使用人 CD59/中间溶血素细胞消融工具快速耗竭肾巨噬细胞

摘要

这里报道了一种用于肾巨噬细胞选择性消融的方案，以使用人 CD59/中间溶血素细胞消融工具研究其再生。该方法也适用于研究肾脏、肝脏和脂肪组织中其他细胞群的功能和再生。

摘要

肾巨噬细胞 （RM） 对肾脏健康、协调免疫监视、组织稳态和对损伤的反应至关重要。以前，我们报道了使用人 CD59 （hCD59）/中间溶血素 （ILY） 细胞消融工具来研究骨髓或胚胎来源的 RM 的不同命运、动力学和生态位。RM 起源于卵黄囊衍生的巨噬细胞、胎肝单核细胞和骨髓来源的单核细胞，并通过循环单核细胞的局部增殖和募集在成年期维持。在这里，我们报告了 RM 选择性消融以研究其再生的详细方案，包括 1） 小鼠 RM 中 hCD59 Cre 诱导表达的产生和表征，2） ILY 的纯化和 ILY 活性的表征，3） 化合物小鼠中 RMs 上 hCD59 表达的诱导，以及 4） ILY 介导的 RM 消融后再生的表征。ILY 特异性和快速消耗复合小鼠中的 RM，在 ILY 给药后 1 天内有效消融巨噬细胞。肾巨噬细胞再生在消融后第 3 天开始，到第 7 天恢复 ~88%。该模型为研究巨噬细胞生物学提供了强大的工具，可用于选择性消融肾脏、肝脏和脂肪组织中的其他细胞群，以研究它们的功能和再生。

引言

肾巨噬细胞 （RM） 是维持肾脏稳态、调节免疫反应和促进损伤后组织修复的必需免疫细胞。它们执行多种功能，包括吞噬作用、抗原呈递以及炎症和抗炎反应的协调 ^1,2,3。根据当地环境，RM 可以极化为促炎 （M1） 或抗炎 （M2） 表型，从而加剧损伤或促进愈合 ^4,5,6。RM 失调与急性肾损伤 （AKI） 和慢性肾病 （CKD） 的发生和进展有关，使其成为肾脏健康和病理学的关键参与者 ^7,8。RM 的来源多种多样，包括胚胎发生过程中卵黄囊衍生的巨噬细胞、胎儿肝单核细胞和成年期的骨髓衍生单核细胞。RM 与出生后肾脏生长平行扩增和成熟，主要起源于出生前的胎儿肝脏单核细胞，并在外周单核细胞的补充下持续到成年的自我维持⁹。在成人中，循环单核细胞通过稳态或损伤信号被募集到肾脏，在局部微环境影响下分化为巨噬细胞。RM 维持是通过局部增殖和循环单核细胞的定期补充来维持的 9,10,11,12。

我们之前展示了使用人 CD59 （hCD59）/中间溶血素 （ILY） 细胞消融系统作为工具^13,14 来研究源自骨髓或胚胎起源的 RM 的不同命运、动力学和微环境生态位⁹。ILY 通过在靶细胞膜上形成孔隙，在几秒钟内选择性裂解人体细胞¹⁵。这种特异性源于 ILY 对人 CD59 （hCD59） 的独家结合亲和力，对缺乏该受体的其他物种的细胞没有相互作用或裂解作用¹⁵。基于这一概念，我们设计了一种工具，允许通过应用中间溶血素 （ILY） 在转基因小鼠模型中快速、有条件和靶向地消融人 CD59 表达的细胞¹⁴。为了促进该工具的使用，我们通过生成絮凝的 STOP-CD59 敲除小鼠 （ihCD59） 开发了一种条件性和靶向细胞消融模型，其中人 CD59 的表达仅在 Cre 介导的重组¹³ 后发生。以前，发现 CX3CR1cre-EFP 基因仅在 CD11bintF480hi 上表达，定义为肾巨噬细胞⁹。因此，我们使用 CX3CR1CreER2^+/+ 系与 ihCD59 小鼠杂交，在肾巨噬细胞上表达 hCD59。我们成功生成了基因型 ihCD59^+/-/CX3CR1CreER^+/-9 （+/-、+/+ 和 -/- 分别表示纯合子、半合子和非载体转基因小鼠）的复合小鼠。他莫昔芬在 ihCD59 ^{+ /-}/CX3CR1CreER^+/- 复合小鼠中给药，通过 hCD59 表达有条件标记和标记 RM⁹。通过 ILY 治疗耗尽 RM 生态位后，外周单核细胞迅速分化为骨髓来源的 RM，有效地重新填充了先前在⁹ 中描述的生态位。这种再生严重依赖于 CX3CR1/CX3CL1 信号轴，强调了它在维持和恢复 RM 群体中的重要作用⁹。我们还表明，由于其独特的糖酵解能力，胚胎来源的 RM 具有更高的清除免疫复合物的能力，并且比骨髓来源的 RMs 对免疫挑战更敏感⁹。

我们提出了一个详细的 RM 选择性消融方案，以研究使用 Cre 诱导的 hCD59 （ihCD59） 介导的快速细胞消融在 ILY 后进行再生。注射 ILY 导致在 CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- 复合小鼠中有条件和特异性表达 hCD59 的 RM 的靶向消融。消融后，我们使用流式细胞术监测巨噬细胞动力学变化，发现巨噬细胞快速耗竭，然后 RM 再生。重组 ILY 在 大肠 杆菌 BL21 （DE3） 细胞中表达，并使用镍-NTA 亲和色谱纯化。通过 SDS-PAGE、分光光度法和溶血测定证实了重组 ILY 的纯度和功能，证明了其特征性的胆固醇依赖性溶细胞素活性。我们使用 ILY 消耗小鼠体内的 RM，在 ILY 给药后 1 天内实现有效的巨噬细胞消融。肾巨噬细胞再生从消融后第 3 天开始，到第 7 天恢复 ~85%。数据表明，再生主要由单核细胞募集驱动。该模型为研究巨噬细胞生物学提供了强大的工具，并具有靶向作肾脏疾病中巨噬细胞群的治疗潜力。 ihCD59/ILY 细胞消融工具可用于研究肾脏、肝脏、脂肪组织和其他器官的细胞功能和再生。

研究方案

动物研究方案由杜兰大学医学院机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准（方案编号 1482）。实验小鼠 Cx3cr1CreER^+/+ 和 ihCD59^+/+，年龄为 10-12 周，体重 25-30 克，被安置在特定的无病原体 （SPF） 条件下，位于该大学的动物设施中。所有涉及肾脏隔离的程序均在无菌环境中进行，研究人员戴手套和口罩以防止污染。有关研究中使用的试剂和设备的详细信息，请参阅 材料表。

1. 动物准备

1. 从 Jackson 实验室获得 CX3CR1CreER^+/+小鼠。将小鼠安置在杜兰大学医学院 （SOM） 的特定无病原体 （SPF） 设施中。在受控环境条件下将动物保持在 12 小时的光照/黑暗循环下。
2. 使用先前生成的具有 C57BL/6 遗传背景的 ihCD59 + / + 小鼠进行育种。将纯合子 CX3CR1CreER^+/+ 小鼠（CX3CR1 表达缺陷）与 ihCD59^+/- 小鼠杂交，产生以下后代基因型： CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^-/-和 CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/-。
3. 通过使用抗 CX3CR1 抗体的流式细胞术分析，确保杂合子 CX3CR1CreER^+/- 小鼠保留功能性 CX3CR1 表达，而纯合子 CX3CR1CreER^+/+ 小鼠缺乏 CX3CR1⁹。

2. ILY 生产 （源自^14,15 ）

1. 第 0 天
   1. 在储存在-80°C的pTrcHis-A质粒 （补充图1） 中检索携带His标记的ILY细菌菌株BL21-DE3-RIPL的冷冻原液。 将 10 μL 细菌原液接种到 40 μL 含有浓度为 1 μg/mL 氨苄青霉素的 Luria 肉汤 （LB） 培养基中。
   2. 将接种的混合物涂在补充有氨苄青霉素 （1 μg/mL） 的 LB 琼脂平板上。将板在 37 °C 下在细菌培养箱中孵育过夜。
2. 第 1 天
   1. 从 LB 琼脂平板中选择 6 个单独的菌落。将每个菌落接种到 3.5 mL 含有氨苄青霉素的 LB 培养基中。将培养物在 37 °C 下孵育过夜。
3. 第 2 天
   1. 将每个 3.5 mL 起始培养物转移到 250 mL 补充有氨苄青霉素的 LB 培养基中。将培养物在 37 °C 下孵育 3 小时，并以 230 x g 振荡以允许细菌生长。
   2. 3小时后，从1 M储备溶液（储存在-20°C）中以1：1000稀释度加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），以达到1 mM的最终浓度。继续孵育 4 小时以诱导蛋白质表达。
   3. 称量空离心瓶并记录重量。将大约 250 mL 的诱导培养物转移到离心瓶中。
   4. 通过在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 15 分钟来沉淀细胞。 弃去上清液，然后称量装有沉淀的瓶子。通过离心后从总重量中减去空瓶重量来计算颗粒重量。
   5. 将细菌沉淀储存在 -20 °C，以便随后提取和纯化 ILY。
4. 第 3 天：ILY 的提取和纯化
   1. 在 50 mL 离心管中混合 30 mL Bug Buster 蛋白提取试剂与 30 μL 苯并酶核酸酶（1200 Kunitz 单位）和 0.9 μL 溶菌酶（10,000 单位酶活性）来制备裂解缓冲液。
   2. 轻轻混合溶液，确保裂解缓冲液均匀。将制备好的裂解缓冲液添加到细菌沉淀 （2-5 g） 中。将混合物彻底涡旋 30-60 秒以完全重悬细菌细胞。
   3. 将重悬溶液均匀分装在两个 50 mL 离心管中。将试管放在冰上并孵育 30-90 分钟。在孵育过程中，使用轨道摇床轻轻摇动试管，每 5-10 分钟短暂涡旋 10-15 秒，以增强细胞裂解。
   4. 孵育后，将裂解物在 4°C 下以 4,900 x g 离心 30 分钟。
   5. 使用 1 mL 移液器吸头，用自来水彻底清洗色谱柱，以去除之前使用时残留的树脂。
   6. 用 70% 乙醇冲洗色谱柱以对其进行消毒。用冷 ddH₂O 洗涤色谱柱 2 次至 3 次，以去除任何残留的乙醇。将色谱柱放入支架中。
   7. 加入 6-10 mL 冷 ddH₂O 以进一步洗涤和平衡色谱柱以进行纯化。向色谱柱中加入大约 3 mL 树脂珠。将色谱柱连接到速度设置为 30 的蠕动泵。
   8. 加入 10 mL 冷 ddH₂O 以完全悬浮树脂并准备进行蛋白质结合。用 15 mL 的 1x 充电缓冲液洗涤树脂珠，以制备用于蛋白质结合的树脂。
   9. 在新鲜试管中离心后收集细菌裂解物上清液，确保丢弃沉淀。使用带有注射器的 0.45 μm 过滤器过滤上清液，以去除任何残留的细胞碎片。
   10. 将 20-25 mL 过滤后的细菌裂解物分三轮通过色谱柱。每次通过后，收集 20 μL 流通液并将其标记为 PE，以便以后进行光密度 （OD） 测量。
   11. 用 20-30 mL 结合缓冲液洗涤色谱柱，以去除未结合的蛋白质。用 20-30 mL 洗涤缓冲液洗涤色谱柱。收集 20 μL 洗涤馏分用于 OD 测量。
   12. 通过添加 10-20 mL 洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白质。3-4 分钟后开始使用微量离心管收集洗脱液。每管收集约 1 mL，填充 15-17 个试管。
   13. 使用分光光度计测量 A280 处每个洗脱级分的吸光度。在 A280 读数期间使用洗脱缓冲液作为空白。收集在 A280 处吸光度显着增加的试管，因为它们含有 His 标记的 ILY 蛋白，该蛋白通常存在于试管 13 周围的馏分中。
   14. 将含有 ILY 蛋白的洗脱级分（或试管）储存在 4 °C 下。 在第二天内继续进行进一步的步骤，以确保最佳的蛋白质稳定性。
       注：尽可能在冰上或 4 °C 下执行所有步骤，以保持蛋白质完整性。
5. 第 4 天：从洗脱液中去除内毒素
   1. 用 6-10 mL 超纯水冲洗去除内毒素的树脂柱。轻轻按压色谱柱以调节流量。
   2. 用 10 mL 1% 脱氧胆酸钠溶液（新鲜制备或不超过 1 个月）冲洗色谱柱，以去除结合的内毒素。用 6-10 mL 超纯水再次冲洗色谱柱，以去除残留的去污剂。
   3. 将制备好的蛋白质样品涂在树脂柱上。在室温 （RT） 下将样品在色谱柱中孵育 1 小时，以实现最佳内毒素结合。
   4. 收集初始流出馏分。向色谱柱中加入 ddH₂O 以进一步洗脱，并在大约 10 个试管（每管 1 mL）中收集洗脱的馏分。
   5. 将树脂柱储存在 4 °C 的 25% 乙醇中以备将来使用。测量洗脱蛋白质样品的光密度 （OD） 以量化产量。预计从第一批次洗脱中回收约 50%-70% 的总蛋白。
6. 第 5-6 天：透析
   1. 通过高压灭菌 1600 mL 蒸馏去离子水 （ddH₂O） 制备 2 L 透析缓冲液。将 200 mL 的 10x PBS、200 mL 甘油和 3.5115 g MES（2-（N-吗啉代）乙磺酸）添加到高压灭菌的水中。
   2. 用磁力搅拌棒搅拌混合物，直到所有试剂完全溶解。将所得缓冲液储存在 4 °C。
   3. 将储存的洗脱组分添加到透析试剂盒中，然后用针头去除透析试剂盒中的空气。使用透析试剂盒在 4 °C 下透析蛋白质溶液 24 小时，搅拌速度设置为约 2。
   4. 配置透析试剂盒以确保其完全浸没在缓冲液中。第二天，用 2 L 容器中的新鲜透析缓冲液替换透析试剂盒中的透析缓冲液。继续透析 24 小时。
   5. 小心地将整个溶液（包括任何白色沉淀物）转移到无菌管中，以保留可能聚集的 ILY 蛋白。按照制造商的离心说明，使用离心过滤装置浓缩 ILY 蛋白。
   6. 将浓缩的 ILY 蛋白分装成 200 μL 份量，装在无菌管中。用日期和名称标记每个试管。将等分试样储存在 -80 °C 以备将来用于凝胶电泳和溶血测定。

3. 通过 SDS-PAGE 电泳表征 ILY

1. 通过用 ddH₂O 稀释运行缓冲液 （20x） 来制备 MOPS SDS 运行缓冲液 （1x）。
2. 将 90 μL 6x 上样缓冲液与 10 μL β-巯基乙醇 （β-ME） 混合，在通风橱中制备样品缓冲液。充分混合溶液以确保完全均质。
3. 将制备的样品与上样缓冲液混合，最终体积为 30 μL。解冻样品并剧烈涡旋以确保完全混合。
4. 将样品在 95 °C 下加热 5 分钟以使蛋白质变性。将样品加载到 4%-20% SDS-PAGE 凝胶上。在 80 V 的恒定电压下运行电泳 90 分钟。
5. 小心地打开凝胶盒，将凝胶浸入 ddH₂O 中 5 分钟。使用摇床重复洗涤步骤 2 次。
6. 在室温 （RT） 下用考马斯亮蓝对凝胶染色 1 小时。在 ddH₂O 中洗涤凝胶 30 分钟。用新鲜的 ddH₂O 代替水，并在摇床上孵育凝胶过夜至 3 天以完全脱色。
7. 使用相机捕获染色凝胶的图像（图 1A）。使用 ImageJ 软件分析凝胶以进行定量和定性评估。

4. ILY 活性溶血试验

1. 在室温下完全解冻储存的 ILY （Intermedilysin） 样品。彻底涡旋解冻的样品以确保均匀性，因为 ILY 在解冻时会聚集。
2. 设置一个 96 孔板进行连续稀释。向第一个孔中加入 160 μL ILY 储备液 （26.7 ng/μL）。将 80 μL 的 1x PBS 添加到同一行或列中的每个后续孔中。
3. 将 80 μL ILY 溶液从第一个孔转移到第二个孔。通过上下移液充分混合，以确保溶液均匀。将 80 μL 从第二个孔转移到第三个孔中，并充分混合。
4. 对每个孔重复此过程，将 80 μL 从前一个孔转移到下一个孔中，直到制备所需的稀释度。将 80 μL 转移到最后一个孔后，从该孔中丢弃 80 μL，以确保整个板的体积一致。

5. 人红细胞 （RBC） 的制备

1. 将 1-2 mL 新鲜人血抽入含有抗凝剂（如 EDTA）的试管中。在室温下以 3,000 x g 离心血液 5 分钟。
2. 弃去上清液，用 PBS 2x-3x 洗涤人 RBC 沉淀，直到上清液澄清。通过将 10 μL RBC 添加到 900 μL 1x PBS 中以达到 1：100 稀释来稀释洗涤的人 RBC。
3. 向每个孔中加入 10 μL 稀释的人红细胞。从稀释板中向每个孔中加入 30 μL 连续稀释的 ILY 溶液。加入 160 μL 的 1x PBS，使最终体积达到每孔 200 μL（起始浓度：4 ng/μL）。
4. 向对照孔中加入 10 μL 稀释的人红细胞。向对照孔中加入 190 μL 水或 1x PBS 用于阴性对照。轻轻敲击板子，混合板子。
5. 将板在 37 °C 下孵育 30 分钟以允许溶血发生。将板以 3,000 x g 离心 5 分钟以沉淀任何完整的人红细胞。
6. 小心地将 100 μL 上清液从每个孔转移到新的平底 96 孔板中。使用酶标仪测量上清液在 405 nm 处的吸光度。
7. 通过将样品的吸光度值与对照¹⁶ 进行比较来计算 ILY 的溶血活性。

6.他莫昔芬治疗、RM 耗竭和再生

1. 将玉米油预热至 42 °C。 将 100 mg 他莫昔芬溶于 5 mL 预热的玉米油中，制备浓度为 20 mg/mL 的储备液。
2. 以 100 μg/g 体重的剂量对 10-12 周龄雄性 CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- 小鼠腹膜内 （ip） 施用他莫昔芬。连续 3 天重复他莫昔芬注射。
3. 最后一次他莫昔芬注射后等待 15 天，以允许 Cre 介导的 hCD59 表达。
4. 以 120 ng/g 体重的剂量将单剂量的中间溶血素 （ILY） 静脉注射到 CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- 小鼠和 CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^-/- 同窝对照中。
5. 通过在 ILY 给药后 1、3 和 7 天进行流式细胞术来监测和确认 RM 消融和随后的再生¹⁷。

7. 小鼠安乐死

1. 将动物放在适当的腔室中，并根据 IACUC 方案将其暴露在异氟醚中。通过检查是否有反射（例如踏板撤退反射）来验证麻醉。
2. 一旦小鼠完全麻醉且无反应，进行颈椎脱位以确保安乐死。通过验证是否存在反射（例如踏板撤退反射）来确认安乐死。
3. 使用无菌手术刀在腹部做一个约 2 厘米的中线切口，然后轻轻缩回皮肤以露出胸腔。使用钝头手术剪刀沿胸骨打开胸腔，露出心脏。
4. 将 21G-23G 针头插入左心室。开始用 10-20 mL 冷 PBS 灌注以冲洗血液。
5. 切开右心房，让血液从循环中流出。继续灌注，直到肾脏看起来苍白，表明血液清除有效。
6. 将肾脏靠在体背壁上。用镊子和剪刀轻轻地将肾脏与周围组织分开。切除肾胶囊并立即将肾脏置于冷 PBS 中以防止降解。

8. 肾脏消化

1. 通过混合 9 mL HBSS（不含 Ca/Mg）、1 mL 胶原酶 IV （5 mg/mL） 和 20 μL DNase I （10 mg/mL） 来制备消化酶混合物。准备新鲜的酶溶液，并将其保存在冰上直至使用。
2. 在含有 5 mL HBSS 的培养皿中，使用无菌剪刀将肾脏切成小碎片（理想情况下≤ 1 毫米）。将肾组织片段转移到含有 10 mL 制备酶溶液的 15 mL 试管中。
3. 将试管在 37 °C 下孵育 30 分钟，轻轻搅拌以解离组织。使用移液管或注射器柱塞轻轻研磨组织，以进一步解离细胞团块。
4. 通过将细胞悬液通过 40 μm 细胞过滤器去除组织碎片。将细胞悬液在 18 °C 下以 650 x g 离心 10 分钟。
5. 离心后小心倒出缓冲液。将沉淀重悬于 5 mL 裂解缓冲液中，并在室温下孵育 5 分钟以裂解红细胞。
6. 用 PBS 洗涤细胞以去除裂解缓冲液。将所得单细胞悬液维持在冰上直至进一步使用。

9.密度梯度离心

1. 为了富集造血细胞，将之前洗涤的细胞沉淀重悬于 10 mL 的 30% 密度梯度溶液中。在离心管中小心地将溶液铺在 3 mL 的 70% 密度梯度溶液上。
2. 将梯度以 500 x g 离心 30 分钟，不要刹车。离心后，小心收集 30% 和 70% 溶液之间的相层;该层包含富集的单细胞。
3. 每次以 500 x g 离心 10 分钟，用 10 mL PBS 洗涤收集的细胞 2 次。在 1.5 mL 试管中将最终细胞沉淀重悬于 1 mL FACS 缓冲液（1x PBS 含 2% FBS）中。
4. 在明场显微镜下使用血细胞计数器对细胞进行计数。将细胞浓度调节至 2 x 10⁶ 个细胞/mL。

10. 流式细胞术染色、采集

1. 将小鼠肾组织制备的单细胞悬液的细胞浓度调整至 2-3 x 10⁶ 个细胞/mL，用于流式细胞术分析。
2. 以 650 x g 离心 5 分钟，在 1.5 mL 试管中沉淀细胞。将细胞沉淀重悬于 1 mL FACS 缓冲液中。
3. 添加 1：200 稀释度的抗 CD16/32 抗体，以阻断非特异性 Fc 受体结合。在室温下将细胞孵育 15 分钟。
4. 按照制造商的说明，使用 Aqua Live/Dead 染料区分活细胞和死细胞。
5. 用 1：100 稀释的预偶联抗体对细胞进行染色，包括 CD45-e450、CD11b-PE-Cy7、hCD59-PE 和 F4/80-BV605。将抗体混合物添加到细胞悬液中。
6. 将样品在 4 °C 下避光孵育 30 分钟，以保护荧光团免受光漂白。用 FACS 缓冲液（含 2% 胎牛血清的 PBS）以 650 x g 离心 5 分钟，洗涤染色细胞 2 次。
7. 将细胞在 1% 多聚甲醛 （PFA） 中在冰上固定 30 分钟。用 FACS 缓冲液洗涤固定细胞 2 次以去除残留的 PFA。
8. 使用流式细胞仪采集染色和固定的细胞。使用软件分析数据。
9. 如9中所述，使用标记物 CD45、CD11b 和 F4/80 鉴定肾脏和其他组织驻留的巨噬细胞和小胶质^细胞。
10. 执行初始设门，以根据前向散射 （FSC） 和侧向散射 （SSC） 曲线选择活细胞。通过前向散射区域 （FSC-A） 与前向散射高度 （FSC-H） 上的门控来消除双峰。使用 LIVE/DEAD 活力染料排除死细胞。
11. 通过设门 CD45 + 群体来富集免疫细胞。将驻肾巨噬细胞定义为 CD45 + 群体中的 CD11b + F4 / 80 ++ 细胞，如门控策略所示（图 2A）。
12. 将小胶质细胞群定义为 CD11b + CD45ⁱⁿt 细胞（图 2B）。在流式细胞仪上执行数据采集。使用软件进行最终分析以完成流式细胞术研究。

结果

His-Tag 重组 ILY 的纯化遵循与之前¹⁴ 中描述的相同的方案。ILY 在 大肠杆菌 BL21 （DE3） 细胞中成功表达，用编码 中间链球菌 ILY 基因的质粒转化。用 IPTG 诱导后，靶蛋白过表达明显。表达后，使用镍-NTA 亲和层析纯化 ILY，利用 C 端 His 标签进行特异性结合。通过 SDS-PAGE 分析确认 ILY 的纯度和分子量 （~54 kDa） （图 1A）。...

讨论

在本研究中，His 标记的重组 ILY 的成功表达、纯化和功能验证遵循了完善的方案¹⁵。然而，该过程涉及几个关键步骤，以确保高蛋白质产量、纯度和生物活性。IPTG 对 大肠 杆菌 BL21 （DE3） 细胞的诱导进行了优化，以平衡蛋白质表达水平，同时最大限度地减少包涵体的形成。尽管该方案很稳健，但为了最大限度地提高产量?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm syringe filter	Millipore	SLHVR33RS
4-15% TGX Stain-Free Protein Gels	Bio-Rad	4568084
6X Loading buffer	Fisher	50-103-6570
70% Ethanol	WWR Life Science	64-17-5
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer	Gibco	A1049201
Affinity resin beads	Millipore	69670
Ampicillin sodium solution	Zymo Research	A1001-5
Anti-CD11b-PE-Cy7 (Clone M1/70)	Invitrogen	25-0112-82
Anti-CD16/32 (FcγRIII/II, Clone 93)	eBioscience	48-0161-80
Anti-CD45-e450 (Clone 30-F11)	eBioscience	48-0451-82
Anti-F4/80-BV605(Clone BM8)	BioLegend	123133
Anti-hCD59-PE (Clone OV9A2)	Invitrogen	12-0596-42
Aqua Live/Dead dye	Invitrogen	L34957A
Beads (resin)	Millipore	69670
Benzonase Nuclease	Millipore	70664-10KUN
BugBuster protein extraction reagent	Millipore	70584-4
Centrifuge for microtubes	Eppendorf	5424
Centrifuge for tubes	Thermo Scientific	75-001-241
Collagenase type IV	Worthington Biochemical Corporation	LS004188
Corn oil	Sigma Aldrich	C8267
Deoxyribonuclease (DNAse) I	Worthington Biochemical Corporation	LS002007
Detoxi-Gel resin column	Millipore	69670
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) solution	Corning	21-031-CV
EDTA tubes	BD	365974
FBS (Fetal bovine serum)	Gibco	10082-139
Glycerol	Fisher	BP229-1
HBSS (Hank’s Ballanced Salt Solution)	Gibco	24020117
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)	Millipore-Sigma	206-703-0
Isoflurane	VET one	502017
LB media
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences
MES [2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid]	Fisher	50-488-796
MOPS [3-(N-morpholino) propanesulfonic acid]	Fisher	50-213-522
Percoll density gradient media	Cytiva	17089101
Peristaltic pump	Fisher Scientific		Discontinued now, use alternative
PFA (Paraformaldehyde)	Thermo Scientific	I28800
Purification column	Millipore	UFC900308
rLysozyme solution	Novagen	20C71110
Shaking water bath	Thermo Scientific	TSSB15
Slide-A-Lyzer dialysis kit	Thermo	66107
Sodium deoxycholate	Fisher	BP349-100	Fresh made or less than a month
Sterile cell strainer (40 μm)	Fisher Scientific	22-363-547
Tamoxifen	Sigma Aldrich	6734
Ultra centrifugal filter	Millipore	UFC900308
Ultrapure water	Thermo	10977-015
Vortex mixer	Fisher Scientific	2215365
β-ME (β-mercaptoethanol)	Fisher	BP176-100