить рост бактерий.
    2. Через 3 ч добавьте изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) из 1 М стокового раствора (хранящегося при -20 °C) в разведении 1:1000 для достижения конечной концентрации 1 мМ. Продолжайте инкубацию еще 4 часа, чтобы вызвать экспрессию белка.
    3. Взвесьте пустую бутылку из-под центрифуги и запишите вес. Перелейте примерно 250 мл индуцированной культуры в бутылку центрифуги.
    4. Гранулируйте ячейки центрифугированием при 10 000 x g в течение 15 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, затем взвесьте флакон с гранулой. Рассчитайте вес гранул путем вычитания веса пустой бутылки из общего веса после центрифугирования.
    5. Хранить бактериальную гранулу при температуре -20 °C для последующей экстракции и очистки ILY.
  4. День 3 : Экстракция и очистка ILY
    1. Приготовьте буфер для лизиса, соединив 30 мл реагента для экстракции белка Bug Buster с 30 мкл бензоназной нуклеазы (1200 единиц Куница) и 0,9 μл лизоцима (10 000 единиц ферментативной активности) в центрифужной пробирке объемом 50 мл.
    2. Осторожно перемешайте раствор, чтобы буфер для лизиса был однородным. В бактериальную гранулу добавьте подготовленный буфер для лизиса (2-5 г). Тщательно перебейте смесь вихрем в течение 30-60 с для полной ресуспензии бактериальных клеток.
    3. Разделите ресуспензионный раствор поровну между двумя центрифужными пробирками объемом 50 мл. Поместите трубки на лед и выдерживайте в течение 30-90 минут. Во время инкубации осторожно встряхивайте пробирки с помощью орбитального шейкера и кратковременно делайте вихрь каждые 5-10 минут в течение 10-15 секунд для усиления лизиса клеток.
    4. После инкубации центрифугируйте лизаты при 4 900 x g в течение 30 мин при 4 °C.
    5. Тщательно промойте колонку водопроводной водой с помощью наконечника для дозатора объемом 1 мл, чтобы удалить остатки смолы от предыдущего использования.
    6. Промойте колонку 70% этанолом, чтобы продезинфицировать ее. Промойте колонку 2x-3x холодным ddH2O, чтобы удалить остатки этанола. Поместите колонку в держатель.
    7. Добавьте 6-10 мл холодной ддН2О для дальнейшей промывки и уравновешивания колонки для очистки. Добавьте в столбик примерно 3 мл гранул смолы. Подключите колонку к перистальтическому насосу, установленному на скорость 30.
    8. Добавьте 10 мл холодного ddH2O, чтобы полностью суспендировать смолу и подготовить ее к связыванию с белками. Промойте шарики смолы 15 мл 1x зарядного буфера, чтобы подготовить смолу к связыванию с белками.
    9. Соберите надосадочную жидкость для лизата бактерий после центрифугирования в свежую пробирку, убедившись, что гранула отброшена. Отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью фильтра 0,45 мкм со шприцем, чтобы удалить оставшийся клеточный мусор.
    10. Пропустите 20-25 мл отфильтрованного бактериального лизата через колонку в три отдельных раунда. После каждого прохода собирайте 20 μL проточного потока и помечайте его как P.E. для последующего измерения оптической плотности (OD).
    11. Промойте колонку 20-30 мл связывающего буфера, чтобы удалить несвязанные белки. Промойте колонку 20-30 мл буфера для промывки. Соберите 20 мкл промывочной фракции для измерения наружного диаметра.
    12. Разбавьте связанный белок, добавив 10-20 мл элюирующего буфера. Начните собирать элюирование через 3-4 минуты с помощью микроцентрифужных пробирок. Соберите примерно 1 мл на пробирку, заполнив 15-17 пробирок.
    13. Измерьте поглощение каждой фракции элюирования при A280 с помощью спектрофотометра. Используйте буфер элюирования в качестве заглушки во время считывания A280. Соберите пробирки со значительно увеличенной абсорбцией при A280, так как они содержат меченый His-меченный белок ILY, который обычно находится во фракциях вокруг пробирки 13.
    14. Храните фракции элюирования (или пробирки), содержащие белок ILY, при температуре 4 °C. Продолжайте дальнейшие шаги в течение следующего дня, чтобы обеспечить оптимальную стабильность белка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы на льду или при температуре 4 °C, где это возможно, чтобы сохранить целостность белка.
  5. День 4: Удаление эндотоксина из элюирования
    1. Промойте колонку смолы, удаляющей эндотоксины, 6-10 мл сверхчистой воды. Аккуратно надавите на колонку, чтобы отрегулировать поток.
    2. Промойте колонку 10 мл 1% раствора дезоксихолата натрия (свежеприготовленного или не старше 1 месяца) для удаления связанных эндотоксинов. Снова промойте колонку 6-10 мл ультрачистой воды, чтобы удалить остатки моющего средства.
    3. Нанесите подготовленный образец белка на колонку со смолой. Инкубируйте образец в колонке в течение 1 ч при комнатной температуре (RT) для обеспечения оптимального связывания эндотоксинов.
    4. Соберите исходную проточную фракцию. Добавьте ddH, 2O в колонку для дальнейшего элюирования и соберите элюированные фракции примерно в 10 пробирок (по 1 мл на пробирку).
    5. Храните колонку смолы в 25% этаноле при температуре 4 °C для использования в будущем. Измерьте оптическую плотность (O.D.) образцов элюированного белка для количественной оценки выхода. Ожидайте восстановления примерно 50%-70% от общего количества белка из первой партии элюирования.
  6. День 5-6: Диализ
    1. Приготовьте 2 л диализного буфера, автоклавируя 1600 мл дистиллированной, деионизированной воды (ddH2O). Добавьте в автоклавированную воду 200 мл 10x PBS, 200 мл глицерина и 3,5115 г MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты).
    2. Перемешайте смесь с помощью магнитной мешалки до полного растворения всех реагентов. Храните полученный буфер при температуре 4 °C.
    3. Добавьте сохраненные фракции элюирования в набор для диализа, затем удалите воздух из набора для диализа с помощью иглы. Диализируйте белковый раствор с помощью диализного набора в течение 24 часов при 4 °C со скоростью перемешивания, равной примерно 2.
    4. Сконфигурируйте комплект для диализа так, чтобы он был полностью погружен в буфер. На следующий день замените диализный буфер в диализном наборе свежим диализным буфером в контейнере объемом 2 л. Продолжайте диализ еще в течение 24 часов.
    5. Осторожно перелейте весь раствор, включая любые белые осадки, в стерильную пробирку, чтобы сохранить белок ILY, который может агрегироваться. Сконцентрируйте белок ILY с помощью центробежного фильтрующего блока, следуя инструкциям производителя по центрифугированию.
    6. Концентрированный белок ILY разложить на порции по 200 мкл в стерильных пробирках. Наклейте на каждую пробирку дату и название. Храните аликвоты при температуре -80 °C для дальнейшего использования в гелевом электрофорезе и анализах гемолиза.

3. Определение характеристик ILY с помощью электрофореза SDS-PAGE

  1. Подготовьте рабочий буфер MOPS SDS (1x), разбавив рабочий буфер (20x) ddH2O.
  2. Приготовьте буфер для проб в вытяжном шкафу, смешав 90 мкл 6-кратного загрузочного буфера с 10 мкл β-меркаптоэтанола (β-ME). Тщательно перемешайте раствор, чтобы обеспечить полную гомогенизацию.
  3. Соедините подготовленный образец с загрузочным буфером, чтобы получить конечный объем 30 μл. Разморозьте образцы и энергично перемешайте их, чтобы обеспечить полное перемешивание.
  4. Нагрейте образцы до 95 °C в течение 5 минут, чтобы денатурировать белки. Загрузите образцы в гель SDS-PAGE с 4%-20%. Запустите электрофорез при постоянном напряжении 80 В в течение 90 минут.
  5. Осторожно откройте гелевую кассету и погрузите гель в ddH2O на 5 минут. Повторите шаг стирки 2 раза с помощью шейкера.
  6. Окрашивайте гель Coomassie Brilliant Blue в течение 1 часа при комнатной температуре (RT). Смойте гель в течение 30 минут в ddH2O. Замените воду на свежую ddH2O и выдержите гель в шейкере в течение ночи до 3 дней для полного отстояния.
  7. Сделайте снимок окрашенного геля с помощью фотоаппарата (рисунок 1A). Проанализируйте гель с помощью программного обеспечения ImageJ для количественной и качественной оценки.

4. Гемолитический анализ на активность ILY

  1. Полностью разморозьте хранящиеся образцы ILY (интермедиализина) при комнатной температуре. Тщательно обработайте размороженные образцы вихрем, чтобы обеспечить однородность, так как ILY может агрегироваться при размораживании.
  2. Установите 96-луночный планшет для серийных разведений. Добавьте 160 мкл стокового раствора ILY (26,7 нг/мкл) в первую лунку. Добавьте по 80 мкл 1x PBS в каждую из последующих лунок в том же ряду или столбце.
  3. Перекачайте 80 мкл раствора ILY из первой лунки во вторую. Тщательно перемешайте с помощью пипетирования вверх и вниз, чтобы убедиться, что раствор однороден. Перелейте 80 μL из второй лунки в третью лунку и тщательно перемешайте.
  4. Повторяйте этот процесс для каждой лунки, переливая 80 мкл из предыдущей лунки в следующую, пока не будет приготовлено желаемое количество разведений. После перекачки 80 мкл в последнюю лунку слейте 80 мкл из этой лунки, чтобы обеспечить равномерные объемы по всей пластине.

5. Получение эритроцитов человека (эритроцитов)

  1. Наберите 1-2 мл свежей человеческой крови в пробирку, содержащую антикоагулянт, такой как ЭДТА. Центрифугируйте кровь при комнатной температуре при 3000 х г в течение 5 минут.
  2. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте человеческую гранулу эритроцитов PBS 2x-3x до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. Разбавьте промытые эритроциты человека, добавив 10 мкл эритроцитов к 900 мкл 1x PBS для получения разбавления 1:100.
  3. Добавьте в каждую лунку по 10 мкл разбавленных эритроцитов человека. Добавьте в каждую лунку по 30 мкл последовательно разбавленного раствора ILY из разбавляющей пластины. Добавьте 160 мкл 1x PBS, чтобы довести конечный объем до 200 мкл на лунку (начальная концентрация: 4 нг/мкл).
  4. Добавьте 10 мкл разбавленных эритроцитов человека в контрольные лунки. Добавьте 190 мкл воды или 1x PBS в контрольные лунки для отрицательного контроля. Перемешайте тарелки, слегка постукивая по ним.
  5. Инкубируйте планшеты при 37 °C в течение 30 минут, чтобы произошел гемолиз. Центрифугируйте планшеты при давлении 3000 x g в течение 5 минут, чтобы удалить все неповрежденные эритроциты человека.
  6. Осторожно перенесите 100 мкл надосадочной жидкости из каждой лунки на новый 96-луночный планшет с плоским дном. Измерьте поглощение надосадочной жидкости на длине волны 405 нм с помощью считывателя микропланшетов.
  7. Рассчитайте гемолитическую активность ILY путем сравнения значений абсорбции образцов с контрольными16.

6. Лечение тамоксифеном, истощение RM и регенерация

  1. Разогрейте кукурузное масло до 42 °C. Растворите 100 мг тамоксифена в 5 мл подогретого кукурузного масла для приготовления исходного раствора с концентрацией 20 мг/мл.
  2. Введите тамоксифен внутрибрюшинно (в/в) 10-12-недельным самцам CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/- в дозе 100 мкг/г массы тела. Повторяйте инъекцию тамоксифена в течение 3 дней подряд.
  3. Подождите 15 дней после последней инъекции тамоксифена, чтобы обеспечить Cre-опосредованную экспрессию hCD59.
  4. Введите однократную дозу интермедилизина (ILY) внутривенно мышам CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/- и контрольной группе CX3CR1CreER+/-/ihCD59-/- в дозе 120 нг/г массы тела.
  5. Мониторинг и подтверждение абляции РМ и последующей регенерации путем проведения проточной цитометрии через 1, 3 и 7 дней после введения ИЛИ17.

7. Эвтаназия мышей

  1. Поместите животное в соответствующую камеру и подвергните его воздействию изофлурана в соответствии с протоколами IACUC. Проверьте анестезию, проверив отсутствие рефлексов, таких как рефлекс отвода педали.
  2. Как только мышь полностью обезболится и перестанет реагировать, выполните вывих шейки матки, чтобы обеспечить эвтаназию. Подтвердите эвтаназию, проверив отсутствие рефлексов, таких как рефлекс отмены педали.
  3. Сделайте разрез по средней линии примерно 2 см на животе с помощью стерильного скальпеля и аккуратно втяните кожу, обнажив грудную полость. Вскройте грудную клетку вдоль грудины с помощью хирургических ножниц с тупым концом, чтобы обнажить сердце.
  4. Введите иглу 21G-23G в левый желудочек. Начните перфузию с 10-20 мл холодной PBS для вымывания крови.
  5. Разрежьте правое предсердие, чтобы кровь могла выйти из кровообращения. Продолжайте перфузию до тех пор, пока почки не станут бледными, что указывает на эффективный клиренс крови.
  6. Расположите почки у стенки дорсального тела. Аккуратно отделите почки от окружающих тканей с помощью щипцов и ножниц. Удалите почечные капсулы и немедленно поместите почки в холодный PBS, чтобы предотвратить деградацию.

8. Пищеварение почек

  1. Приготовьте коктейль ферментов пищеварения, смешав 9 мл HBSS (Ca/Mg free), 1 мл коллагеназы IV (5 мг/мл) и 20 мкл DNase I (10 мг/мл). Приготовьте ферментный раствор в свежем виде и держите его на льду до использования.
  2. Измельчите почки на мелкие фрагменты (в идеале ≤ 1 мм) с помощью стерильных ножниц в чашке Петри, содержащей 5 мл HBSS. Перенесите фрагменты почечной ткани в пробирки объемом 15 мл, содержащие 10 мл приготовленного ферментного раствора.
  3. Инкубируйте пробирки при температуре 37 °C в течение 30 минут с легким перемешиванием, чтобы разложить ткань. Аккуратно растирайте ткань с помощью пипетки или поршня шприца, чтобы еще больше диссоциировать клеточные скопления.
  4. Удалите остатки ткани, пропустив клеточную суспензию через клеточный фильтр 40 мкм. Центрифугируйте клеточную суспензию при 650 x g в течение 10 мин при 18 °C.
  5. После центрифугирования тщательно сцедите буфер. Ресуспендируйте гранулу в 5 мл буфера для лизиса и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре до лизиса эритроцитов.
  6. Промойте клетки PBS, чтобы удалить буфер для лизиса. Выдержите полученную одноклеточную суспензию на льду до дальнейшего использования.

9. Центрифугирование с градиентом плотности

  1. Чтобы обогатить кроветворные клетки, суспендируйте клеточную гранулу от предыдущей промывки в 10 мл 30% раствора градиента плотности. Тщательно нанесите раствор на 3 мл градиента плотности 70% в центрифужную пробирку.
  2. Центрифугируйте градиент при давлении 500 x g в течение 30 минут, не применяя тормоз. После центрифугирования тщательно соберите межфазный слой между 30% и 70% растворами; Этот слой содержит обогащенные одиночные клетки.
  3. Промывайте собранные клетки 2 раза 10 мл PBS центрифугированием при 500 x g в течение 10 минут каждый раз. Ресуспендируйте конечную клеточную гранулу в 1 мл буфера FACS (1x PBS с 2% FBS) в пробирке объемом 1,5 мл.
  4. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра под светлопольным микроскопом. Отрегулируйте концентрацию клеток до 2 x 106 клеток/мл.

10. Проточная цитометрия, окрашивание, получение

  1. Отрегулируйте концентрацию клеток из одноклеточных суспензий, приготовленных из ткани почек мыши, до 2-3 x 106 клеток/мл для проточного цитометрического анализа.
  2. Гранулируйте клетки в пробирки объемом 1,5 мл путем центрифугирования при 650 x g в течение 5 минут. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл буфера FACS.
  3. Добавьте антитела против CD16/32 в соотношении 1:200 для блокирования связывания неспецифических Fc-рецепторов. Инкубируйте клетки в течение 15 минут при комнатной температуре.
  4. Используйте краситель Aqua Live/Dead, чтобы отличить живые клетки от мертвых, следуя инструкциям производителя.
  5. Окрашивайте клетки предварительно конъюгированными антителами в соотношении 1:100, включая CD45-e450, CD11b-PE-Cy7, hCD59-PE и F4/80-BV605. Добавьте коктейль антител в клеточную суспензию.
  6. Инкубируйте образец в течение 30 минут при температуре 4 °C в темноте, чтобы защитить флуорофоры от фотообесцвечивания. Промойте окрашенные клетки 2 раза буфером FACS (PBS с 2% фетальной бычьей сывороткой) центрифугированием при 650 x g в течение 5 минут.
  7. Зафиксируйте клетки в 1% параформальдегиде (PFA) на 30 минут на льду. Промойте неподвижные элементы 2 раза буфером FACS, чтобы удалить остатки PFA.
  8. Приобретите окрашенные и неподвижные клетки с помощью проточного цитометра. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения.
  9. Идентификация макрофагов и микроглии, резидентных в почках и других тканях, с помощью маркеров CD45, CD11b и F4/80, как описано впункте 9 .
  10. Выполните начальное стробирование для выбора активных ячеек на основе профилей прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеивания (SSC). Устранение дублетов путем стробирования по прямой области рассеяния (FSC-A) в сравнении с высотой прямого рассеяния (FSC-H). Исключите мертвые клетки с помощью красителя жизнеспособности LIVE/DEAD.
  11. Обогащайте иммунные клетки путем гейтирования популяций CD45+. Определите резидентные в почках макрофаги как клетки CD11b+F4/80++ в популяции CD45+, как показано в стратегии гейтирования (рис. 2A).
  12. Определите популяции микроглии как CD11b+CD45iⁿt клетки (рис. 2B). Выполните сбор данных на проточном цитометре. Проведите окончательный анализ с помощью программного обеспечения для завершения проточного цитометрического исследования.

Результаты

Очистка рекомбинантного ILY His-Tag проводилась по тому же протоколу, что и описанному ранее впункте 14. ILY был успешно экспрессирован в клетках E. coli BL21(DE3), трансформированных плазмидой, кодирующей ген ILY из Streptococcus intermedius. При индукции с помощью ППТГ на?...

Обсуждение

Успешная экспрессия, очистка и функциональная валидация меченного His-меченным рекомбинантного ILY в этом исследовании осуществлялись в соответствии с хорошо разработаннымпротоколом. Тем не менее, процесс включал в себя несколько критич...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в данной рукописи. Никакие конфликты интересов, в том числе финансовые, нефинансовые, профессиональные или личные, не повлияли на разработку, проведение, интерпретацию или презентацию исследования.

Благодарности

Мы выражаем нашу благодарность как бывшим, так и нынешним членам Qin Lab за их вклад в разработку и совершенствование протоколов, используемых в этом исследовании. Мы также благодарим группу доктора Р. К. Тветена в Центре медицинских наук Университета Оклахомы за щедрое предоставление рекомбинантной плазмиды ILY, которая сыграла важную роль в этом исследовании. Это исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения (NIH) в рамках гранта NIH 5 P51OD011104-58, R01DK129881 (X.Q.) и R21OD024931 (X.Q.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 µm syringe filterMilliporeSLHVR33RS
4-15% TGX Stain-Free Protein GelsBio-Rad4568084
6X Loading bufferFisher50-103-6570
70% EthanolWWR Life Science64-17-5
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing BufferGibcoA1049201
Affinity resin beadsMillipore69670
Ampicillin sodium solutionZymo ResearchA1001-5
Anti-CD11b-PE-Cy7 (Clone M1/70)Invitrogen25-0112-82
Anti-CD16/32 (FcγRIII/II, Clone 93)eBioscience48-0161-80
Anti-CD45-e450 (Clone 30-F11)eBioscience48-0451-82
Anti-F4/80-BV605(Clone BM8)BioLegend 123133
Anti-hCD59-PE (Clone OV9A2)Invitrogen12-0596-42
Aqua Live/Dead dyeInvitrogen    L34957A
Beads (resin)Millipore69670
Benzonase NucleaseMillipore70664-10KUN
BugBuster protein extraction reagentMillipore70584-4
Centrifuge for microtubesEppendorf5424
Centrifuge for tubesThermo Scientific75-001-241
Collagenase type IVWorthington Biochemical CorporationLS004188
Corn oilSigma AldrichC8267
Deoxyribonuclease (DNAse) IWorthington Biochemical CorporationLS002007
Detoxi-Gel resin columnMillipore69670
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) solutionCorning21-031-CV
EDTA tubesBD365974
FBS (Fetal bovine serum)Gibco10082-139
GlycerolFisherBP229-1
HBSS (Hank’s Ballanced Salt Solution)Gibco24020117
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) Millipore-Sigma206-703-0
IsofluraneVET one502017
LB media
LSRFortessa flow cytometerBD Biosciences
MES [2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid]Fisher50-488-796
MOPS [3-(N-morpholino) propanesulfonic acid]Fisher50-213-522
Percoll density gradient mediaCytiva17089101
Peristaltic pumpFisher ScientificDiscontinued now, use alternative
PFA (Paraformaldehyde)Thermo ScientificI28800
Purification columnMilliporeUFC900308
rLysozyme solutionNovagen20C71110
Shaking water bath Thermo ScientificTSSB15
Slide-A-Lyzer dialysis kitThermo66107
Sodium deoxycholateFisherBP349-100Fresh made or less than a month
Sterile cell strainer (40 μm)Fisher Scientific22-363-547
TamoxifenSigma Aldrich6734
Ultra centrifugal filterMilliporeUFC900308
Ultrapure waterThermo10977-015
Vortex mixerFisher Scientific2215365
β-ME (β-mercaptoethanol)FisherBP176-100

Ссылки

  1. Epelman, S., Lavine, K. J., Randolph, G. J. Origin and functions of tissue macrophages. Immunity. 41 (1), 21-35 (2014).
  2. Nelson, P. J. et al. The renal mononuclear phagocytic system. J Am Soc Nephrol. 23 (2), 194-203 (2012).
  3. Wang, Y., Harris, D. C. Macrophages in renal disease. J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).
  4. Islamuddin, M., Qin, X. Renal macrophages and NLRP3 inflammasomes in kidney diseases and therapeutics. Cell Death Discov. 10 (1), 229 (2024).
  5. Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
  6. Mily, A. et al. Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection. J Vis Exp. (163), 61807 (2020).
  7. Huen, S. C., Cantley, L. G. Macrophages in Renal Injury and Repair. Annu Rev Physiol. 79, 449-469 (2017).
  8. Tang, P. M., Nikolic-Paterson, D. J., Lan, H. Y. Macrophages: versatile players in renal inflammation and fibrosis. Nat Rev Nephrol. 15 (3), 144-158 (2019).
  9. Liu, F. et al. Distinct fate, dynamics and niches of renal macrophages of bone marrow or embryonic origins. Nat Commun. 11 (1), 2280 (2020).
  10. Chew, C. et al. Kidney resident macrophages have distinct subsets and multifunctional roles. Matrix Biol. 127, 23-37 (2024).
  11. Cheung, M. D. et al. Resident macrophage subpopulations occupy distinct microenvironments in the kidney. JCI Insight. 7 (20), 161078 (2022).
  12. Epelman, S. et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  13. Feng, D. et al. Cre-inducible human CD59 mediates rapid cell ablation after intermedilysin administration. J Clin Invest. 126 (6), 2321-2333 (2016).
  14. Hu, W. et al. Rapid conditional targeted ablation of cells expressing human CD59 in transgenic mice by intermedilysin. Nat Med. 14 (1), 98-103 (2008).
  15. Giddings, K. S., Zhao, J., Sims, P. J., Tweten, R. K. Human CD59 is a receptor for the cholesterol-dependent cytolysin intermedilysin. Nat Struct Mol Biol. 11 (12), 1173-1178 (2004).
  16. Parkhurst, C. N. et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  17. Cao, Q., Harris, D. C., Wang, Y. Macrophages in kidney injury, inflammation, and fibrosis. Physiology. 30 (3), 183-194 (2015).
  18. Li, G. et al. The role of macrophages in fibrosis of chronic kidney disease. Biomed Pharmacother. 177, 117079 (2024).
  19. Liu, F. et al. Versatile cell ablation tools and their applications to study loss of cell functions. Cell Mol Life Sci. 76 (23), 4725-4743 (2019).
  20. Yashchenko, A. et al. Cx3cr1 controls kidney resident macrophage heterogeneity. Front Immunol. 14, 1082078 (2023).
  21. Duffield, J. S. Macrophages and immunologic inflammation of the kidney. Semin Nephrol. 30 (3), 234-254 (2010).
  22. Lee, S. et al. Distinct macrophage phenotypes contribute to kidney injury and repair. J Am Soc Nephrol. 22 (2), 317-326 (2011).
  23. Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in Tissue Repair, Regeneration, and Fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
  24. Guo, C. et al. Crosstalk between proximal tubular epithelial cells and other interstitial cells in tubulointerstitial fibrosis after renal injury. Front Endocrinol. 14, 1256375 (2023).
  25. Guillot, A. et al. Bile acid-activated macrophages promote biliary epithelial cell proliferation through integrin αvβ6 upregulation following liver injury. J Clin Invest. 131 (9), 132305 (2021).
  26. Kim, S. J. et al. Adipocyte Death Preferentially Induces Liver Injury and Inflammation Through the Activation of Chemokine (C-C Motif) Receptor 2-Positive Macrophages and Lipolysis. Hepatology. 69 (5), 1965-1982 (2019).
  27. Saxena, V. et al. Generation of Atp6v1g3-Cre mice for investigation of intercalated cells and the collecting duct. Am J Physiol Renal Physiol. 325 (6), F770-f778 (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены