Entrega terapêutica ocular e recuperação avançada de tecidos em ratos adultos

Resumo

Este estudo apresenta uma metodologia para a administração de terapêutica na retina e nos nervos ópticos do rato adulto. Além disso, um método exclusivo de recuperação de tecido é introduzido para uma coleção em bloco de cima para baixo do nervo óptico e da retina em um rato adulto.

Resumo

A administração terapêutica no segmento posterior do olho, incluindo a retina e o nervo óptico, é complicada pela presença de barreiras hematoencefálicas e hematorretinianas. Modelos de pequenos animais, como ratos, são utilizados para estudar várias patologias oculares. Embora a entrega terapêutica no olho posterior seja desafiadora, alcançá-la é essencial para o tratamento de distúrbios oculares, muitos dos quais requerem validação em modelos de pequenos animais para relevância translacional. Portanto, duas técnicas de administração terapêutica posterior são apresentadas: injeção intravítrea (IVI) e injeção retrobulbar (RBI) para uso em ratos adultos. Além disso, um método para a remoção em bloco dos olhos e nervos ópticos é introduzido para várias técnicas de análise histológica e molecular. O protocolo de dissecção permite a observação completa do sistema neurovisual, minimizando a lesão post-mortem nos tecidos da retina e do nervo óptico. A entrega bem-sucedida da ciclosporina terapêutica na retina e no nervo óptico foi alcançada, com concentrações detectáveis observadas vinte e quatro horas após a injeção usando IVI e RBI. Além disso, amostras de retina e nervos em bloco foram extraídas com sucesso para análise histológica completa do tecido ocular, facilitando a observação abrangente da retina e do sistema neurovisual mais amplo.

Introdução

A administração terapêutica na retina e no nervo óptico é incrivelmente difícil devido à complexa anatomia do olho ^1,2, especificamente a presença da barreira hemato-retiniana (BRB) ^{3 , 4 , 5} . O BRB serve para proteger a retina da invasão da circulação sistêmica, mas é um oponente desafiador da administração terapêutica, pois a circulação terapêutica sistêmica é frequentemente bloqueada pelo BRB ^6,7. Pequenas moléculas lipofílicas podem se difundir facilmente através do BRB, mas moléculas maiores e hidrofílicas têm mais dificuldade em obter acesso à retina⁶. As injeções intravítreas (IVI) e retrobulbares (RBI) permitem a administração de fármacos aos tecidos oculares, superando as limitações impostas pelo BRB. O IVI serve como um compromisso promissor ao administrar terapêutica no ambiente interno do olho ^8,9. Esse método requer que a droga atravesse o vítreo, contornando o BRB e difundindo-se pela retina e coroide para atingir o nervo óptico⁷. O RBI é entregue atrás do olho no espaço retrobulbar¹⁰. A terapêutica pode ser administrada por difusão através dos tecidos e glândulas no espaço retrobulbar, afetando o nervo óptico e as estruturas circundantes sem entrar diretamente na retina, o que mantém a integridade do BRB. Ao administrar medicamentos direta ou indiretamente no olho, tanto as injeções intravítreas quanto as retrobulbares podem atingir concentrações locais mais altas do medicamento terapêutico, o que aumenta sua eficácia em comparação com a administração tópica ou sistêmica (oral ou intravenosa)². Isso é particularmente importante para tratamentos que requerem ação rápida ou alta potência, como visto em muitas doenças oculares. A administração direcionada também limita a exposição do resto do corpo ao medicamento, o que reduz o risco de efeitos fora do alvo e ajuda a minimizar possíveis efeitos adversos que podem ocorrer quando os medicamentos são administrados topicamente, por via oral ou intravenosa¹¹.

Outras injeções perioculares, como subconjuntival, subtenon posterior e sub-retiniana, têm seus próprios benefícios e limitações ^2,5. Observou-se que as injeções de subtenon posterior fornecem altas concentrações de drogas aos tecidos oculares; no entanto, a injeção subtenoniana está mais próxima da esclera do que da vasculatura orbitária ^5,12. Em contraste, o RBI coloca o terapêutico mais próximo do nervo óptico do que o subtenon posterior ou subconjuntival¹³. Isso pode significar que as patologias do nervo óptico favorecem a terapêutica administrada pelo RBI em relação a outros tipos de injeção periocular. As injeções de subtenon posterior têm riscos associados, incluindo estrabismo, hifema e pressão intraocular elevada⁵. A pressão intraocular elevada também é um fator de risco relatado em injeções de IVI, subconjuntival e sub-retiniana². Esses tipos de injeção geralmente requerem doses repetitivas para alcançar o efeito terapêutico desejado². Outros fatores de risco associados a injeções sub-retinianas, injeções subconjuntivais e IVI incluem formação de catarata, hemorragia retiniana, descolamento de retina e inflamação². Essas injeções de IVI, sub-retinianas e subconjuntivais são mais invasivas do que as injeções de RBI, pois essas injeções são intraoculares². O RBI pode ser considerado menos invasivo, pois coloca o terapêutico no espaço retrobulbar, sem entrar diretamente na agulha no globo ocular. Outras estratégias terapêuticas menos invasivas, como a administração tópica, ficam aquém da entrega suficiente do medicamento, com menos de 5% do medicamento retido na superfície ocular ^2,5.

A IVI é uma técnica proeminente em modelos pré-clínicos que é usada por sua capacidade de fornecer agentes terapêuticos diretamente no segmento posterior do olho. A IVI entrega o medicamento diretamente no humor vítreo, tornando-se uma técnica de entrega preferida para tratamento localizado¹⁴. A técnica IVI permite que a terapêutica contorne a barreira hematorretiniana, que é um obstáculo comum à penetração da droga na retina¹⁴. O IVI introduz a oportunidade de inflamação e danos às estruturas oculares, portanto, a adesão meticulosa ao procedimento deve ser empregada¹⁴. Para minimizar o descolamento de retina e a formação de catarata, Chiu et al. descrevem uma abordagem IVI que enfatiza uma inserção e injeção chanfrada de 45 graus no nível da par plana, evitando o cristalino, a retina, o músculo ocular e os vasos¹⁵. Nessa técnica, uma agulha de 30 G é inserida na esclera nasal para administração terapêutica¹⁵. O IVI ainda está associado a riscos devido à sua natureza invasiva. Os riscos potenciais incluem descolamento de retina, formação de catarata, endoftalmite ou hemorragia¹⁶. A natureza invasiva das técnicas de IVI também aumenta a pressão intraocular, como mostrado em um experimento com olhos suínos realizado por Ikjong Park et ^al.16. O estudo mostra mudanças na pressão intraocular durante diferentes estágios de inserção da agulha e injeção de fluido. Eles relatam variação substancial na pressão intraocular durante o procedimento¹⁶.

Os RBIs foram utilizados com sucesso em estudos anteriores como meio de entrega terapêutica a roedores. Um desses estudos comparou os efeitos de vários análogos da prostaglandina administrados via RBI¹⁷. Os ratos albinos receberam um RBI com uma agulha 26 G de 0,1 mL injetado inserida através da área lateral do fórnice inferior em um ângulo de 45 graus¹⁷. O protocolo utilizado neste estudo foi adaptado de um método previamente descrito, no qual os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal (IP) de cloralite¹⁸. Outro estudo realizado em ratos comparou gotas tópicas com injeções retrobulbares¹⁹. Os ratos foram anestesiados por meio de injeção IP de cetamina/xilazina, e o RBI foi administrado por agulha 30 G¹⁹. Em contraste com os métodos de sedação discutidos anteriormente, um estudo que observou os efeitos do RBI na gordura orbital usou isoflurano inalatório para sedar os ratos antes do RBI²⁰. Embora esses estudos forneçam informações sobre quais anestésicos e especificações de agulhas podem ser bem-sucedidos, o posicionamento e o manuseio dos animais durante o procedimento não são discutidos.

Vários estudos em camundongos também conduzem RBIs para métodos de entrega terapêutica. Um estudo comparou RBI com injeção de veia caudal lateral para induzir com sucesso a síndrome nefrótica²¹. Um segundo estudo também comparou as mesmas duas técnicas de injeção na administração de meios de contraste para imagens^{cardíacas 22}. Os camundongos foram anestesiados com isoflurano inalatório e injetados no lado medial do olho²². Ambos os estudos adaptaram seu método RBI de um protocolo escrito anteriormente. É importante notar que este protocolo nomeou sua injeção como retro-orbital, mas descreveu o local da injeção como o espaço retrobulbar atrás do olho. Os autores desse protocolo utilizaram o isoflurano inalatório como método de sedação preferido, observando o rápido tempo de ativação e recuperação dos camundongos²³. Para um RBI, o olho foi parcialmente projetado da órbita aplicando pressão na pele ao redor do olho²³. Em seguida, a agulha foi introduzida no chanfro medial com o lado chanfrado para baixo em um ângulo de 30 graus e foi inserida até atingir a base do olho²³. Deve-se ter cuidado ao aplicar pressão no animal, pois pode ocorrer bloqueio acidental do fluxo sanguíneo ou colapso traqueal²³. O injetor também é cego para a ponta da agulha após a inserção e, portanto, danificar o olho é um risco associado. ²³ Danificar o olho após a administração terapêutica é um risco crítico neste experimento, pois causar lesões adicionais prejudica diretamente os resultados do estudo. Deve-se notar também que a técnica de posicionamento e manuseio descrita anteriormente foi realizada em camundongos e não incluiu comentários sobre a aplicabilidade em ratos.

Existem muitas maneiras pelas quais a remoção do nervo óptico e da retina foi tentada. Um desses métodos explorou a remoção de nervos ópticos e olhos em bloco, preservando um quiasma óptico intacto²⁴. Este método é o mais comparável ao estudo atual, pois os olhos individuais e os nervos ópticos também são preservados para remoção em bloco; no entanto, o quiasma óptico é separado. Ter cautela neste procedimento seria de extrema importância devido à complexidade do procedimento. No método atual, iniciamos a dissecção através do crânio caudal e trabalhamos rostralmente para fornecer acesso de uma forma que limite os danos aos nervos ópticos e permita que todo o nervo permaneça intacto. Além disso, manter o nervo intacto e ligado ao olho é crucial para o processo de incorporação, pois o dano a cada parte do nervo pode corresponder a uma observação patológica diferente²⁴. É importante considerar a orientação do nervo óptico, pois a forma como ele está embutido permite diferentes seções transversais, o que pode ser importante para a análise histológica.

Um dispositivo feito sob medida conhecido como mesa cirúrgica oftálmica de laboratório de pequenos animais (SALOOT, uma plataforma de cirurgia oftálmica) é composto por uma série de materiais impressos em 3D para fornecer anestesia e manter o animal em uma posição estável para injeções terapêuticas oculares. O design SALOOT permite a estabilidade da cabeça e das estruturas oculares para procedimentos oftálmicos, o que melhora a velocidade e a reprodutibilidade das operações, ao mesmo tempo em que permite a administração de anestesia com gás e a eliminação de partículas de expiração. O SALOOT é um bloco impresso tridimensional com uma redução côncava para segurar o corpo do rato com uma região mais estreita na frente para segurar a cabeça do animal em um cone de nariz com uma entrada de isoflurano. Abaixo do cone do nariz há um pequeno reservatório e uma saída de exaustão. Os seguintes métodos foram desenvolvidos para entrega ocular terapêutica e recuperação precisa do tecido ocular; Eles foram projetados para estudar tecidos após trauma ocular, por isso é crucial delinear os efeitos do trauma, injeção, tratamento e dissecção para evitar interpretações confusas dos achados.

Este artigo apresenta dois métodos de injeção terapêutica ocular, as injeções intravítreas e retrobulbares, para uso em ratos adultos. Além disso, um método de recuperação de tecido é apresentado para a remoção em bloco do nervo óptico e da retina intactos de um rato adulto. Essas técnicas permitem a investigação dos efeitos oculares e peri-oculares da patologia induzida e do tratamento.

Protocolo

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual e aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais da Ohio State University. Ratos machos da raça Sprague Dawley pesando ~200 g e com cerca de 2 meses de idade foram utilizados para este estudo²⁵. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Injeção intravítrea (IVI)

1. Conecte o isoflurano e os cabos residuais às portas de fixação SALOOT. Anestesie o animal usando procedimentos padrão de isoflurano seguindo a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual e o protocolo IACUC aprovado.
   NOTA: Alternativamente, se o animal já estava sob anestesia de outra sessão de teste oftálmico (ou seja, mistura de cetamina / xilazina; 90 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina), transfira o animal para a plataforma de cirurgia oftálmica e titule a anestesia com isoflurano (relação 3 oxigênio: 3 isoflurano) para garantir que a profundidade adequada da anestesia seja mantida.
2. Coloque a plataforma de cirurgia oftálmica com o animal anestesiado sob um microscópio cirúrgico ao vivo. Avalie a profundidade do anestésico por meio do reflexo de retirada do pedal.
3. Coloque uma a duas gotas de solução oftálmica de cloridrato de tetracaína a 0,5% no olho ou olhos que estão sendo operados. Aplique pomada oftálmica tópica lubrificante, como hipromelose 0,3%, no olho contralateral, se nenhuma manipulação for realizada.
   1. Em seguida, use uma a duas gotas de iodopovidona a 5% na superfície ocular e, usando um cotonete, aplique iodopovidona na pele ao redor do olho.
4. Use uma seringa de 10 μL com uma agulha de 33 G com uma ponta estilo 4 com um comprimento de 10 mm e ângulo de 15 graus e retire cloreto de sódio bacteriostático a 0,9%. Lave a seringa e a agulha com a solução salina antes de mergulhar a agulha em um esterilizador de esferas quente.
   1. Deixe esfriar antes de prosseguir. Depois que a agulha esfriar, elabore a terapêutica de interesse na quantidade desejada (4 μL).
      NOTA: Para estudos de prova de conceito, tinta de tatuagem não diluída e corante azul de Evan em solução salina tamponada com fosfato (PBS) foram utilizados. O pó azul de Evan foi misturado com PBS até ficar opaco. Para estudos terapêuticos de prova de conceito, foram utilizadas as seguintes concentrações: ibudilast a 1 mg/mL, ácido taurosodesoxicólico (TUDCA) 5 mg/mL, injeção de ciclosporina, 250 mg/mL e anacinra 100 mg/0,67 mL. Os pós terapêuticos foram diluídos em solução salina bacteriostática a 0,9%.
5. Usando uma pinça oftálmica fina com dentes, segure suavemente o tecido escleral no limbo para estabilizar. Haverá um anel vermelho fraco ao redor da íris. Use este anel como um ponto de referência, insira a agulha, com o lado chanfrado voltado para baixo, e injete-o no olho posterior.
   NOTA: Certifique-se de inclinar a agulha em direção à retina e insira a agulha apenas 2/3 do caminho (Figura 1). Certifique-se de que a agulha não risque a lente, pois isso levará à formação de catarata.
6. Após a injeção terapêutica, remova lentamente a agulha. Feche o olho e mantenha a pressão por pelo menos 10-15 s antes de lavar com solução salina.
7. Interrompa o animal do isoflurano e remova-o da plataforma de cirurgia oftálmica. Coloque uma gota de hipromelose 0,3% em cada olho e deixe o animal se recuperar em uma almofada de aquecimento.

2. Injeção retrobulbar (RBI)

1. Conecte o isoflurano e os cabos residuais às portas de fixação SALOOT. Anestesiar o animal usando procedimentos padrão de isoflurano.
   NOTA: Alternativamente, se o animal já estava sob anestesia de outra sessão de teste oftálmico (ou seja, mistura de cetamina / xilazina; 90 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina), transfira o animal para a plataforma de cirurgia oftálmica e titule a anestesia com isoflurano (relação 3 oxigênio: 3 isoflurano) para garantir que a profundidade adequada da anestesia seja mantida.
2. Coloque a plataforma de cirurgia oftálmica com o animal anestesiado sob um microscópio cirúrgico ao vivo. Avalie a profundidade do anestésico por meio do reflexo de retirada do pedal.
3. Coloque uma a duas gotas de solução oftálmica de cloridrato de tetracaína a 0,5% no olho ou olhos que estão sendo operados. Aplique pomada oftálmica tópica lubrificante (hipromelose 0,3%) no olho contralateral se nenhuma manipulação for realizada.
   1. Em seguida, use uma a duas gotas de iodopovidona a 5% na superfície ocular e, usando uma lança ocular, aplique iodopovidona na pele ao redor do olho.
4. Obtenha uma seringa de insulina de 0,5 ml com uma agulha de 28 G. Elabore a terapêutica de interesse na quantidade desejada (100 μL).
   NOTA: Para estudos de prova de conceito, tinta de tatuagem não diluída e corante azul de Evan em solução salina tamponada com fosfato (PBS) foram utilizados. O pó azul de Evan foi misturado com PBS até ficar opaco. Para estudos de prova de conceito terapêutico, foram utilizadas as seguintes concentrações: ibudilast a 10 mg/mL, TUDCA a 50 mg/mL, injeção de ciclosporina 250 mg/mL e anakinra a 100 mg/0,67 mL. Os pós terapêuticos foram diluídos em solução salina bacteriostática a 0,9%.
5. Usando uma pinça oftálmica fina com dentes, segure suavemente a pálpebra inferior para estabilizar. Insira a agulha, com o lado chanfrado para baixo, em um ângulo a meio caminho entre 6 e 7 horas ao longo da borda orbital inferior até que a parte de trás da cavidade ocular seja sentida. Puxe a agulha ligeiramente para trás e, em seguida, injete lentamente a terapêutica (Figura 2).
6. Remova a agulha com cuidado e lentamente. Em seguida, feche o olho e mantenha a pressão por pelo menos 10-15 s antes de lavar com solução salina.
7. Interrompa o animal do isoflurano e remova-o da plataforma de cirurgia oftálmica. Coloque uma gota de hipromelose 0,3% em cada olho e deixe o animal se recuperar em uma almofada de aquecimento.

3. Dissecção de isolamento de tecido ocular

1. Depois que o animal tiver sido sacrificado por asfixia por CO₂ ou conforme declarado no protocolo IACUC aprovado, coloque o animal em decúbito esternal. Utilize uma incisão transversal na pele sobre o dorso do pescoço, estendendo-se até o nível do pavilhão auricular.
2. Dissecar a musculatura dorsal para expor a articulação atlanto-occipital. Use uma tesoura de maionese para fazer uma incisão na articulação atlanto-occipital, separando a cabeça do corpo (Figura 3). Usando dissecção romba, remova suavemente a pele do crânio dorsal do nível do nariz até o dorso do pescoço, deixando a pele ao redor de ambos os olhos intacta.
3. Insira um par de hemostáticos retos médios ou chaves de agulha no forame magno na base do crânio. Use os hemostáticos para romper suavemente o crânio lateral que se estende do forame magno até a região temporal em ambos os lados (Figura 3).
   1. Ao remover a parte superior do crânio, mantenha os hemostáticos paralelos ao lado dorsal do cérebro. Isso garantirá que o cérebro permaneça intacto e não seja cortado no processo de remoção óssea.
4. Usando uma espátula plana, reflita suavemente o cérebro rostralmente para expor os nervos ópticos. Deve-se tomar cuidado para que a tensão do peso do cérebro não seja aplicada aos nervos ópticos.
5. Com os nervos expostos, pegue uma microtesoura média e faça uma pequena incisão no quiasma óptico, cortando os dois nervos do cérebro. Nesse ponto, o cérebro pode ser descartado ou colocado em paraformaldeído em PBS (4% PFA) por 24 h a 4 ° C para avaliação histológica.
6. Usando uma tesoura de íris pequena e um par de micropinças oftálmicas dentadas, remova cuidadosamente o excesso de tecido (ou seja, pálpebras, tecido conjuntivo, etc.) ao redor do olho. Uma vez concluído, o olho deve estar situado na cavidade ocular, mas com apenas o músculo extraocular e as glândulas ainda presentes.
7. Usando os hemostáticos em conjunto com a pequena tesoura de íris, corte a órbita ocular, tomando muito cuidado para não cortar o nervo óptico ao passar pelo canal óptico. Quebre cuidadosamente o osso na parte de trás da cavidade ocular com os hemostáticos e, para um controle mais preciso, utilize a pequena tesoura de dissecção.
8. Depois que o osso for removido, corte delicadamente ao redor da órbita ocular com uma microtesoura e uma pinça fina para remover as almofadas de gordura, glândulas e músculos extraoculares. Certifique-se de estar atento aos nervos ópticos durante este processo.
9. O olho deve ser capaz de ser refletido suavemente caudalmente em direção ao interior do crânio. Neste ponto, use pequenas microtesouras e pinças finas para remover o tecido conjuntivo ao redor do nervo na crista inferior do crânio.
10. Uma vez que esse tecido tenha sido removido, o olho e o nervo óptico completo devem poder ser retirados do crânio em bloco. Repita essas etapas para o olho e nervo contralaterais.
11. Além disso, limpe o nervo óptico e o olho do excesso de tecido, como a bainha dural. Se os tecidos não precisarem ser preservados para análise histológica, congele rapidamente usando gelo seco ou nitrogênio líquido antes de serem armazenados a -80 °C.
12. Para espectrometria de massa, a retina precisa ser isolada da região interna do globo e o nervo óptico precisa ser isolado. Separe o nervo óptico do globo no ponto externo mais próximo. Coloque o nervo em um criotubo no gelo antes de ser transferido para -80 °C.
    1. Coloque o globo ocular em uma placa de Petri sob um microscópio cirúrgico. Use um par de pinças curvas para manter o olho firme antes de fazer uma incisão no limbo com uma pequena microtesoura.
    2. Estenda o corte para abranger toda a circunferência do globo. O globo deve ser dividido ao meio e a porção anterior pode ser descartada.
    3. Coloque a seção posterior com o lado interno voltado para cima e, usando uma pinça oftálmica fina, remova o tecido fino de cor creme. Pode parecer que gruda no disco óptico. Se isso ocorrer, use a microtesoura para cortar a retina do disco.
       NOTA: O tecido da retina pode então ser colocado em um criotubo no gelo antes de ser transferido para -80 °C. Os tecidos podem então ser transferidos para a instalação de espectrometria de massa para avaliação.
13. Para coloração imuno-histológica usando perfusão parcial, coloque o olho intacto em uma placa de Petri. Use um par de pinças curvas para manter o olho firme antes de pegar uma seringa de insulina com uma agulha de 28 G e inseri-la no limbo, com a agulha inclinada em direção à retina. Repita esta etapa em outros dois pontos ao longo do limbo. A punção do globo ajuda a garantir a perfusão adequada e auxilia na fixação adequada.
    NOTA: O globo deve ser fixado em PFA a 4% por pelo menos 40 minutos antes de fazer a transição para um agitador e agitar em baixa velocidade por mais 20 minutos para facilitar o movimento do fluido.
14. Quando a etapa de fixação estiver concluída, remova o PFA e substitua-o por PBS. Coloque os frascos para injetáveis em agitação suave por 15 min e, em seguida, repita esta etapa para um segundo enxágue PBS de 15 min.
15. Após o ciclo final de enxágue do PBS, aspire o PBS e substitua-o por solução de sacarose a 30% em PBS e leve à geladeira por 24 h. Após a etapa de incubação da sacarose, incorporar tecido na OCT para avaliação histológica²⁶.

Resultados

Experimentos piloto preliminares foram realizados em animais cadáveres usando corante de injeção (corante Evans Blue) e tinta de tatuagem (Figura 2B) para otimizar a colocação e o tamanho da agulha para RBI e IVI. A tinta da tatuagem não era diluída e, em seguida, o pó Evans Blue foi misturado em PBS até que o fluido se tornasse opaco. Concluímos que o RBI ideal apresentava uma agulha de 28 G inserida em um ângulo intermediário entre 6 e 7 horas ...

Discussão

Os intrincados desafios associados à administração terapêutica da retina e do nervo óptico, principalmente devido à barreira impermeável imposta pelo BRB, ressaltam a importância deste estudo ^3,4. A exploração das técnicas de IVI e RBI não apenas destaca abordagens inovadoras para superar esses obstáculos, mas também enfatiza as implicações mais amplas para os cuidados oculares e o desenvolvimento terapêutico. Es...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anakinra 100 mg/0.67 mL	Sobi	NDC: 66658-0234-07
Antipamezole hydrochloride (Antisedan) 5.0 mg/mL	Zoetis	NADA #141-033 | 107204-8
Bacteriostatic sodium chloride (0.9%)	Hospira Inc.	NDC: 0409-1966-02
Cryotube	VWR	76417-258	https://us.vwr.com/store/product?keyword=76417-258
Curved forceps	Fischer Scientific	08-953F
cyclosporine injection 250 mg/mL	Perrigo	NDC: 00574-0866-10
cyclosporine topical, 0.05% (Restasis)	AbbVie (Vizient)	NDC: 00023-9163-30
Cyotube Cap	Thermo Scientific	3471BLK	https://www.fishersci.com/shop/products/screw-cap-microcentrifuge-tube-caps/14755237?searchHijack=true&searchTerm= screw-cap-microcentrifuge-tube-caps&searchType=Rapid& matchedCatNo=14755237
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129-10G
Eye Spears	Fischer Scientific	NC0972725	https://www.fishersci.com/shop/products/ultracell-pva-eye-spears-100-p/NC0972725
Fine forceps	Fischer Scientific	08-953E	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-dissecting-jewelers-microforceps-2/08953E?gclid=Cj0KCQiAkJO8BhCGARIsAM kswyiER9Kanmi3ZMgoXTr82Zg3 g44m1Q6WLftkYfb36hC7pbkwR hVAy3MaAqkLEALw_wcB&ef_id =Cj0KCQiAkJO8BhCGARIsAMks wyiER9Kanmi3ZMgoXTr82Zg3g4 4m1Q6WLftkYfb36hC7pbkwRhV Ay3MaAqkLEALw_wcB:G:s&ppc _id=PLA_goog_2086145680_81 843405274_08953E__38624700 1354_6556597232892883360& ev_chn=shop&s_kwcid=AL!4428 !3!386247001354!!!g!827721591 040!&gad_source=1
Fine ophthalmic forceps with teeth	Fisher Scientific	50-253-8287	https://www.fishersci.com/shop/products/bonn-suturing-forceps-7-5-cm/502538287
Flat spatula	Fischer Scientific	14-375-100	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-spoonula-lab-spoon/1437510#?keyword=
Hot bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	https://www.finescience.com/en-US/Products/Instrument-Care-Accessories/Sterilization/Hot-Bead-Sterilizers
Hypromellose 0.3% (GenTeal Tears Severe Dry Eye Gel)	Alcon Laboratories Inc.		https://www.amazon.com/GenTeal-Tears-Lubricant-Ointment-Night-Time/dp/B01IN5G1L0/ref=sr_1_4?dib=eyJ2IjoiMSJ9.DxYpqjIIBNO TVuPo7jln5xeGazA_YFg0cbt3 kCyC-0ouZARw5qIHYvCM7vB R_vO30OWUEXDZhQmQfLQ9 ySld4mujpzrWjxbsEXLBs5JPhjZ eUPgPY0sHoJA46f9EYULdxiTu BQy5fVA2OB20RV09mbdW8hX 6j8-bXIYTZljPGMo5_GMq9jnJo8 3iR35c1THxEiEH2FsvSx7VXup- QK9uCkWwAYrw2v3tyLUCq2JT APPF34nsYqGnSASMgOARU_ 2lVz-kIy-QUEYHGOoIimIWwBY htz33RkFrq7YjtnC2uDbImNiudG zWJv-uUhmJngYjbBGbeWE0VX 7CGPkEokUZrCQ8AI2HeXjSMph gPhMbK88RcHJ63AyH0TiBtS2k1 Xceh-CD26_prJSNxF6Mv5-jgGf9 iLmXvVtKkkSwc-5uYLk7gZHaFC Yj73F_imbmeHYr.4vfu7h4m4Jlfy- qiqmgeAnDHlJTGYV22HJ2w_xD ir0k&dib_tag=se&keywords=Gent eal+gel&qid=1736793609&sr=8-4
ibudilast	Millipore Sigma	I0157-10MG
insulin syringe 0.5 mL with a 28 gauge Micro-Fine IV Needle	Becton, Dickinson and Company (BD)	14-826-79
Isoflurane	Covetrus	NDC: 11695-6777-2
Ketamine	Covetrus	NDC: 11695-0703-1
Long Evans Rat	Charles River Laboratories International, Inc.		https://www.criver.com/products-services/find-model/long-evans-rat?region=3611
Mayo Scissors	Electron Microscopy Sciences	72968-03
Medium microscissors	Amazon		https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z168866#product-documentation
Medium straight hemostats or needle drivers	Sigma-Aldrich	Z168866-1EA	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z168866#product-documentation
Needle 33 G with a style 4 tip at a length of 10 mm and angle of 15 degrees	Hamilton	7803-05
paraformaldehyde 4 in phosphate-buffered saline (PBS) (4% PFA)	Thermo Fischer	J61899.AK
Petri dish	Millipore Sigma	P5606-400EA	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5606?utm_source=google&utm_medium= cpc&utm_campaign=8674694095 &utm_content=105162454052& gad_source=1&gclid=Cj0KCQiA kJO8BhCGARIsAMkswygXXfgY ABr7EfLtf4tvuLS0E8A4SxX4XM NJQDaI80Yi4FO-iahCsPcaAp9E EALw_wcB
phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813-10PAK	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p3813
Povidone-Iodine (Betadine) 5%	Alcon Laboratories Inc.	NDC: 0065-0411-30
Shaker Model 3500	VWR	89032-092
Small iris scissors	Sigma-Aldrich	Z265977-1EA	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z265977&
small microscissors	Fisher Scientific	17-456-004	https://www.fishersci.com/shop/products/self-opening-scissors-2/17456004?keyword=true
Sprague Dawley Rat	Charles River Laboratories International, Inc.	SAS 400	https://emodels.criver.com/product/400
Sucrose	Millipore Sigma	57-50-1	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/sucrose3423057501
syringe 10 µL (Model 701 RN)	Hamilton	80330
Tattoo Ink (Intenze Tattoo Ink True Black 1 oz)	Amazon		https://www.amazon.com/Intenze-Tattoo-Ink-True-Black/dp/B01GW747L2
tauroursodeoxycholic acid (TUDCA)	Milipore Sigma	580549-1GM
Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%	Bausch & Lomb Inc.	NDC: 68682-920-64
Xylazine (Rompun) 100 mg/mL	Dechra	NADA #047-956 |