Okuläre therapeutische Verabreichung und fortgeschrittene Gewebeentnahme bei erwachsenen Ratten

Zusammenfassung

Diese Studie stellt eine Methodik für die Verabreichung von Therapeutika in die Netzhaut und die Sehnerven der erwachsenen Ratte vor. Darüber hinaus wird eine einzigartige Gewebeentnahmemethode für eine Top-Down-Entnahme des Sehnervs und der Netzhaut bei einer erwachsenen Ratte eingeführt.

Zusammenfassung

Die therapeutische Verabreichung an den hinteren Augenabschnitt, einschließlich der Netzhaut und des Sehnervs, wird durch das Vorhandensein von Blut-Hirn- und Blut-Netzhaut-Schranken erschwert. Kleintiermodelle, wie z. B. Ratten, werden zur Untersuchung verschiedener Augenerkrankungen verwendet. Während die therapeutische Verabreichung an das hintere Auge eine Herausforderung darstellt, ist dies für die Behandlung von Augenerkrankungen unerlässlich, von denen viele eine Validierung in Kleintiermodellen erfordern, um ihre translationale Relevanz zu gewährleisten. Daher werden zwei posteriore therapeutische Verabreichungstechniken vorgestellt: die intravitreale Injektion (IVI) und die retrobulbäre Injektion (RBI) zur Anwendung bei erwachsenen Ratten. Zusätzlich wird ein Verfahren zur en bloc Entfernung der Augen und Sehnerven für verschiedene histologische und molekulare Analysetechniken vorgestellt. Das Dissektionsprotokoll ermöglicht eine vollständige Beobachtung des neurovisuellen Systems bei gleichzeitiger Minimierung der postmortalen Verletzungen des Netzhaut- und Sehnervengewebes. Die erfolgreiche Verabreichung des therapeutischen Cyclosporins an die Netzhaut und den Sehnerv wurde erreicht, wobei vierundzwanzig Stunden nach der Injektion sowohl mit IVI als auch mit RBI nachweisbare Konzentrationen beobachtet wurden. Darüber hinaus wurden erfolgreich En-bloc-Netzhaut- und Nervenproben für die vollständige histologische Gewebeanalyse des Auges extrahiert, was eine umfassende Beobachtung der Netzhaut und des weiteren neurovisuellen Systems ermöglicht.

Einleitung

Die Verabreichung von Therapeutika an die Netzhaut und den Sehnerv ist aufgrund der komplexen Anatomie des Auges ^1,2, insbesondere des Vorhandenseins der Blut-Netzhaut-Schranke (BRB)^3,4,5, unglaublich schwierig. Der BRB dient dem Schutz der Netzhaut vor einer systemischen Durchblutungsinvasion, ist aber ein schwieriger Gegner der therapeutischen Verabreichung, da der systemische therapeutische Kreislauf häufig durch den BRB blockiert wird ^6,7. Kleine lipophile Moleküle können leicht durch das BRB diffundieren, aber größere und hydrophile Moleküle haben es schwerer, Zugang zur Netzhaut zu erhalten⁶. Intravitreale (IVI) und retrobulbäre (RBI) Injektionen ermöglichen die Verabreichung von Arzneimitteln an das Augengewebe und überwinden die durch die BRB auferlegten Einschränkungen. Die IVI stellt einen vielversprechenden Kompromiss dar, indem sie Therapeutika in die innere Umgebung des Auges verabreicht ^8,9. Bei dieser Methode muss das Medikament den Glaskörper passieren, wodurch das BRB umgangen wird, und durch die Netzhaut und die Aderhaut diffundieren, um den Sehnerv zu erreichen⁷. Die RBI wird hinter dem Auge in den retrobulbären Raum¹⁰ abgegeben. Therapeutika können durch Diffusion durch die Gewebe und Drüsen im retrobulbären Raum verabreicht werden, wobei der Sehnerv und die umgebenden Strukturen beeinflusst werden, ohne direkt in die Netzhaut einzudringen, wodurch die Integrität des BRB erhalten bleibt. Durch die direkte oder indirekte Verabreichung von Arzneimitteln in das Auge können sowohl intravitreale als auch retrobulbäre Injektionen höhere lokale Konzentrationen des Therapeutikums erreichen, was seine Wirksamkeit im Vergleich zur topischen oder systemischen Verabreichung (oral oder intravenös) ^erhöht2. Dies ist besonders wichtig für Behandlungen, die eine schnelle Wirkung oder eine hohe Wirksamkeit erfordern, wie sie bei vielen Augenerkrankungen zu beobachten ist. Die gezielte Verabreichung begrenzt auch die Exposition des restlichen Körpers gegenüber dem Medikament, was das Risiko von Off-Target-Effekten verringert und dazu beiträgt, potenzielle Nebenwirkungen zu minimieren, die auftreten können, wenn Medikamente topisch, oral oder intravenös verabreicht werden¹¹.

Andere periokulare Injektionen, wie z. B. subkonjunktivale, posteriore subtenon und subretinale Injektionen, haben ihre eigenen Vorteile und Einschränkungen ^2,5. Es wurde beobachtet, dass posteriore Subtenon-Injektionen hohe Wirkstoffkonzentrationen an das Augengewebe abgeben; Die Subtenoninjektion liegt jedoch näher an der Sklera als an der orbitalen Gefäßstruktur ^5,12. Im Gegensatz dazu platziert die RBI das Therapeutikum näher am Sehnerv als am hinteren Subtenon oder Subkonjunktival¹³. Dies kann bedeuten, dass Erkrankungen des Sehnervs von der RBI verabreichte Therapeutika gegenüber anderen periokularen Injektionsarten bevorzugen. Posteriore Subtenon-Injektionen sind mit Risiken verbunden, einschließlich Schielen, Hyphäma und erhöhtem Augeninnendruck⁵. Erhöhter Augeninnendruck ist auch ein berichteter Risikofaktor bei IVI-, subkonjunktivalen und subretinalen Injektionen². Diese Injektionsarten erfordern oft eine wiederholte Dosierung, um die gewünschte therapeutische Wirkung zu erzielen². Weitere Risikofaktoren im Zusammenhang mit subretinalen Injektionen, subkonjunktivalen Injektionen und IVI sind Kataraktbildung, Netzhautblutung, Netzhautablösung und Entzündungen². Diese IVI, subretinalen Injektionen und subkonjunktivalen Injektionen sind invasiver als die RBI-Injektionen, da diese Injektionen intraokular^{sind 2}. Die RBI kann als weniger invasiv angesehen werden, da sie das Therapeutikum in den retrobulbären Raum platziert, ohne die Nadel direkt in den Augenball einzuführen. Andere weniger invasive therapeutische Verabreichungsstrategien, wie z. B. die topische Verabreichung, reichen nicht aus, da weniger als 5 % des Arzneimittels auf der Augenoberfläche verbleiben ^2,5.

IVI ist eine prominente Technik in präklinischen Modellen, die wegen ihrer Fähigkeit verwendet wird, Therapeutika direkt in den hinteren Augenabschnitt zu verabreichen. IVI gibt das Medikament direkt an den Glaskörper ab, was es zu einer bevorzugten Verabreichungstechnik für die lokalisierte Behandlung^{macht 14}. Die IVI-Technik ermöglicht es dem Therapeutikum, die Blut-Netzhaut-Schranke zu umgehen, die ein häufiges Hindernis für das Eindringen von Arzneimitteln in die Netzhaut darstellt¹⁴. IVI birgt die Möglichkeit von Entzündungen und Schädigungen der Augenstrukturen, so dass eine sorgfältige Einhaltung des Verfahrens erforderlich ist¹⁴. Um die Netzhautablösung und Kataraktbildung zu minimieren, beschreiben Chiu et al. einen IVI-Ansatz, der eine 45-Grad-Abschrägung und -injektion auf Höhe der Par plana betont, wobei die Linse, die Netzhaut, der Augenmuskel und die Gefäße vermieden^{werden 15}. Bei dieser Technik wird eine 30-G-Nadel zur therapeutischen Verabreichung in die Nasensklera eingeführt¹⁵. IVI ist aufgrund seines invasiven Charakters nach wie vor mit Risiken verbunden. Zu den möglichen Risiken gehören Netzhautablösung, Kataraktbildung, Endophthalmitis oder Blutungen¹⁶. Der invasive Charakter von IVI-Techniken erhöht auch den Augeninnendruck, wie ein Experiment an Schweineaugen zeigte, das von Ikjong Park et al. durchgeführt ^wurde16. Die Studie zeigt Veränderungen des Augeninnendrucks in verschiedenen Stadien des Einführens der Nadel und der Flüssigkeitsinjektion. Sie berichten von erheblichen Schwankungen des Augeninnendrucks während des Eingriffs¹⁶.

RBIs wurden in früheren Studien erfolgreich als Mittel zur therapeutischen Verabreichung an Nagetiere eingesetzt. Eine dieser Studien verglich die Wirkungen verschiedener Prostaglandin-Analoga, die über RBI^{verabreicht wurden 17}. Albino-Ratten erhielten eine RBI mit einer 26-G-Nadel mit 0,1 ml Injektion, die in einem 45-Grad-Winkel durch den lateralen Bereich des Fornix inferior eingeführt wurde¹⁷. Das in dieser Studie verwendete Protokoll wurde von einer zuvor beschriebenen Methode angepasst, bei der die Ratten durch intraperitoneale (IP) Injektion von Chloralhydrat¹⁸ anästhesiert wurden. Eine andere Studie, die an Ratten durchgeführt wurde, verglich topische Tropfen mit retrobulbären Injektionen¹⁹. Die Ratten wurden über eine IP-Injektion von Ketamin/Xylazin anästhesiert, und die RBI wurde über eine 30-G-Nadel verabreicht¹⁹. Im Gegensatz zu den zuvor diskutierten Sedierungsmethoden wurde in einer Studie, die die Auswirkungen von RBI auf das Orbitalfett beobachtete, inhalatives Isofluran verwendet, um die Ratten vor RBI zu sedieren²⁰. Während diese Studien Aufschluss darüber geben, welche Anästhetika und Nadelspezifikationen erfolgreich sein könnten, werden die Positionierung und Handhabung der Tiere während des Eingriffs nicht diskutiert.

Verschiedene Studien an Mäusen führen auch RBIs für therapeutische Verabreichungsmethoden durch. Eine Studie verglich RBI mit der lateralen Schwanzveneninjektion zur erfolgreichen Induktion des nephrotischen Syndroms²¹. In einer zweiten Studie wurden die gleichen beiden Injektionstechniken bei der Verabreichung von Kontrastmitteln für die kardiale Bildgebung ebenfalls verglichen²². Die Mäuse wurden mit inhalativem Isofluran betäubt und in die mediale Seite des Auges injiziert²². Beide Studien adaptierten ihre RBI-Methode von einem zuvor geschriebenen Protokoll. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll die Injektion als retroorbital bezeichnete, die Injektionsstelle jedoch als retrobulbären Raum hinter dem Auge beschrieb. Die Autoren dieses Protokolls verwendeten inhalatives Isofluran als bevorzugte Sedierungsmethode und stellten die schnelle Aktivierungs- und Erholungszeit der Mäuse fest²³. Bei einer RBI wurde das Auge teilweise aus der Augenhöhle herausragend gemacht, indem Druck auf die Haut um das Auge ausgeübt wurde²³. Dann wurde die Nadel an der medialen Canthus-Abschrägungsseite in einem Winkel von 30 Grad eingeführt und bis zur Basis des Auges²³ eingeführt. Bei der Ausübung von Druck auf das Tier ist Vorsicht geboten, da es zu einer versehentlichen Verstopfung des Blutflusses oder einem Trachealkollaps kommen kann²³. Der Injektor ist auch beim Einführen blind für die Nadelspitze, so dass eine Beschädigung des Auges ein damit verbundenes Risiko darstellt. ²³ Die Schädigung des Auges bei der Verabreichung eines Therapeutikums ist ein kritisches Risiko in diesem Experiment, da das Verursachen zusätzlicher Verletzungen die Ergebnisse der Studie direkt untergräbt. Es muss auch beachtet werden, dass die zuvor beschriebene Positionierungs- und Handhabungstechnik an Mäusen durchgeführt wurde und keine Kommentare zur Anwendbarkeit auf Ratten enthielt.

Es gibt viele Arten, auf welche Weise die Entfernung des Sehnervs und der Netzhaut versucht wurde. Eine dieser Methoden untersuchte die Entfernung von Sehnerven und Augen en bloc, wobei ein intaktes Chiasma opticus erhalten blieb²⁴. Diese Methode ist am ehesten mit der aktuellen Studie vergleichbar, da die einzelnen Augen und Sehnerven auch für die Entnahme en bloc erhalten bleiben; Das Chiasma opticum ist jedoch getrennt. Aufgrund der Komplexität des Verfahrens wäre es äußerst wichtig, bei diesem Verfahren Vorsicht walten zu lassen. Bei der aktuellen Methode beginnen wir die Dissektion über den Schwanzschädel und arbeiten rostral, um den Zugang so zu ermöglichen, dass die Schädigung der Sehnerven begrenzt wird und der gesamte Nerv intakt bleibt. Darüber hinaus ist es für den Einbettungsprozess von entscheidender Bedeutung, den Nerv intakt und mit dem Auge verbunden zu halten, da eine Schädigung jedes Teils des Nervs einer anderen pathologischen Beobachtung entsprechen kann²⁴. Die Ausrichtung des Sehnervs ist wichtig zu berücksichtigen, da die Art und Weise, wie er eingebettet ist, unterschiedliche Querschnitte ermöglicht, was für die histologische Analyse wichtig sein kann.

Ein speziell angefertigtes Gerät, das als ophthalmologischer Operationstisch für Kleintierlabore (SALOOT, eine Plattform für Augenchirurgie) bekannt ist, besteht aus einer Reihe von 3D-gedruckten Materialien, um eine Anästhesie zu ermöglichen und das Tier in einer stabilen Position für okuläre therapeutische Injektionen zu halten. Das SALOOT-Design ermöglicht die Stabilität der Kopf- und Augenstrukturen bei ophthalmologischen Eingriffen, was die Geschwindigkeit und Reproduzierbarkeit von Operationen verbessert und gleichzeitig die Gasanästhesieabgabe und das Abfangen von Ausatempartikeln ermöglicht. Der SALOOT ist ein dreidimensional bedruckter Block mit einer konkaven Reduktion, um den Rattenkörper zu halten, mit einer schmaleren Region an der Vorderseite, um den Kopf des Tieres in einem Nasenkegel mit einem Isofluran-Einlass zu halten. Unter dem Nasenkonus befindet sich ein kleiner Ausgleichsbehälter und ein Auslass. Die folgenden Methoden wurden für die therapeutische Augenentnahme und die präzise Entnahme von Augengewebe entwickelt: Sie wurden für die Untersuchung von Geweben nach einem Augentrauma entwickelt, daher ist es wichtig, die Auswirkungen des Traumas, der Injektion, der Behandlung und der Dissektion abzugrenzen, um eine verwirrende Interpretation der Befunde zu vermeiden.

In diesem Artikel werden zwei okuläre therapeutische Injektionsmethoden, die intravitreale und retrobulbäre Injektion, zur Anwendung bei erwachsenen Ratten vorgestellt. Darüber hinaus wird ein Gewebeentnahmeverfahren für die en bloc Entfernung des intakten Sehnervs und der Netzhaut bei einer erwachsenen Ratte vorgestellt. Diese Techniken ermöglichen die Untersuchung der okulären und periokularen Auswirkungen der induzierten Pathologie und Behandlung.

Protokoll

Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der ophthalmischen und visuellen Forschung durchgeführt und vom institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -verwendung an der Ohio State University genehmigt. Für diese Studie wurden männliche Sprague Dawley-Ratten mit einem Gewicht von ~200 g und einem Alter von etwa 2 Monaten verwendet²⁵. Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Intravitreale Injektion (IVI)

1. Befestigen Sie das Isofluran und die Abfallleitungen an den SALOOT-Befestigungsanschlüssen. Betäuben Sie das Tier mit Standard-Isofluran-Verfahren gemäß der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der ophthalmologischen und visuellen Forschung und dem genehmigten IACUC-Protokoll.
   HINWEIS: Wenn das Tier bereits aus einer anderen ophthalmologischen Testsitzung unter Narkose stand (d. h. Ketamin/Xylazin-Mischung; 90 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin), übertragen Sie das Tier auf die Plattform für ophthalmologische Chirurgie und titrieren Sie die Anästhesie mit Isofluran (3 Sauerstoff: 3 Isofluran-Verhältnis), um sicherzustellen, dass eine ausreichende Anästhesietiefe aufrechterhalten wird.
2. Platzieren Sie die ophthalmochirurgische Plattform mit dem anästhesierten Tier unter einem lebenden Operationsmikroskop. Beurteilen Sie die Narkosetiefe über den Pedalentzugsreflex.
3. Geben Sie ein bis zwei Tropfen 0,5%ige Tetracainhydrochlorid-Augenlösung in das Auge oder die Augen, die operiert werden. Tragen Sie eine befeuchtende topische Augensalbe wie Hypromellose 0,3% auf das kontralaterale Auge auf, wenn keine Manipulation durchgeführt werden soll.
   1. Verwenden Sie dann ein bis zwei Tropfen 5% Povidon-Jod auf die Augenoberfläche und tragen Sie mit einem Wattestäbchen Povidon-Jod auf die Haut um das Auge herum auf.
4. Verwenden Sie eine 10-μl-Spritze mit einer 33-g-Nadel mit einer Spitze der Ausführung 4 bei einer Länge von 10 mm und einem Winkel von 15 Grad und ziehen Sie 0,9 % bakteriostatisches Natriumchlorid auf. Spülen Sie die Spritze und die Nadel mit der Kochsalzlösung, bevor Sie die Nadel in einen Heißperlensterilisator tauchen.
   1. Lassen Sie es abkühlen, bevor Sie fortfahren. Nachdem die Nadel abgekühlt ist, ziehen Sie das gewünschte Therapeutikum auf die gewünschte Menge (4 μl) auf.
      HINWEIS: Für Proof-of-Concept-Studien wurden unverdünnte Tätowierfarbe und Evan's Blue Farbstoff in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verwendet. Evan's Blue Pulver wurde mit PBS gemischt, bis es undurchsichtig war. Für therapeutische Proof-of-Concept-Studien wurden die folgenden Konzentrationen verwendet: Ibudilast mit 1 mg/ml, Tauroursodeoxycholsäure (TUDCA) 5 mg/ml, Cyclosporin-Injektion mit 250 mg/ml und Anakinra mit 100 mg/0,67 ml. Therapeutische Pulver wurden in 0,9 % bakteriostatischer Kochsalzlösung verdünnt.
5. Fassen Sie mit einer feinen Augenzange mit den Zähnen vorsichtig das Skleragewebe am Limbus, um es zu stabilisieren. Um die Iris herum befindet sich ein schwacher roter Ring. Verwenden Sie diesen Ring als Orientierungspunkt, führen Sie die Nadel mit der abgeschrägten Seite nach unten ein und injizieren Sie sie in das hintere Auge.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, die Nadel in Richtung Netzhaut zu winkeln und die Nadel nur zu 2/3 einzuführen (Abbildung 1). Achten Sie darauf, dass die Nadel die Linse nicht zerkratzt, da dies zur Bildung des Grauen Stars führt.
6. Nachdem das Therapeutikum injiziert wurde, entfernen Sie langsam die Nadel. Schließen Sie das Auge und halten Sie den Druck mindestens 10-15 s lang, bevor Sie mit Kochsalzlösung spülen.
7. Setzen Sie das Tier von Isofluran ab und entfernen Sie es von der Plattform für die Augenchirurgie. Geben Sie einen Tropfen Hypromellose 0,3 % in jedes Auge und lassen Sie das Tier dann auf einem Heizkissen erholen.

2. Retrobulbäre Injektion (RBI)

1. Befestigen Sie das Isofluran und die Abfallleitungen an den SALOOT-Befestigungsanschlüssen. Betäuben Sie das Tier mit Standard-Isofluran-Verfahren.
   HINWEIS: Wenn das Tier bereits aus einer anderen ophthalmologischen Testsitzung unter Narkose stand (d. h. Ketamin/Xylazin-Mischung; 90 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin), übertragen Sie das Tier auf die Plattform für ophthalmologische Chirurgie und titrieren Sie die Anästhesie mit Isofluran (3 Sauerstoff: 3 Isofluran-Verhältnis), um sicherzustellen, dass eine ausreichende Anästhesietiefe aufrechterhalten wird.
2. Platzieren Sie die ophthalmochirurgische Plattform mit dem anästhesierten Tier unter einem lebenden Operationsmikroskop. Beurteilen Sie die Narkosetiefe über den Pedalentzugsreflex.
3. Geben Sie ein bis zwei Tropfen 0,5%ige Tetracainhydrochlorid-Augenlösung in das Auge oder die Augen, die operiert werden. Tragen Sie eine befeuchtende topische Augensalbe (Hypromellose 0,3%) auf das kontralaterale Auge auf, wenn keine Manipulation durchgeführt werden soll.
   1. Verwenden Sie dann ein bis zwei Tropfen 5% Povidon-Jod auf die Augenoberfläche und tragen Sie mit einem Augenspeer Povidon-Jod auf die Haut um das Auge herum auf.
4. Besorgen Sie sich eine 0,5-ml-Insulinspritze mit einer 28-g-Nadel. Erstellen Sie das gewünschte Therapeutikum in der gewünschten Menge (100 μL).
   HINWEIS: Für Proof-of-Concept-Studien wurden unverdünnte Tätowierfarbe und Evan's Blue Farbstoff in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verwendet. Evan's Blue Pulver wurde mit PBS gemischt, bis es undurchsichtig war. Für therapeutische Proof-of-Concept-Studien wurden die folgenden Konzentrationen verwendet: Ibudilast mit 10 mg/ml, TUDCA mit 50 mg/ml, Cyclosporin-Injektion mit 250 mg/ml und Anakinra mit 100 mg/0,67 ml. Therapeutische Pulver wurden in 0,9 % bakteriostatischer Kochsalzlösung verdünnt.
5. Fassen Sie mit einer feinen Augenzange mit Zähnen vorsichtig das untere Augenlid, um es zu stabilisieren. Führen Sie die Nadel mit der abgeschrägten Seite nach unten in einem Winkel auf halber Höhe zwischen 6 und 7 Uhr entlang des unteren Augenhöhlenrandes ein, bis die Rückseite der Augenhöhle zu spüren ist. Ziehen Sie die Nadel leicht zurück und injizieren Sie dann langsam das Therapeutikum (Abbildung 2).
6. Entfernen Sie vorsichtig und langsam die Nadel. Schließen Sie dann das Auge und halten Sie den Druck mindestens 10-15 s lang, bevor Sie mit Kochsalzlösung spülen.
7. Setzen Sie das Tier von Isofluran ab und entfernen Sie es von der Plattform für die Augenchirurgie. Geben Sie einen Tropfen Hypromellose 0,3 % in jedes Auge und lassen Sie das Tier dann auf einem Heizkissen erholen.

3. Dissektion der Isolierung des Augengewebes

1. Nachdem das Tier durch CO₂ -Erstickung eingeschläfert wurde oder wie im genehmigten IACUC-Protokoll anders angegeben, legen Sie das Tier in sternale Liege. Verwenden Sie einen quer verlaufenden Hautschnitt über dem dorsalen Hals, der sich bis zur Höhe der Ohrmuschel erstreckt.
2. Präparieren Sie die Rückenmuskulatur, um das Atlanto-Occipitalgelenk freizulegen. Verwenden Sie eine Mayo-Schere, um das Atlanto-Hinterhaupts-Gelenk zu durchschneiden und den Kopf vom Körper zu trennen (Abbildung 3). Entfernen Sie mit einer stumpfen Dissektion vorsichtig die Haut vom dorsalen Schädel von der Höhe der Nase bis zum dorsalen Hals, wobei die Haut um beide Augen intakt bleibt.
3. Führen Sie ein Paar mittelgerade Hämostaten oder Nadeltreiber in das Foramen magnum an der Schädelbasis ein. Mit den Hämostatika wird der laterale Schädel, der sich vom Foramen magnum bis zur Schläfenregion erstreckt, beidseitig sanft durchbrochen (Abbildung 3).
   1. Wenn Sie die Oberseite des Schädels entfernen, halten Sie die Hämostaten parallel zur dorsalen Seite des Gehirns. Dadurch wird sichergestellt, dass das Gehirn intakt bleibt und bei der Knochenentfernung nicht eingekerbt wird.
4. Reflektieren Sie mit einem flachen Spatel vorsichtig das Gehirn rostral, um die Sehnerven freizulegen. Es muss darauf geachtet werden, dass keine Spannung durch das Gewicht des Gehirns auf die Sehnerven ausgeübt wird.
5. Wenn die Nerven freiliegen, nehmen Sie eine mittelgroße Mikroschere und machen Sie einen kleinen Schnitt durch das Chiasma opticum, wodurch beide Nerven vom Gehirn getrennt werden. Zu diesem Zeitpunkt kann das Gehirn verworfen oder für 24 Stunden bei 4 °C in Paraformaldehyd in PBS (4% PFA) zur histologischen Beurteilung gelegt werden.
6. Entfernen Sie mit einer kleinen Irisschere und einer gezahnten ophthalmischen Mikrozange vorsichtig das überschüssige Gewebe (z. B. Augenlider, Bindegewebe usw.) aus der Augenpartie. Nach Fertigstellung sollte sich das Auge in der Augenhöhle befinden, aber nur der extraokuläre Muskel und die Drüsen sind noch vorhanden.
7. Schneiden Sie mit den Blutstillern in Verbindung mit der kleinen Irisschere durch die Augenhöhle und achten Sie darauf, dass der Sehnerv beim Passieren des Sehkanals nicht eingeschnitten wird. Brechen Sie den Knochen an der Rückseite der Augenhöhle vorsichtig mit den Hämostaten ab und verwenden Sie für eine genauere Kontrolle die kleine Dissektionsschere.
8. Nachdem der Knochen entfernt wurde, schneiden Sie mit einer Mikroschere und einer feinen Pinzette vorsichtig um die Augenhöhle herum, um die Fettpolster, Drüsen und extraokularen Muskeln zu entfernen. Achten Sie während dieses Prozesses auf die Sehnerven.
9. Das Auge sollte sanft kaudal in Richtung Schädelinnere reflektiert werden können. Entfernen Sie an dieser Stelle mit einer kleinen Mikroschere und einer feinen Pinzette das Bindegewebe, das den Nerv am unteren Schädelkamm umgibt.
10. Sobald dieses Gewebe entfernt wurde, sollten das Auge und der gesamte Sehnerv en bloc vom Schädel angehoben werden können. Wiederholen Sie diese Schritte für das kontralaterale Auge und den Nerv.
11. Reinigen Sie außerdem den Sehnerv und das Auge von überschüssigem Gewebe wie der Duralscheide. Wenn Gewebe für die histologische Analyse nicht konserviert werden müssen, dann schockfrosten mit Trockeneis oder flüssigem Stickstoff, bevor es bei -80 °C gelagert wird.
12. Für die Massenspektrometrie muss die Netzhaut vom inneren Bereich des Globus isoliert werden, und der Sehnerv muss isoliert werden. Trennen Sie den Sehnerv von der Kugel an der nächstgelegenen äußeren Stelle. Legen Sie den Nerv in ein Kryoröhrchen auf Eis, bevor er auf -80 °C übertragen wird.
    1. Platzieren Sie den Globus des Auges auf einer Petrischale unter einem Operationsmikroskop. Verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um das Auge ruhig zu halten, bevor Sie mit einer kleinen Mikroschere einen Schnitt am Limbus vornehmen.
    2. Verlängern Sie den Schnitt so, dass er den gesamten Umfang des Globus umfasst. Der Globus sollte halbiert werden, und der vordere Teil kann verworfen werden.
    3. Legen Sie die Innenseite des hinteren Abschnitts nach oben und entfernen Sie mit einer feinen Augenpinzette das dünne cremefarbene Gewebe. Es kann den Anschein haben, dass es an der Papille klebt. Schneiden Sie in diesem Fall mit der Mikroschere die Netzhaut von der Scheibe ab.
       HINWEIS: Das Netzhautgewebe kann dann in ein Kryoröhrchen auf Eis gelegt werden, bevor es auf -80 °C übertragen wird. Das Gewebe kann dann zur Auswertung in die Massenspektrometrie überführt werden.
13. Für die immunhistologische Färbung mittels Teilperfusion legen Sie das intakte Auge auf eine Petrischale. Verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um das Auge ruhig zu halten, bevor Sie eine Insulinspritze mit einer 28-G-Nadel nehmen und sie am Limbus einführen, wobei die Nadel zur Netzhaut hin abgewinkelt ist. Wiederholen Sie diesen Schritt an zwei weiteren Punkten entlang des Limbus. Die Punktion des Globus trägt dazu bei, eine ausreichende Durchblutung zu gewährleisten und hilft bei der richtigen Fixierung.
    HINWEIS: Der Globus sollte vor dem Übergang zu einem Schüttler mindestens 40 Minuten lang in 4 % PFA fixiert und weitere 20 Minuten lang mit niedriger Drehzahl gerührt werden, um die Flüssigkeitsbewegung zu erleichtern.
14. Sobald der Fixierungsschritt abgeschlossen ist, entfernen Sie das PFA und ersetzen Sie es durch PBS. Stellen Sie die Fläschchen 15 Minuten lang auf sanftes Schütteln und wiederholen Sie diesen Schritt für eine zweite 15-minütige PBS-Spülung.
15. Nach dem letzten PBS-Spülzyklus das PBS absaugen und durch 30%ige Saccharoselösung in PBS ersetzen und dann 24 Stunden lang in den Kühlschrank stellen. Nach dem Schritt der Saccharose-Inkubation ist das Gewebe für die histologische Beurteilung in die OCT einzubetten²⁶.

Ergebnisse

Vorläufige Pilotversuche wurden an Leichentieren mit Injektionsfarbstoff (Evans Blue Farbstoff) und Tätowierfarbe (Abbildung 2B) durchgeführt, um die Platzierung und Größe der Nadel sowohl für RBI als auch für IVI zu optimieren. Tätowierfarbe war unverdünnt, und dann wurde Evans Blue Pulver in PBS gemischt, bis die Flüssigkeit undurchsichtig wurde. Wir kamen zu dem Schluss, dass die ideale RBI aus einer 28-G-Nadel bestand, die in einem Winkel auf h...

Diskussion

Die komplizierten Herausforderungen, die mit der Verabreichung von Therapeutika an die Netzhaut und den Sehnerv verbunden sind, vor allem aufgrund der undurchlässigen Barriere, die von der BRB ausgeht, unterstreichen die Bedeutung dieser Studie ^3,4. Die Erforschung von IVI- und RBI-Techniken zeigt nicht nur innovative Ansätze zur Überwindung dieser Hindernisse auf, sondern unterstreicht auch die breiteren Auswirkungen auf die ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anakinra 100 mg/0.67 mL	Sobi	NDC: 66658-0234-07
Antipamezole hydrochloride (Antisedan) 5.0 mg/mL	Zoetis	NADA #141-033 | 107204-8
Bacteriostatic sodium chloride (0.9%)	Hospira Inc.	NDC: 0409-1966-02
Cryotube	VWR	76417-258	https://us.vwr.com/store/product?keyword=76417-258
Curved forceps	Fischer Scientific	08-953F
cyclosporine injection 250 mg/mL	Perrigo	NDC: 00574-0866-10
cyclosporine topical, 0.05% (Restasis)	AbbVie (Vizient)	NDC: 00023-9163-30
Cyotube Cap	Thermo Scientific	3471BLK	https://www.fishersci.com/shop/products/screw-cap-microcentrifuge-tube-caps/14755237?searchHijack=true&searchTerm= screw-cap-microcentrifuge-tube-caps&searchType=Rapid& matchedCatNo=14755237
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129-10G
Eye Spears	Fischer Scientific	NC0972725	https://www.fishersci.com/shop/products/ultracell-pva-eye-spears-100-p/NC0972725
Fine forceps	Fischer Scientific	08-953E	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-dissecting-jewelers-microforceps-2/08953E?gclid=Cj0KCQiAkJO8BhCGARIsAM kswyiER9Kanmi3ZMgoXTr82Zg3 g44m1Q6WLftkYfb36hC7pbkwR hVAy3MaAqkLEALw_wcB&ef_id =Cj0KCQiAkJO8BhCGARIsAMks wyiER9Kanmi3ZMgoXTr82Zg3g4 4m1Q6WLftkYfb36hC7pbkwRhV Ay3MaAqkLEALw_wcB:G:s&ppc _id=PLA_goog_2086145680_81 843405274_08953E__38624700 1354_6556597232892883360& ev_chn=shop&s_kwcid=AL!4428 !3!386247001354!!!g!827721591 040!&gad_source=1
Fine ophthalmic forceps with teeth	Fisher Scientific	50-253-8287	https://www.fishersci.com/shop/products/bonn-suturing-forceps-7-5-cm/502538287
Flat spatula	Fischer Scientific	14-375-100	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-spoonula-lab-spoon/1437510#?keyword=
Hot bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	https://www.finescience.com/en-US/Products/Instrument-Care-Accessories/Sterilization/Hot-Bead-Sterilizers
Hypromellose 0.3% (GenTeal Tears Severe Dry Eye Gel)	Alcon Laboratories Inc.		https://www.amazon.com/GenTeal-Tears-Lubricant-Ointment-Night-Time/dp/B01IN5G1L0/ref=sr_1_4?dib=eyJ2IjoiMSJ9.DxYpqjIIBNO TVuPo7jln5xeGazA_YFg0cbt3 kCyC-0ouZARw5qIHYvCM7vB R_vO30OWUEXDZhQmQfLQ9 ySld4mujpzrWjxbsEXLBs5JPhjZ eUPgPY0sHoJA46f9EYULdxiTu BQy5fVA2OB20RV09mbdW8hX 6j8-bXIYTZljPGMo5_GMq9jnJo8 3iR35c1THxEiEH2FsvSx7VXup- QK9uCkWwAYrw2v3tyLUCq2JT APPF34nsYqGnSASMgOARU_ 2lVz-kIy-QUEYHGOoIimIWwBY htz33RkFrq7YjtnC2uDbImNiudG zWJv-uUhmJngYjbBGbeWE0VX 7CGPkEokUZrCQ8AI2HeXjSMph gPhMbK88RcHJ63AyH0TiBtS2k1 Xceh-CD26_prJSNxF6Mv5-jgGf9 iLmXvVtKkkSwc-5uYLk7gZHaFC Yj73F_imbmeHYr.4vfu7h4m4Jlfy- qiqmgeAnDHlJTGYV22HJ2w_xD ir0k&dib_tag=se&keywords=Gent eal+gel&qid=1736793609&sr=8-4
ibudilast	Millipore Sigma	I0157-10MG
insulin syringe 0.5 mL with a 28 gauge Micro-Fine IV Needle	Becton, Dickinson and Company (BD)	14-826-79
Isoflurane	Covetrus	NDC: 11695-6777-2
Ketamine	Covetrus	NDC: 11695-0703-1
Long Evans Rat	Charles River Laboratories International, Inc.		https://www.criver.com/products-services/find-model/long-evans-rat?region=3611
Mayo Scissors	Electron Microscopy Sciences	72968-03
Medium microscissors	Amazon		https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z168866#product-documentation
Medium straight hemostats or needle drivers	Sigma-Aldrich	Z168866-1EA	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z168866#product-documentation
Needle 33 G with a style 4 tip at a length of 10 mm and angle of 15 degrees	Hamilton	7803-05
paraformaldehyde 4 in phosphate-buffered saline (PBS) (4% PFA)	Thermo Fischer	J61899.AK
Petri dish	Millipore Sigma	P5606-400EA	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5606?utm_source=google&utm_medium= cpc&utm_campaign=8674694095 &utm_content=105162454052& gad_source=1&gclid=Cj0KCQiA kJO8BhCGARIsAMkswygXXfgY ABr7EfLtf4tvuLS0E8A4SxX4XM NJQDaI80Yi4FO-iahCsPcaAp9E EALw_wcB
phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813-10PAK	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p3813
Povidone-Iodine (Betadine) 5%	Alcon Laboratories Inc.	NDC: 0065-0411-30
Shaker Model 3500	VWR	89032-092
Small iris scissors	Sigma-Aldrich	Z265977-1EA	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z265977&
small microscissors	Fisher Scientific	17-456-004	https://www.fishersci.com/shop/products/self-opening-scissors-2/17456004?keyword=true
Sprague Dawley Rat	Charles River Laboratories International, Inc.	SAS 400	https://emodels.criver.com/product/400
Sucrose	Millipore Sigma	57-50-1	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/sucrose3423057501
syringe 10 µL (Model 701 RN)	Hamilton	80330
Tattoo Ink (Intenze Tattoo Ink True Black 1 oz)	Amazon		https://www.amazon.com/Intenze-Tattoo-Ink-True-Black/dp/B01GW747L2
tauroursodeoxycholic acid (TUDCA)	Milipore Sigma	580549-1GM
Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%	Bausch & Lomb Inc.	NDC: 68682-920-64
Xylazine (Rompun) 100 mg/mL	Dechra	NADA #047-956 |