JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه الدراسة منهجية لتوصيل العلاجات إلى شبكية العين والأعصاب البصرية للفئران البالغة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم طريقة فريدة لاسترجاع الأنسجة لمجموعة من أعلى إلى أسفل من العصب البصري وشبكية العين في الفئران البالغة.

Abstract

إن التوصيل العلاجي إلى الجزء الخلفي من العين ، بما في ذلك شبكية العين والعصب البصري ، معقد بسبب وجود حواجز دموية في الدماغ والدم والشبكية. تستخدم نماذج الصغيرة ، مثل الفئران ، لدراسة أمراض العين المختلفة. في حين أن التوصيل العلاجي للعين الخلفية يمثل تحديا ، إلا أن تحقيقه ضروري لعلاج اضطرابات العين ، والتي يتطلب الكثير منها التحقق من الصحة في نماذج الصغيرة من أجل الأهمية الانتقالية. لذلك ، يتم تقديم تقنيتين للتوصيل العلاجي الخلفي: الحقن داخل الجسم الزجاجي (IVI) والحقن خلف البصيلة (RBI) للاستخدام في الفئران البالغة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم طريقة لإزالة الكتلة المختلطة للعيون والأعصاب البصرية لمختلف تقنيات التحليل النسيجي والجزيئي. يتيح بروتوكول التشريح المراقبة الكاملة للنظام العصبي البصري مع تقليل إصابة ما بعد الوفاة لأنسجة الشبكية والعصب البصري. تم تحقيق التوصيل الناجح للسيكلوسبورين العلاجي إلى شبكية العين والعصب البصري ، مع ملاحظة تركيزات يمكن اكتشافها بعد أربع وعشرين ساعة من الحقن باستخدام كل من IVI و RBI. علاوة على ذلك ، تم استخراج عينات الشبكية والأعصاب بنجاح لتحليل الأنسجة النسيجية للعين بالكامل ، مما يسهل المراقبة الشاملة لشبكية العين والنظام العصبي البصري الأوسع.

Introduction

يعد توصيل العلاجات إلى شبكية العين والعصب البصري أمرا صعبا للغاية بسبب التشريح المعقد للعين1،2 ، وتحديدا وجود حاجز الدم والشبكية (BRB) 3،4،5. يعمل BRB على حماية شبكية العين من غزو الدورة الدموية الجهازية ، ولكنه يمثل معارضا صعبا للإدارة العلاجية حيث غالبا ما يتم حظر الدورة العلاجية الجهازية بواسطة BRB6،7. يمكن أن تنتشر الجزيئات الصغيرة المحبة للدهون بسهولة من خلال BRB ، لكن الجزيئات الأكبر والمحبة للماء تواجه صعوبة في الوصول إلى شبكيةالعين 6. تتيح الحقن داخل الجسم الزجاجي (IVI) وخلف البصيلة (RBI) توصيل الأدوية إلى أنسجة العين ، والتغلب على القيود التي يفرضها BRB. يعمل IVI كحل وسط واعد من خلال إعطاء العلاجات في البيئة الداخلية للعين8،9. تتطلب هذه الطريقة عبور الدواء عبر الجسم الزجاجي ، وبالتالي تجاوز BRB ، والانتشار عبر شبكية العين والمشيمية من أجل الوصول إلى العصب البصري7. يتم تسليم بنك الاحتياطي الهندي خلف العين في الفضاء retrobulbar10. يمكن تقديم العلاجات عن طريق الانتشار عبر الأنسجة والغدد في الفضاء خلف البصلي ، مما يؤثر على العصب البصري والهياكل المحيطة به دون الدخول مباشرة إلى شبكية العين ، مما يحافظ على سلامة BRB. من خلال توصيل الأدوية مباشرة أو غير مباشرة إلى العين ، يمكن لكل من الحقن داخل الجسم الزجاجي وخلف البصيلة تحقيق تركيزات موضعية أعلى من الدواء العلاجي ، مما يعزز فعاليته مقارنة بالإعطاء الموضعي أو الجهازي (عن طريق الفم أو الوريد)2. هذا مهم بشكل خاص للعلاجات التي تتطلب عملا سريعا أو فاعلية عالية ، كما هو موضح في العديد من أمراض العين. يحد التسليم المستهدف أيضا من تعرض بقية الجسم للدواء ، مما يقلل من خطر الآثار غير المستهدفة ويساعد على تقليل الآثار الضارة المحتملة التي يمكن أن تحدث عند إعطاء الأدوية موضعيا أو شفويا أو عن طريق الوريد11.

الحقن الأخرى حول العين ، مثل تحت الملتحمة ، والوتر الخلفي ، وتحت الشبكية ، لها فوائدها وقيودهاالخاصة 2،5. وقد لوحظ أن حقن subtenon الخلفي لتقديم تركيزات عالية من المخدرات إلى أنسجة العين; ومع ذلك ، فإن حقن subtenon أقرب إلى الصلبة من الأوعية الدموية المدارية5،12. في المقابل ، يضع RBI العلاج بالقرب من العصب البصري من الوتر السفلي الخلفي أو تحتالملتحمة 13. قد يعني هذا أن أمراض العصب البصري تفضل العلاجات التي يقدمها RBI على أنواع الحقن الأخرى حول العين. الحقن السفلية الخلفية لها مخاطر مرتبطة ، بما في ذلك الحول والخيمة وارتفاع ضغط العين5. يعد ارتفاع ضغط العين أيضا عامل خطر تم الإبلاغ عنه في حقن IVI وتحت الملتحمة وتحت الشبكية2. غالبا ما تتطلب أنواع الحقن هذه جرعات متكررة من أجل تحقيق التأثير العلاجي المطلوب2. تشمل عوامل الخطر الأخرى المرتبطة بالحقن تحت الشبكية والحقن تحت الملتحمة و IVI تكوين إعتام عدسة العين ونزيف الشبكية وانفصال الشبكية والالتهاب2. تعتبر حقن IVI وتحت الشبكية والحقن تحت الملتحمة أكثر توغلا من حقن RBI ، حيث أن هذه الحقن تتم داخل العين2. يمكن اعتبار RBI أقل توغلا لأنه يضع العلاج في الفضاء خلف البصيلة ، دون إدخال الإبرة مباشرة في كرة العين. استراتيجيات التوصيل العلاجي الأخرى الأقل توغلا ، مثل الإعطاء الموضعي ، لا ترقى إلى مستوى توصيل الدواء الكافي ، حيث يتم الاحتفاظ بأقل من 5٪ من الدواء على سطح العين2،5.

IVI هي تقنية بارزة في النماذج قبل السريرية تستخدم لقدرتها على توصيل العوامل العلاجية مباشرة إلى الجزء الخلفي من العين. يقوم IVI بتوصيل الدواء مباشرة إلى الخلط الزجاجي ، مما يجعله تقنية توصيل مفضلة للعلاج الموضعي14. تسمح تقنية IVI للعلاج بتجاوز حاجز الشبكية الدموي ، وهو عائق شائع أمام اختراق الدواء في شبكيةالعين 14. يقدم IVI فرصة للالتهاب وتلف هياكل العين ، لذلك يجب استخدام الالتزام الدقيق بالإجراء14. لتقليل انفصال الشبكية وتكوين إعتام عدسة العين ، Chiu et al. يصف نهج IVI الذي يؤكد على إدخال وحقن شطبة بزاوية 45 درجة على مستوى المستوى المسطح ، وتجنب العدسة وشبكية العين وعضلات العين والأوعيةالدموية 15. في هذه التقنية ، يتم إدخال إبرة 30 جم في صلبة الأنف للتوصيل العلاجي15. لا يزال IVI مرتبطا بالمخاطر بسبب طبيعته الغازية. تشمل المخاطر المحتملة انفصال الشبكية أو تكوين إعتام عدسة العين أو التهاب باطن المقلة أو النزيف16. تزيد الطبيعة الغازية لتقنيات IVI أيضا من ضغط العين ، كما هو موضح في تجربة أجراها Ikjong Park et al.16 على عيون الخنازير. تظهر الدراسة تغيرات في ضغط العين خلال مراحل مختلفة من إدخال الإبرة وحقن السوائل. أبلغوا عن تباين كبير في ضغط العين أثناء الإجراء16.

تم استخدام RBIs بنجاح في الدراسات السابقة كوسيلة للتوصيل العلاجي للقوارض. قارنت إحدى هذه الدراسات تأثيرات نظائر البروستاجلاندين المختلفة المعطاة عبر RBI17. تم إعطاء الفئران البيضاء RBI بإبرة 26 جم من 0.1 مل يتم إدخالها من خلال المنطقة الجانبية للقبوب السفلي بزاوية 45 درجة17. تم تكييف البروتوكول المستخدم في هذه الدراسة من طريقة موصوفة سابقا حيث تم تخدير الفئران عن طريق حقن الكلورالهيدرات18 داخل الصفاق (IP). قارنت دراسة أخرى أجريت على الفئران القطرات الموضعية مع الحقنretrobulbar 19. تم تخدير الفئران عن طريق حقن IP من الكيتامين / الزيلازين ، وتم إعطاء RBI عن طريق إبرة 30 جم19. على عكس طرق التخدير التي تمت مناقشتها سابقا ، استخدمت إحدى الدراسات التي لاحظت تأثيرات RBI على الدهون المدارية الأيزوفلوران الاستنشاقي لتخدير الفئران قبل RBI20. في حين أن هذه الدراسات توفر نظرة ثاقبة حول التخدير ومواصفات الإبرة التي يمكن أن تكون ناجحة ، إلا أن وضع والتعامل معها أثناء العملية لم تتم مناقشتها.

تجري دراسات مختلفة أجريت على الفئران أيضا RBIs لطرق التوصيل العلاجي. قارنت إحدى الدراسات RBI بحقن وريد الذيل الجانبي لإحداث متلازمة كلويةبنجاح 21. قارنت دراسة ثانية أيضا نفس تقنيتي الحقن في إدارة وسائط التباين لتصوير القلب22. تم تخدير الفئران بالأيزوفلوران الاستنشاقي وحقنها في الجانب الإنسي من العين22. قامت كلتا الدراستين بتكييف طريقة RBI الخاصة بهما من بروتوكول مكتوب مسبقا. من المهم ملاحظة أن هذا البروتوكول أطلق على حقنهم اسم الحجنة على أنها مدارية رجعية ولكنه وصف موقع الحقن بأنه الفضاء خلف البصيلة خلف العين. استخدم مؤلفو هذا البروتوكول الأيزوفلوران الاستنشاقي كطريقة تخدير مفضلة ، مشيرين إلى وقت التنشيط السريع والتعافي للفئران23. بالنسبة ل RBI ، كانت العين بارزة جزئيا من التجويف عن طريق الضغط على الجلد حول العين23. بعد ذلك ، تم إدخال الإبرة في الجانب المائل للمكنة الإنسية لأسفل بزاوية 30 درجة وتم إدخالها حتى وصلت إلى قاعدة العين23. يجب توخي الحذر عند الضغط على ، حيث قد يحدث انسداد عرضي لتدفق الدم أو انهيار القصبةالهوائية 23. الحاقن أعمى أيضا عن طرف الإبرة عند إدخاله ، وبالتالي فإن إتلاف العين يمثل خطرا مرتبطا به. 23 يعد إلحاق الضرر بالعين عند الإعطاء العلاجي خطرا بالغ الأهمية في هذه التجربة ، لأن التسبب في إصابة إضافية يقوض نتائج الدراسة بشكل مباشر. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن تقنية تحديد المواقع والمناولة الموصوفة سابقا أجريت على الفئران ولم تتضمن تعليقات على قابلية التطبيق على الفئران.

هناك العديد من الطرق التي تمت من خلالها محاولة إزالة العصب البصري والشبكية. استكشفت إحدى هذه الطرق إزالة الأعصاب البصرية والعينين في كتلة ، مع الحفاظ على chiasm البصريالسليم 24. هذه الطريقة هي الأكثر قابلية للمقارنة مع الدراسة الحالية حيث يتم أيضا الحفاظ على العيون الفردية والأعصاب البصرية لإزالة الكتلة. ومع ذلك ، يتم فصل chiasm البصري. سيكون توخي الحذر في هذا الإجراء ذا أهمية قصوى نظرا لتعقيد الإجراء. في الطريقة الحالية ، نبدأ التشريح عبر الجمجمة الذيلية ونعمل بشكل منحرف من أجل توفير الوصول بطريقة تحد من تلف الأعصاب البصرية وتسمح للعصب بأكمله بالبقاء سليما. علاوة على ذلك ، فإن الحفاظ على العصب سليما ومتصلة بالعين أمر بالغ الأهمية لعملية التضمين ، حيث يمكن أن يتوافق تلف كل جزء من العصب مع ملاحظة مرضية مختلفة24. من المهم مراعاة اتجاه العصب البصري لأن كيفية تضمينه تسمح بمقاطع عرضية مختلفة ، والتي قد تكون مهمة للتحليل النسيجي.

يتكون جهاز مصنوع حسب الطلب يعرف باسم طاولة عمليات العيون في مختبر الصغيرة (SALOOT ، منصة جراحة العيون) من سلسلة من المواد المطبوعة ثلاثية الأبعاد لتوفير التخدير وتثبيت في وضع مستقر للحقن العلاجية للعين. يسمح تصميم SALOOT باستقرار الرأس وهياكل العين لإجراءات طب العيون ، مما يحسن سرعة العمليات وقابليتها للتكرار مع السماح بتوصيل التخدير بالغاز ومسح جزيئات الزفير. SALOOT عبارة عن كتلة مطبوعة ثلاثية الأبعاد تتميز بتخفيض مقعر لتثبيت جسم الفئران بمنطقة أضيق في المقدمة لتثبيت رأس في مخروط الأنف مع مدخل الأيزوفلوران. يوجد تحت مخروط الأنف خزان صغير ومخرج عادم. تم تطوير الطرق التالية لتوصيل العين العلاجي واسترجاع أنسجة العين بدقة. تم تصميمها لدراسة الأنسجة بعد صدمة العين ، لذلك من الأهمية بمكان تحديد آثار الصدمة والحقن والعلاج والتشريح لتجنب التفسير المربك للنتائج.

تقدم هذه المقالة طريقتين للحقن العلاجي للعين ، الحقن داخل الجسم الزجاجي والحقن خلف البصيلة ، للاستخدام في الفئران البالغة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم طريقة استرجاع الأنسجة لإزالة العصب البصري السليم وشبكية العين من فأر بالغ. تتيح هذه التقنيات التحقيق في آثار العين وحول العين لعلم الأمراض والعلاج المستحث.

Protocol

أجريت جميع التجارب وفقا لبيان ARVO لاستخدام في أبحاث طب العيون والبصرية وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها في جامعة ولاية أوهايو. ذكور Sprague Dawley الفئران التي تزن ~ 200 غرام وحوالي شهرين من العمر تم استخدامها لهذه الدراسة25. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. الحقن داخل الجسم الزجاجي (IVI)

  1. قم بتوصيل الأيزوفلوران ويؤدي النفايات إلى منافذ تثبيت SALOOT. تخدير باستخدام إجراءات الأيزوفلوران القياسية باتباع بيان ARVO لاستخدام في أبحاث العيون والبصر وبروتوكول IACUC المعتمد.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، إذا كان بالفعل تحت التخدير من جلسة اختبار أخرى للعيون (على سبيل المثال ، مزيج الكيتامين / الزيلازين ؛ 90 مجم / كجم من الكيتامين و 10 مجم / كجم زيلازين) ، انقل إلى منصة جراحة العيون وقم بمعايرة التخدير بالأيزوفلوران (نسبة 3 أكسجين: 3 إيزوفلوران) لضمان الحفاظ على عمق التخدير الكافي.
  2. ضع منصة جراحة العيون مع المخدر تحت مجهر التشغيل الحي. تقييم عمق التخدير عن طريق منعكس سحب الدواسة.
  3. ضع قطرة أو قطرتين من محلول العيون 0.5٪ رباعي الكلائين هيدروكلوريد في العين أو العينين اللواتي يتم إجراء عملية جراحية. ضع مرهم العين الموضعي المزلق مثل الهيبروميلوز 0.3٪ على العين المقابلة إذا لم يتم إجراء أي تلاعب.
    1. بعد ذلك ، استخدم قطرة أو قطرتين من 5٪ بوفيدون اليود على سطح العين ، وباستخدام قطعة قطن ، ضع بوفيدون اليود على الجلد المحيط بالعين.
  4. استخدم حقنة سعة 10 ميكرولتر بإبرة 33 جم بطرف نمط 4 بطول 10 مم وزاوية 15 درجة واسحب 0.9٪ كلوريد الصوديوم المضاد للجراثيم. اغسل المحقنة والإبرة بالمحلول الملحي قبل غمس الإبرة في معقم الخرز الساخن.
    1. اتركه ليبرد قبل المتابعة. بعد أن تبرد الإبرة ، قم بوضع العلاج ذي الأهمية إلى الكمية المطلوبة (4 ميكرولتر).
      ملاحظة: لإثبات دراسات المفهوم ، تم استخدام حبر الوشم غير المخفف وصبغة إيفان الزرقاء في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). تم خلط مسحوق إيفان الأزرق مع PBS حتى يصبح معتما. لدراسات الإثبات العلاجي للمفهوم ، تم استخدام التركيزات التالية: ibudilast عند 1 مجم / مل ، حمض tauroursodeoxycholic (TUDCA) 5 مجم / مل ، حقن السيكلوسبورين ، 250 مجم / مل ، وأناكينرا 100 مجم / 0.67 مل. تم تخفيف المساحيق العلاجية في محلول ملحي مضاد للجراثيم بنسبة 0.9٪.
  5. باستخدام ملقط العين الناعم مع الأسنان ، أمسك الأنسجة الصلبة برفق في الأطراف لتحقيق الاستقرار. سيكون هناك حلقة حمراء باهتة حول القزحية. استخدم هذه الحلقة كمعلم ، وأدخل الإبرة ، والجانب المائل لأسفل ، وحقنها في العين الخلفية.
    ملاحظة: تأكد من توجيه الإبرة نحو شبكية العين وأدخل الإبرة فقط 2/3 من الطريق (الشكل 1). تأكد من أن الإبرة لا تخدش العدسة ، لأن ذلك سيؤدي إلى تكوين إعتام عدسة العين.
  6. بعد حقن العلاج ، قم بإزالة الإبرة ببطء. أغلق العين واستمر في الضغط لمدة 10-15 ثانية على الأقل قبل التنظيف بالمحلول الملحي.
  7. توقف عن تناول من الأيزوفلوران وإزالته من منصة جراحة العيون. ضع قطرة من hypromellose 0.3٪ في كل عين ثم اسمح للحيوان بالتعافي على وسادة تدفئة.

2. حقن Retrobulbar (RBI)

  1. قم بتوصيل الأيزوفلوران ويؤدي النفايات إلى منافذ تثبيت SALOOT. تخدير باستخدام إجراءات الأيزوفلوران القياسية.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، إذا كان بالفعل تحت التخدير من جلسة اختبار أخرى للعيون (على سبيل المثال ، مزيج الكيتامين / الزيلازين ؛ 90 مجم / كجم من الكيتامين و 10 مجم / كجم زيلازين) ، انقل إلى منصة جراحة العيون وقم بمعايرة التخدير بالأيزوفلوران (نسبة 3 أكسجين: 3 إيزوفلوران) لضمان الحفاظ على عمق التخدير الكافي.
  2. ضع منصة جراحة العيون مع المخدر تحت مجهر التشغيل الحي. تقييم عمق التخدير عن طريق منعكس سحب الدواسة.
  3. ضع قطرة أو قطرتين من محلول العيون 0.5٪ رباعي الكلائين هيدروكلوريد في العين أو العينين اللواتي يتم إجراء عملية جراحية. ضع مرهم العين الموضعي المزلق (هيبروميلوز 0.3٪) على العين المقابلة إذا لم يتم إجراء أي تلاعب.
    1. بعد ذلك ، استخدم قطرة إلى قطرتين من 5٪ من بوفيدون اليود على سطح العين وباستخدام رمح العين ، ضع بوفيدون اليود على الجلد المحيط بالعين.
  4. احصل على حقنة أنسولين 0.5 مل بإبرة 28 جرام. ضع العلاج المطلوب للكمية المطلوبة (100 ميكرولتر).
    ملاحظة: لإثبات دراسات المفهوم ، تم استخدام حبر الوشم غير المخفف وصبغة إيفان الزرقاء في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). تم خلط مسحوق إيفان الأزرق مع PBS حتى يصبح معتما. لدراسات الإثبات العلاجي للمفهوم ، تم استخدام التركيزات التالية: ibudilast عند 10 مجم / مل ، TUDCA عند 50 مجم / مل ، حقن السيكلوسبورين 250 مجم / مل ، وأناكينرا عند 100 مجم / 0.67 مل. تم تخفيف المساحيق العلاجية في محلول ملحي مضاد للجراثيم بنسبة 0.9٪.
  5. باستخدام ملقط العين الناعم مع الأسنان ، أمسك الجفن السفلي برفق لتحقيق الاستقرار. أدخل الإبرة، بحيث يكون الجانب المائل لأسفل، بزاوية منتصف الطريق بين الساعة 6 و7 على طول الحافة المدارية السفلية حتى يتم الشعور بالجزء الخلفي من تجويف العين. اسحب الإبرة للخلف قليلا ثم حقن العلاج ببطء (الشكل 2).
  6. قم بإزالة الإبرة برفق وببطء. ثم أغلق العين واستمر في الضغط لمدة 10-15 ثانية على الأقل قبل التنظيف بالمحلول الملحي.
  7. توقف عن تناول من الأيزوفلوران وإزالته من منصة جراحة العيون. ضع قطرة من hypromellose 0.3٪ في كل عين ثم اسمح للحيوان بالتعافي على وسادة تدفئة.

3. تشريح عزل أنسجة العين

  1. بعد القتل الرحيم للحيوان عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون2 أو كما هو مذكور في بروتوكول IACUC المعتمد ، ضع في الاستلقاء القصي. استخدم شقا عرضيا في الجلد فوق الرقبة الظهرية ، ويمتد إلى مستوى صيوان الأذن.
  2. تشريح العضلات الظهرية لفضح المفصل الأطلسي القذالي. استخدم مقص المايونيز لشق المفصل القذالي الأطلسي ، وفصل الرأس عن الجسم (الشكل 3). باستخدام تشريح حاد ، قم بإزالة الجلد برفق من الجمجمة الظهرية من مستوى الأنف إلى الرقبة الظهرية ، مع ترك الجلد حول كلتا العينين سليما.
  3. أدخل زوجا من مرقئ الدم المستقيم المتوسط أو محركات الإبر في الثقبة الماغنوم عند قاعدة الجمجمة. استخدم المرقئ لاختراق الجمجمة الجانبية الممتدة برفق من الثقبة إلى المنطقة الصدغية على كلا الجانبين (الشكل 3).
    1. عند إزالة الجزء العلوي من الجمجمة ، حافظ على المرقئ موازيا للجانب الظهري من الدماغ. سيضمن ذلك بقاء الدماغ سليما وعدم تعرضه للكسر في عملية إزالة العظام.
  4. باستخدام ملعقة مسطحة ، اعكس الدماغ برفق لكشف الأعصاب البصرية. يجب توخي الحذر حتى لا يتم تطبيق التوتر الناتج عن وزن الدماغ على الأعصاب البصرية.
  5. مع تعرض الأعصاب ، خذ زوجا من المقصات الدقيقة المتوسطة وقم بعمل شق صغير عبر التصلب البصري ، مما يؤدي إلى قطع كلا العصبين عن الدماغ. في هذه المرحلة ، يمكن التخلص من الدماغ أو وضعه في بارافورمالدهيد في PBS (4٪ PFA) لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية للتقييم النسيجي.
  6. باستخدام زوج من مقص القزحية الصغير وزوج من ملقط العين الدقيق المسنن ، قم بإزالة الأنسجة الزائدة بعناية (مثل الجفون والأنسجة الضامة وما إلى ذلك) من حول العين. بمجرد الانتهاء ، يجب وضع العين في تجويف العين ولكن مع بقاء العضلات والغدد خارج العين فقط.
  7. باستخدام مرقئ الدم جنبا إلى جنب مع مقص القزحية الصغير ، قم بقطع مدار العين ، مع الحرص الشديد على عدم قطع العصب البصري أثناء مروره عبر القناة البصرية. قم بتقطيع العظم الموجود في الجزء الخلفي من تجويف العين بعناية باستخدام مرقئ الدم ، وللتحكم بشكل أكثر دقة ، استخدم مقص التشريح الصغير.
  8. بعد إزالة العظم ، قم بقص المدار العيني بدقة باستخدام مقص دقيق وملقط دقيق لإزالة الضمادات الدهنية والغدد والعضلات خارج العين. تأكد من مراقبة الأعصاب البصرية أثناء هذه العملية.
  9. يجب أن تكون العين قادرة على الانعكاس بلطف باتجاه الجزء الداخلي من الجمجمة. في هذه المرحلة ، استخدم مقصا صغيرا وملقطا دقيقا لإزالة النسيج الضام المحيط بالعصب الموجود في حافة الجمجمة السفلية.
  10. بمجرد إزالة هذا النسيج ، يجب أن تكون العين والعصب البصري الكامل قابلين للرفع من الجمجمة في كتلة. كرر هذه الخطوات للعين والعصب المقابل.
  11. علاوة على ذلك ، قم بتنظيف العصب البصري والعين من الأنسجة الزائدة مثل غمد الجافية. إذا لم تكن الأنسجة بحاجة إلى الحفاظ عليها للتحليل النسيجي ، فقم بالتجميد السريع باستخدام الثلج الجاف أو النيتروجين السائل قبل تخزينها عند -80 درجة مئوية.
  12. بالنسبة لقياس الطيف الكتلي ، يجب عزل شبكية العين عن المنطقة الداخلية من الكرة الأرضية ، ويجب عزل العصب البصري. افصل العصب البصري عن الكرة الأرضية عند أقرب نقطة خارجية. ضع العصب في أنبوب التبريد على الجليد قبل نقله إلى -80 درجة مئوية.
    1. ضع كرة العين على طبق بتري تحت مجهر التشغيل. استخدم زوجا من الملقط المنحني لتثبيت العين قبل إجراء شق في الأطراف باستخدام مقص صغير.
    2. قم بتمديد القطع ليشمل محيط الكرة الأرضية بالكامل. يجب تقسيم الكرة الأرضية إلى قسمين ، ويمكن التخلص من الجزء الأمامي.
    3. ضع الجانب الداخلي للجزء الخلفي لأعلى ، وباستخدام زوج من ملاقط العين الدقيقة ، قم بإزالة الأنسجة الرقيقة ذات اللون الكريمي. قد يبدو أنه يلتصق بالقرص البصري. إذا حدث هذا ، استخدم المقص الدقيق لقطع شبكية العين بعيدا عن القرص.
      ملاحظة: يمكن بعد ذلك وضع أنسجة الشبكية في أنبوب تبريد على الجليد قبل نقله إلى -80 درجة مئوية. يمكن بعد ذلك نقل الأنسجة إلى منشأة قياس الطيف الكتلي للتقييم.
  13. لتلوين الأنسجة المناعية باستخدام التروية الجزئية ، ضع العين السليمة على طبق بتري. استخدم زوجا من الملقط المنحني لتثبيت العين قبل أخذ حقنة الأنسولين بإبرة 28 جم وإدخالها في الليمفا، مع وضع الإبرة بزاوية نحو شبكية العين. كرر هذه الخطوة عند نقطتين أخريين على طول الطرف. يساعد ثقب الكرة الأرضية على ضمان التروية الكافية ويساعد في التثبيت المناسب.
    ملاحظة: يجب تثبيت الكرة الأرضية بنسبة 4٪ PFA لمدة 40 دقيقة على الأقل قبل الانتقال إلى شاكر والتقليب بسرعة منخفضة لمدة 20 دقيقة إضافية لتسهيل حركة السوائل.
  14. بمجرد اكتمال خطوة التثبيت ، قم بإزالة PFA واستبدله ب PBS. ضع القوارير على رج لطيف لمدة 15 دقيقة ، ثم كرر هذه الخطوة لمدة 15 دقيقة من شطف PBS.
  15. بعد دورة شطف PBS النهائية ، قم بشفط PBS واستبدله بمحلول سكروز بنسبة 30٪ في PBS ، ثم ضعه في الثلاجة لمدة 24 ساعة. بعد خطوة حضانة السكروز ، قم بتضمين الأنسجة في OCT للتقييم النسيجي26.

النتائج

تم إجراء تجارب تجريبية أولية على الجثث باستخدام صبغة الحقن (صبغة إيفانز الزرقاء) وحبر الوشم (الشكل 2 ب) لتحسين وضع وحجم الإبرة لكل من RBI و IVI. كان حبر الوشم غير مخفف ، ثم تم خلط مسحوق إيفانز الأزرق في PBS حتى أصبح السائل معتما. خلصنا إلى أن RBI المثالي يتميز بإبرة...

Discussion

تؤكد التحديات المعقدة المرتبطة بتوصيل العلاجات إلى شبكية العين والعصب البصري ، ويرجع ذلك أساسا إلى الحاجز غير المنفذ الذي يفرضه BRB ، على أهمية هذه الدراسة3،4. لا يسلط استكشاف تقنيات IVI و RBI الضوء على الأساليب المبتكرة للتغلب على هذه العقبات...

Disclosures

ويعلن المؤلفون أن البحث أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل جوائز برنامج أبحاث الرؤية التابع لوزارة الدفاع الأمريكية W81XWH-15-1-0074 و W81XWH-22-1-0989. الآراء أو التأكيدات الواردة هنا هي آراء خاصة لأصحاب البلاغ ولا ينبغي تفسيرها على أنها رسمية أو تعكس وجهات نظر وزارة الجيش أو وزارة الدفاع. تم دعم هذه المنحة البحثية جزئيا من قبل شركة أوهايو التابعة لجائزة زمالة الطالب الباحث الشاب لمنع العمى للباحثات الإناث في أبحاث الرؤية. نحن ممتنون للدعم المقدم من مؤسسة روس. تم تقديم الخدمات في البرنامج الأساسي لأبحاث علوم الرؤية في جامعة ولاية أوهايو تحت P30EY032857. نود أن نشكر مختبر جامعة ولاية أوهايو والموارد الحيوانية (ULAR). بالإضافة إلى ذلك ، نود أن نشكر أعضاء مختبر رايلي الجامعيين ميشيل موسكو وإيما لالي وسام داكوورث وإيف هوارد. نود أيضا أن نشكر Bongsu Kim على مساهمته في تصميم SALOOT ، وكذلك إليزابيث أوربانسكي وريان ويب. تم إنشاء الشكل 1 والشكل 2 أ والشكل 3 باستخدام BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anakinra 100 mg/0.67 mL SobiNDC: 66658-0234-07
Antipamezole hydrochloride (Antisedan) 5.0 mg/mLZoetisNADA #141-033 | 107204-8
Bacteriostatic sodium chloride (0.9%)Hospira Inc.NDC: 0409-1966-02
CryotubeVWR76417-258 https://us.vwr.com/store/product?keyword=76417-258
Curved forceps Fischer Scientific 08-953F
cyclosporine injection 250 mg/mL PerrigoNDC: 00574-0866-10
cyclosporine topical, 0.05% (Restasis) AbbVie (Vizient)NDC: 00023-9163-30
Cyotube CapThermo Scientific3471BLKhttps://www.fishersci.com/shop/products/screw-cap-microcentrifuge-tube-caps/14755237?searchHijack=true&searchTerm=
screw-cap-microcentrifuge-tube-caps&searchType=Rapid&
matchedCatNo=14755237
Evans Blue Sigma-AldrichE2129-10G
Eye SpearsFischer Scientific NC0972725https://www.fishersci.com/shop/products/ultracell-pva-eye-spears-100-p/NC0972725
Fine forceps Fischer Scientific 08-953Ehttps://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-dissecting-jewelers-microforceps-2/08953E?gclid=Cj0KCQiAkJO8BhCGARIsAM
kswyiER9Kanmi3ZMgoXTr82Zg3
g44m1Q6WLftkYfb36hC7pbkwR
hVAy3MaAqkLEALw_wcB&ef_id
=Cj0KCQiAkJO8BhCGARIsAMks
wyiER9Kanmi3ZMgoXTr82Zg3g4
4m1Q6WLftkYfb36hC7pbkwRhV
Ay3MaAqkLEALw_wcB:G:s&ppc
_id=PLA_goog_2086145680_81
843405274_08953E__38624700
1354_6556597232892883360&
ev_chn=shop&s_kwcid=AL!4428
!3!386247001354!!!g!827721591
040!&gad_source=1
Fine ophthalmic forceps with teeth Fisher Scientific50-253-8287https://www.fishersci.com/shop/products/bonn-suturing-forceps-7-5-cm/502538287
Flat spatula Fischer Scientific 14-375-100https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-spoonula-lab-spoon/1437510#?keyword=
Hot bead Sterilizer Fine Science Tools18000-45https://www.finescience.com/en-US/Products/Instrument-Care-Accessories/Sterilization/Hot-Bead-Sterilizers
Hypromellose 0.3% (GenTeal Tears Severe Dry Eye Gel) Alcon Laboratories Inc.https://www.amazon.com/GenTeal-Tears-Lubricant-Ointment-Night-Time/dp/B01IN5G1L0/ref=sr_1_4?dib=eyJ2IjoiMSJ9.DxYpqjIIBNO
TVuPo7jln5xeGazA_YFg0cbt3
kCyC-0ouZARw5qIHYvCM7vB
R_vO30OWUEXDZhQmQfLQ9
ySld4mujpzrWjxbsEXLBs5JPhjZ
eUPgPY0sHoJA46f9EYULdxiTu
BQy5fVA2OB20RV09mbdW8hX
6j8-bXIYTZljPGMo5_GMq9jnJo8
3iR35c1THxEiEH2FsvSx7VXup-
QK9uCkWwAYrw2v3tyLUCq2JT
APPF34nsYqGnSASMgOARU_
2lVz-kIy-QUEYHGOoIimIWwBY
htz33RkFrq7YjtnC2uDbImNiudG
zWJv-uUhmJngYjbBGbeWE0VX
7CGPkEokUZrCQ8AI2HeXjSMph
gPhMbK88RcHJ63AyH0TiBtS2k1
Xceh-CD26_prJSNxF6Mv5-jgGf9
iLmXvVtKkkSwc-5uYLk7gZHaFC
Yj73F_imbmeHYr.4vfu7h4m4Jlfy-
qiqmgeAnDHlJTGYV22HJ2w_xD
ir0k&dib_tag=se&keywords=Gent
eal+gel&qid=1736793609&sr=8-4
ibudilast Millipore SigmaI0157-10MG
insulin syringe 0.5 mL with a 28 gauge Micro-Fine IV NeedleBecton, Dickinson and Company (BD)14-826-79
Isoflurane CovetrusNDC: 11695-6777-2
Ketamine CovetrusNDC: 11695-0703-1
Long Evans RatCharles River Laboratories International, Inc.https://www.criver.com/products-services/find-model/long-evans-rat?region=3611
Mayo Scissors Electron Microscopy Sciences72968-03
Medium microscissors Amazonhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z168866#product-documentation
Medium straight hemostats or needle drivers Sigma-AldrichZ168866-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z168866#product-documentation
Needle 33 G with a style 4 tip at a length of 10 mm and angle of 15 degrees Hamilton7803-05
paraformaldehyde 4 in phosphate-buffered saline (PBS) (4% PFA) Thermo Fischer J61899.AK
Petri dish Millipore SigmaP5606-400EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5606?utm_source=google&utm_medium=
cpc&utm_campaign=8674694095
&utm_content=105162454052&
gad_source=1&gclid=Cj0KCQiA
kJO8BhCGARIsAMkswygXXfgY
ABr7EfLtf4tvuLS0E8A4SxX4XM
NJQDaI80Yi4FO-iahCsPcaAp9E
EALw_wcB
phosphate-buffered saline (PBS)Sigma-AldrichP3813-10PAKhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p3813
Povidone-Iodine (Betadine) 5% Alcon Laboratories Inc.NDC: 0065-0411-30
Shaker Model 3500 VWR89032-092
Small iris scissors Sigma-AldrichZ265977-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z265977&
small microscissors Fisher Scientific17-456-004https://www.fishersci.com/shop/products/self-opening-scissors-2/17456004?keyword=true
Sprague Dawley RatCharles River Laboratories International, Inc.SAS 400https://emodels.criver.com/product/400
Sucrose Millipore Sigma57-50-1https://www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/sucrose3423057501
syringe 10 µL (Model 701 RN)Hamilton80330
Tattoo Ink (Intenze Tattoo Ink True Black 1 oz)Amazonhttps://www.amazon.com/Intenze-Tattoo-Ink-True-Black/dp/B01GW747L2
tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) Milipore Sigma580549-1GM
Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%Bausch & Lomb Inc.NDC: 68682-920-64
Xylazine (Rompun) 100 mg/mLDechraNADA #047-956 |

References

  1. Nguyen, D. D., Lai, J. -. Y. Advancing the stimuli response of polymer-based drug delivery systems for ocular disease treatment. Polym Chem. 11 (44), 6988-7008 (2020).
  2. Tsai, C. -. H., et al. Ocular drug delivery: Role of degradable polymeric nanocarriers for ophthalmic application. Int J Mol Sci. 19 (9), ijms19092830 (2018).
  3. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules (Basel, Switzerland). 24 (8), 24081583 (2019).
  4. Ryan, A. K., Rich, W., Reilly, M. A. Oxidative stress in the brain and retina after traumatic injury. Front Neurosci. 17, 1021152 (2023).
  5. De Matteis, V., Rizzello, L. Noble metals and soft bio-inspired nanoparticles in retinal diseases treatment: A perspective. Cells. 9 (3), 679 (2020).
  6. O'Leary, F., Campbell, M. The blood-retina barrier in health and disease. FEBS J. 290 (4), 878-891 (2023).
  7. del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Prog Retin Eye Res. 57, 134-185 (2017).
  8. Nguyen, D. D., Luo, L. -. J., Yang, C. -. J., Lai, J. -. Y. Highly retina-permeating and long-acting resveratrol/metformin nanotherapeutics for enhanced treatment of macular degeneration. ACS Nano. 17 (1), 168-183 (2023).
  9. Luo, L. -. J., et al. Targeting nanocomposites with anti-oxidative/inflammatory/angiogenic activities for synergistically alleviating macular degeneration. App Mat Today. 24, 101156 (2021).
  10. Naik, S., et al. Small interfering RNAs (siRNAs) based gene silencing strategies for the treatment of glaucoma: Recent advancements and future perspectives. Life Sci. 264, 118712 (2021).
  11. Luo, L. -. J., Nguyen, D. D., Lai, J. -. Y. Dually functional hollow ceria nanoparticle platform for intraocular drug delivery: A push beyond the limits of static and dynamic ocular barriers toward glaucoma therapy. Biomat. 243, 119961 (2020).
  12. Ghate, D., Brooks, W., McCarey, B. E., Edelhauser, H. F. Pharmacokinetics of intraocular drug delivery by periocular injections using ocular fluorophotometry. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (5), 2230-2237 (2007).
  13. Soni, V., Pandey, V., Tiwari, R., Asati, S., Tekade, R. K. Chapter 13 - Design and evaluation of ophthalmic delivery formulations. Basic Fund Drug Deliv. , 473-538 (2019).
  14. Varela-Fernández, R., et al. Drug delivery to the posterior segment of the eye: Biopharmaceutic and pharmacokinetic considerations. Pharmaceutics. 12 (3), 313 (2020).
  15. Chiu, K., Chang, R. C. -. C., So, K. -. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), e313 (2007).
  16. Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes. PLOS One. 16 (8), e0256344 (2021).
  17. Cosan, S., et al. Effect of retrobulbar prostaglandin analog injection on orbital fat in rats. Int Ophthal. 43 (12), 4985-4990 (2023).
  18. Levy, Y., Kremer, I., Shavit, S., Korczyn, A. D. The pupillary effects of retrobulbar injection of botulinum toxin A (oculinum) in albino rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (1), 122-125 (1991).
  19. Jbara, D., Eiger-Moscovich, M., Didkovsky, E., Keshet, Y., Avisar, I. In vivo effects of prostaglandin analogs application by topical drops or retrobulbar injections on the orbital fat of a rat model. Ocular Imm Inflamm. 31, 1-6 (2022).
  20. Eftekhari, K., et al. Histologic evidence of orbital inflammation from retrobulbar alcohol and chlorpromazine injection: A clinicopathologic study in human and rat orbits. Ophthal Plastic and Reconstr Surg. 32 (4), 302-304 (2016).
  21. Bohnert, B. N., et al. Retrobulbar sinus injection of doxorubicin is more efficient than lateral tail vein injection at inducing experimental nephrotic syndrome in mice: A pilot study. Lab Animals. 53 (6), 564-576 (2019).
  22. Socher, M., Kuntz, J., Sawall, S., Bartling, S., Kachelrieß, M. The retrobulbar sinus is superior to the lateral tail vein for the injection of contrast media in small animal cardiac imaging. Lab Animals. 48 (2), 105-113 (2014).
  23. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals. 40 (5), 155-160 (2011).
  24. Pozyuchenko, K., et al. Investigating animal models of optic neuropathy: An accurate method for optic nerve and chiasm dissection in mice. J Neurosci Methods. 331, 108527 (2020).
  25. Sengupta, P. The laboratory rat: Relating its age with human's. Int J Prevent Med. 4 (6), 624-630 (2013).
  26. Ryan, A. K., et al. Torsion-Induced Traumatic Optic Neuropathy (TITON): A physiologically relevant animal model of traumatic optic neuropathy. PLOS One. 20 (1), e0312220 (2025).
  27. Bora, K., et al. Assessment of Inner blood-retinal barrier: Animal models and methods. Cells. 12 (20), 2443 (2023).
  28. Vinores, S. A. Breakdown of the blood-retinal barrier. Encyc Eye. , 216-222 (2010).
  29. Heisler-Taylor, T., et al. Multimodal imaging and functional analysis of the chick NMDA retinal damage model. PLOS One. 16 (9), e0257148 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved