需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。
Method Article
这里报道了一种用于肾巨噬细胞选择性消融的方案,以使用人 CD59/中间溶血素细胞消融工具研究其再生。该方法也适用于研究肾脏、肝脏和脂肪组织中其他细胞群的功能和再生。
肾巨噬细胞 (RM) 对肾脏健康、协调免疫监视、组织稳态和对损伤的反应至关重要。以前,我们报道了使用人 CD59 (hCD59)/中间溶血素 (ILY) 细胞消融工具来研究骨髓或胚胎来源的 RM 的不同命运、动力学和生态位。RM 起源于卵黄囊衍生的巨噬细胞、胎肝单核细胞和骨髓来源的单核细胞,并通过循环单核细胞的局部增殖和募集在成年期维持。在这里,我们报告了 RM 选择性消融以研究其再生的详细方案,包括 1) 小鼠 RM 中 hCD59 Cre 诱导表达的产生和表征,2) ILY 的纯化和 ILY 活性的表征,3) 化合物小鼠中 RMs 上 hCD59 表达的诱导,以及 4) ILY 介导的 RM 消融后再生的表征。ILY 特异性和快速消耗复合小鼠中的 RM,在 ILY 给药后 1 天内有效消融巨噬细胞。肾巨噬细胞再生在消融后第 3 天开始,到第 7 天恢复 ~88%。该模型为研究巨噬细胞生物学提供了强大的工具,可用于选择性消融肾脏、肝脏和脂肪组织中的其他细胞群,以研究它们的功能和再生。
肾巨噬细胞 (RM) 是维持肾脏稳态、调节免疫反应和促进损伤后组织修复的必需免疫细胞。它们执行多种功能,包括吞噬作用、抗原呈递以及炎症和抗炎反应的协调 1,2,3。根据当地环境,RM 可以极化为促炎 (M1) 或抗炎 (M2) 表型,从而加剧损伤或促进愈合 4,5,6。RM 失调与急性肾损伤 (AKI) 和慢性肾病 (CKD) 的发生和进展有关,使其成为肾脏健康和病理学的关键参与者 7,8。RM 的来源多种多样,包括胚胎发生过程中卵黄囊衍生的巨噬细胞、胎儿肝单核细胞和成年期的骨髓衍生单核细胞。RM 与出生后肾脏生长平行扩增和成熟,主要起源于出生前的胎儿肝脏单核细胞,并在外周单核细胞的补充下持续到成年的自我维持9。在成人中,循环单核细胞通过稳态或损伤信号被募集到肾脏,在局部微环境影响下分化为巨噬细胞。RM 维持是通过局部增殖和循环单核细胞的定期补充来维持的 9,10,11,12。
我们之前展示了使用人 CD59 (hCD59)/中间溶血素 (ILY) 细胞消融系统作为工具13,14 来研究源自骨髓或胚胎起源的 RM 的不同命运、动力学和微环境生态位9。ILY 通过在靶细胞膜上形成孔隙,在几秒钟内选择性裂解人体细胞15。这种特异性源于 ILY 对人 CD59 (hCD59) 的独家结合亲和力,对缺乏该受体的其他物种的细胞没有相互作用或裂解作用15。基于这一概念,我们设计了一种工具,允许通过应用中间溶血素 (ILY) 在转基因小鼠模型中快速、有条件和靶向地消融人 CD59 表达的细胞14。为了促进该工具的使用,我们通过生成絮凝的 STOP-CD59 敲除小鼠 (ihCD59) 开发了一种条件性和靶向细胞消融模型,其中人 CD59 的表达仅在 Cre 介导的重组13 后发生。以前,发现 CX3CR1cre-EFP 基因仅在 CD11bintF480hi 上表达,定义为肾巨噬细胞9。因此,我们使用 CX3CR1CreER2+/+ 系与 ihCD59 小鼠杂交,在肾巨噬细胞上表达 hCD59。我们成功生成了基因型 ihCD59+/-/CX3CR1CreER+/-9 (+/-、+/+ 和 -/- 分别表示纯合子、半合子和非载体转基因小鼠)的复合小鼠。他莫昔芬在 ihCD59 + /-/CX3CR1CreER+/- 复合小鼠中给药,通过 hCD59 表达有条件标记和标记 RM9。通过 ILY 治疗耗尽 RM 生态位后,外周单核细胞迅速分化为骨髓来源的 RM,有效地重新填充了先前在9 中描述的生态位。这种再生严重依赖于 CX3CR1/CX3CL1 信号轴,强调了它在维持和恢复 RM 群体中的重要作用9。我们还表明,由于其独特的糖酵解能力,胚胎来源的 RM 具有更高的清除免疫复合物的能力,并且比骨髓来源的 RMs 对免疫挑战更敏感9。
我们提出了一个详细的 RM 选择性消融方案,以研究使用 Cre 诱导的 hCD59 (ihCD59) 介导的快速细胞消融在 ILY 后进行再生。注射 ILY 导致在 CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/- 复合小鼠中有条件和特异性表达 hCD59 的 RM 的靶向消融。消融后,我们使用流式细胞术监测巨噬细胞动力学变化,发现巨噬细胞快速耗竭,然后 RM 再生。重组 ILY 在 大肠 杆菌 BL21 (DE3) 细胞中表达,并使用镍-NTA 亲和色谱纯化。通过 SDS-PAGE、分光光度法和溶血测定证实了重组 ILY 的纯度和功能,证明了其特征性的胆固醇依赖性溶细胞素活性。我们使用 ILY 消耗小鼠体内的 RM,在 ILY 给药后 1 天内实现有效的巨噬细胞消融。肾巨噬细胞再生从消融后第 3 天开始,到第 7 天恢复 ~85%。数据表明,再生主要由单核细胞募集驱动。该模型为研究巨噬细胞生物学提供了强大的工具,并具有靶向作肾脏疾病中巨噬细胞群的治疗潜力。 ihCD59/ILY 细胞消融工具可用于研究肾脏、肝脏、脂肪组织和其他器官的细胞功能和再生。
动物研究方案由杜兰大学医学院机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准(方案编号 1482)。实验小鼠 Cx3cr1CreER+/+ 和 ihCD59+/+,年龄为 10-12 周,体重 25-30 克,被安置在特定的无病原体 (SPF) 条件下,位于该大学的动物设施中。所有涉及肾脏隔离的程序均在无菌环境中进行,研究人员戴手套和口罩以防止污染。有关研究中使用的试剂和设备的详细信息,请参阅 材料表。
1. 动物准备
2. ILY 生产 (源自14,15 )
3. 通过 SDS-PAGE 电泳表征 ILY
4. ILY 活性溶血试验
5. 人红细胞 (RBC) 的制备
6.他莫昔芬治疗、RM 耗竭和再生
7. 小鼠安乐死
8. 肾脏消化
9.密度梯度离心
10. 流式细胞术染色、采集
His-Tag 重组 ILY 的纯化遵循与之前14 中描述的相同的方案。ILY 在 大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞中成功表达,用编码 中间链球菌 ILY 基因的质粒转化。用 IPTG 诱导后,靶蛋白过表达明显。表达后,使用镍-NTA 亲和层析纯化 ILY,利用 C 端 His 标签进行特异性结合。通过 SDS-PAGE 分析确认 ILY 的纯度和分子量 (~54 kDa) (图 1A)。...
在本研究中,His 标记的重组 ILY 的成功表达、纯化和功能验证遵循了完善的方案15。然而,该过程涉及几个关键步骤,以确保高蛋白质产量、纯度和生物活性。IPTG 对 大肠 杆菌 BL21 (DE3) 细胞的诱导进行了优化,以平衡蛋白质表达水平,同时最大限度地减少包涵体的形成。尽管该方案很稳健,但为了最大限度地提高产量?...
作者声明,他们没有可能影响本手稿中报告的工作的竞争性经济利益或个人关系。没有任何利益冲突,包括财务、非财务、专业或个人关系,影响研究的设计、实施、解释或呈现。
我们感谢 Qin Lab 的前任和现任成员,感谢他们为开发和完善本研究中使用的方案做出的贡献。我们还感谢俄克拉荷马大学健康科学中心的 R. K. Tweten 博士的团队慷慨提供重组 ILY 质粒,这在这项研究中发挥了重要作用。这项研究得到了美国国立卫生研究院 (NIH) 通过赠款 NIH 5 P51OD011104-58、R01DK129881 (X.Q.) 和 R21OD024931 (X.Q.) 的支持。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.45 µm syringe filter | Millipore | SLHVR33RS | |
4-15% TGX Stain-Free Protein Gels | Bio-Rad | 4568084 | |
6X Loading buffer | Fisher | 50-103-6570 | |
70% Ethanol | WWR Life Science | 64-17-5 | |
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
Affinity resin beads | Millipore | 69670 | |
Ampicillin sodium solution | Zymo Research | A1001-5 | |
Anti-CD11b-PE-Cy7 (Clone M1/70) | Invitrogen | 25-0112-82 | |
Anti-CD16/32 (FcγRIII/II, Clone 93) | eBioscience | 48-0161-80 | |
Anti-CD45-e450 (Clone 30-F11) | eBioscience | 48-0451-82 | |
Anti-F4/80-BV605(Clone BM8) | BioLegend | 123133 | |
Anti-hCD59-PE (Clone OV9A2) | Invitrogen | 12-0596-42 | |
Aqua Live/Dead dye | Invitrogen | L34957A | |
Beads (resin) | Millipore | 69670 | |
Benzonase Nuclease | Millipore | 70664-10KUN | |
BugBuster protein extraction reagent | Millipore | 70584-4 | |
Centrifuge for microtubes | Eppendorf | 5424 | |
Centrifuge for tubes | Thermo Scientific | 75-001-241 | |
Collagenase type IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004188 | |
Corn oil | Sigma Aldrich | C8267 | |
Deoxyribonuclease (DNAse) I | Worthington Biochemical Corporation | LS002007 | |
Detoxi-Gel resin column | Millipore | 69670 | |
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) solution | Corning | 21-031-CV | |
EDTA tubes | BD | 365974 | |
FBS (Fetal bovine serum) | Gibco | 10082-139 | |
Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
HBSS (Hank’s Ballanced Salt Solution) | Gibco | 24020117 | |
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) | Millipore-Sigma | 206-703-0 | |
Isoflurane | VET one | 502017 | |
LB media | |||
LSRFortessa flow cytometer | BD Biosciences | ||
MES [2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid] | Fisher | 50-488-796 | |
MOPS [3-(N-morpholino) propanesulfonic acid] | Fisher | 50-213-522 | |
Percoll density gradient media | Cytiva | 17089101 | |
Peristaltic pump | Fisher Scientific | Discontinued now, use alternative | |
PFA (Paraformaldehyde) | Thermo Scientific | I28800 | |
Purification column | Millipore | UFC900308 | |
rLysozyme solution | Novagen | 20C71110 | |
Shaking water bath | Thermo Scientific | TSSB15 | |
Slide-A-Lyzer dialysis kit | Thermo | 66107 | |
Sodium deoxycholate | Fisher | BP349-100 | Fresh made or less than a month |
Sterile cell strainer (40 μm) | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
Tamoxifen | Sigma Aldrich | 6734 | |
Ultra centrifugal filter | Millipore | UFC900308 | |
Ultrapure water | Thermo | 10977-015 | |
Vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
β-ME (β-mercaptoethanol) | Fisher | BP176-100 |
请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形
请求许可This article has been published
Video Coming Soon
版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有,本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。