JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה מציג מתודולוגיה להעברת טיפולים לרשתית ולעצבי הראייה של החולדה הבוגרת. בנוסף, מוצגת שיטה ייחודית לאחזור רקמות לאיסוף מלמעלה למטה של עצב הראייה והרשתית בחולדה בוגרת.

Abstract

אספקה טיפולית למקטע האחורי של העין, כולל הרשתית ועצב הראייה, מסובכת על ידי נוכחות של מחסומי דם-מוח ודם-רשתית. מודלים של בעלי חיים קטנים, כגון חולדות, משמשים לחקר פתולוגיות עיניים שונות. בעוד שמתן טיפול לעין האחורית הוא מאתגר, השגתו חיונית לטיפול בהפרעות עיניים, שרבות מהן דורשות תיקוף במודלים של בעלי חיים קטנים לצורך רלוונטיות תרגומית. לכן, מוצגות שתי טכניקות אספקה טיפוליות אחוריות: הזרקה תוך זגוגית (IVI) והזרקה רטרובולברית (RBI) לשימוש בחולדות בוגרות. בנוסף, מוצגת שיטה להסרת גוש העיניים ועצבי הראייה לטכניקות ניתוח היסטולוגיות ומולקולריות שונות. פרוטוקול הדיסקציה מאפשר תצפית מלאה על המערכת הנוירו-ויזואלית תוך מזעור פגיעה לאחר המוות ברקמות הרשתית ועצב הראייה. הושגה אספקה מוצלחת של הציקלוספורין הטיפולי לרשתית ולעצב הראייה, עם ריכוזים ניתנים לזיהוי שנצפו עשרים וארבע שעות לאחר ההזרקה באמצעות IVI ו-RBI. יתר על כן, דגימות רשתית ועצבים נלקחו בהצלחה לניתוח רקמה היסטולוגית מלאה של העין, מה שמאפשר תצפית מקיפה על הרשתית והמערכת הנוירו-ויזואלית הרחבה יותר.

Introduction

מתן טיפולים לרשתית ולעצב הראייה הוא קשה להפליא בשל האנטומיה המורכבת של העין 1,2, במיוחד הנוכחות של מחסום הדם-רשתית (BRB)3,4,5. ה-BRB משמש להגנה על הרשתית מפני פלישה למחזור הדם המערכתי, אך מהווה יריב מאתגר לניהול טיפולי מכיוון שמחזור הדם הטיפולי המערכתי נחסם לעתים קרובות על ידי BRB 6,7. מולקולות ליפופיליות קטנות יכולות להתפזר בקלות דרך ה-BRB, אך למולקולות גדולות והידרופיליות קשה יותר להשיג גישה לרשתית6. זריקות תוך-זגוגיות (IVI) ורטרובולבר (RBI) מאפשרות העברת תרופות לרקמות העין, תוך התגברות על המגבלות שמציב ה-BRB. ה-IVI משמש כפשרה מבטיחה על ידי מתן טיפולים לסביבה הפנימית של העין 8,9. שיטה זו מחייבת את התרופה לעבור דרך הזגוגית, ובכך לעקוף את ה-BRB, ולהתפזר דרך הרשתית והכורואיד על מנת להגיע לעצב הראייה7. ה-RBI מועבר מאחורי העין לחלל הרטרובולברי10. טיפולים יכולים להינתן על ידי דיפוזיה דרך הרקמות והבלוטות בחלל הרטרובולברי, המשפיע על עצב הראייה והמבנים הסובבים אותו מבלי להיכנס ישירות לרשתית, מה ששומר על שלמות ה-BRB. על ידי מתן תרופות ישירות או בעקיפין לעין, הן זריקות תוך זגוגיות והן זריקות רטרובולבריות יכולות להשיג ריכוזים מקומיים גבוהים יותר של התרופה הטיפולית, מה שמשפר את יעילותה בהשוואה למתן מקומי או מערכתי (דרך הפה או תוך ורידי)2. זה חשוב במיוחד עבור טיפולים הדורשים פעולה מהירה או עוצמה גבוהה, כפי שניתן לראות במחלות עיניים רבות. אספקה ממוקדת גם מגבילה את החשיפה של שאר הגוף לתרופה, מה שמפחית את הסיכון להשפעות מחוץ למטרה ומסייע למזער תופעות לוואי פוטנציאליות שעלולות להתרחש כאשר תרופות ניתנות באופן מקומי, דרך הפה או דרך הווריד11.

לזריקות פרי-עיניות אחרות, כגון תת-לחמית, תת-טנון אחורי ותת-רשתית, יש יתרונות ומגבלות משלהן 2,5. זריקות סובטנון אחוריות נצפו כמספקות ריכוזי תרופות גבוהים לרקמות העין; עם זאת, הזרקת הסאבטנון קרובה יותר לסקלרל מאשר לכלי הדם האורביטליים 5,12. לעומת זאת, ה-RBI ממקם את הטיפול קרוב יותר לעצב הראייה מאשר הסובטנון האחורי או תת-הלחמית13. משמעות הדבר עשויה להיות שפתולוגיות של עצב הראייה מעדיפות טיפולים הניתנים על ידי RBI על פני סוגי הזרקה פרי-עיניים אחרים. לזריקות סובטנון אחוריות יש סיכונים נלווים, כולל פזילה, היפמה ולחץ תוך עיני מוגבר5. לחץ תוך עיני מוגבר הוא גם גורם סיכון מדווח בזריקות IVI, תת-לחמית ותת-רשתית2. סוגי הזרקה אלה דורשים לרוב מינון חוזר על מנת להשיג את האפקט הטיפולי הרצוי2. גורמי סיכון אחרים הקשורים לזריקות תת-רשתית, זריקות תת-לחמית ו-IVI כוללים היווצרות קטרקט, דימום ברשתית, היפרדות רשתית ודלקת2. זריקות IVI, תת-רשתית וזריקות תת-לחמית אלו פולשניות יותר מזריקות RBI, מכיוון שהזריקות הללו הן תוך עיניות2. ה-RBI עשוי להיחשב פחות פולשני מכיוון שהוא ממקם את הטיפול במרחב הרטרובולברי, מבלי להיכנס ישירות למחט לכדור העין. אסטרטגיות אספקה טיפוליות אחרות פחות פולשניות, כגון מתן מקומי, אינן מספקות מספיק תרופות, כאשר פחות מ-5% מהתרופה נשמרת על פני העין 2,5.

IVI היא טכניקה בולטת במודלים פרה-קליניים המשמשת ביכולתה להעביר חומרים טיפוליים ישירות לחלק האחורי של העין. IVI מעביר את התרופה ישירות להומור הזגוגי, מה שהופך אותה לטכניקת אספקה מועדפת לטיפול מקומי14. טכניקת IVI מאפשרת לטיפול לעקוף את מחסום הדם-רשתית, המהווה מכשול נפוץ לחדירת תרופות לרשתית14. IVI מציג את ההזדמנות לדלקת ולפגיעה במבני העין, ולכן יש להקפיד על ההליך14. כדי למזער היפרדות רשתית והיווצרות קטרקט, צ'יו ועמיתיו מתארים גישת IVI המדגישה החדרה והזרקה של שיפוע של 45 מעלות ברמת ה-par plana, תוך הימנעות מהעדשה, הרשתית, שריר העין וכלי הדם15. בטכניקה זו מוחדרת מחט 30 גרם לסקלרה של האף לאספקה טיפולית15. IVI עדיין קשור לסיכונים בשל אופיו הפולשני. סיכונים פוטנציאליים כוללים היפרדות רשתית, היווצרות קטרקט, אנדופתלמיטיס או דימום16. האופי הפולשני של טכניקות IVI מגביר גם את הלחץ התוך עיני, כפי שהוצג בניסוי על עיניים חזיריות שבוצע על ידי Ikjong Park et al.16. המחקר מראה שינויים בלחץ התוך עיני בשלבים שונים של החדרת מחט והזרקת נוזלים. הם מדווחים על שונות משמעותית בלחץ התוך עיני במהלך ההליך16.

RBIs שימשו בהצלחה במחקרים קודמים כאמצעי להעברה טיפולית למכרסמים. מחקר אחד כזה השווה את ההשפעות של אנלוגים שונים של פרוסטגלנדינים שניתנו באמצעות RBI17. חולדות לבקנות קיבלו RBI עם מחט 26 גרם של 0.1 מ"ל שהוחדרה דרך האזור הצדדי של הפורניקס התחתון בזוויתשל 45 מעלות 17. הפרוטוקול ששימש במחקר זה הותאם משיטה שתוארה קודם לכן בה החולדות הורדמו באמצעות הזרקה תוך-צפקית (IP) של כלורלהידראט18. מחקר אחר שנערך בחולדות השווה טיפות מקומיות לזריקות רטרובולבריות19. החולדות הורדמו באמצעות הזרקת IP של קטמין/קסילזין, וה-RBI ניתן באמצעות מחט 30 גרם19. בניגוד לשיטות ההרגעה שנדונו קודם לכן, מחקר אחד שבחן את ההשפעות של RBI על שומן אורביטלי השתמש באיזופלורן בשאיפה כדי להרגיע את החולדות לפני RBI20. בעוד שמחקרים אלה מספקים תובנה לגבי אילו חומרי הרדמה ומפרטי מחטים יכולים להצליח, המיקום והטיפול בבעלי החיים במהלך ההליך אינם נדונים.

מחקרים שונים בעכברים עורכים גם RBIs לשיטות אספקה טיפוליות. מחקר אחד השווה RBI להזרקת וריד זנב לרוחב לגרימת תסמונת נפרוטית21. מחקר שני השווה גם את אותן שתי טכניקות הזרקה במתן חומר ניגוד להדמיית לב22. העכברים הורדמו באיזופלורן בשאיפה והוזרקו בצד המדיאלי של העין22. שני המחקרים אימצו את שיטת ה-RBI שלהם מפרוטוקול שנכתב בעבר. חשוב לציין שפרוטוקול זה כינה את ההזרקה שלהם רטרו-אורביטלית, אך תיאר את מיקום ההזרקה כחלל הרטרובולברי מאחורי העין. מחברי פרוטוקול זה השתמשו באיזופלורן באינהלציה כשיטת הרגעה מועדפת, וציינו את זמן ההפעלה וההתאוששות המהיר של העכברים23. עבור RBI, העין בלטה חלקית מהשקע על ידי הפעלת לחץ על העור סביב העין23. לאחר מכן, המחט הוכנסה לצד המשופע של הקנתוס המדיאלי כלפי מטה בזווית של 30 מעלות והוחדרה עד שהגיעה לבסיס העין23. יש לנקוט בזהירות בעת הפעלת לחץ על החיה, שכן עלולה להתרחש חסימה מקרית של זרימת הדם או קריסת קנה הנשימה23. המזרק גם עיוור לקצה המחט בעת ההחדרה, ולכן פגיעה בעין היא סיכון נלווה. 23 פגיעה בעין בעת מתן טיפולי היא סיכון קריטי בניסוי זה, שכן גרימת פציעה נוספת מערערת ישירות את תוצאות המחקר. כמו כן, יש לציין כי טכניקת המיקום והטיפול שתוארה קודם לכן בוצעה על עכברים ולא כללה הערות על תחולה על חולדות.

ישנם אופנים רבים בהם נעשה ניסיון להסרת עצב הראייה והרשתית. שיטה אחת כזו חקרה את הסרת עצבי הראייה והעיניים בגוש, תוך שמירה על כיאזמה אופטית שלמה24. שיטה זו היא הדומה ביותר למחקר הנוכחי מכיוון שהעיניים הבודדות ועצבי הראייה נשמרים גם להסרת גוש; עם זאת, הכיאזמה האופטית מופרדת. לנקוט משנה זהירות בהליך זה תהיה חשיבות עליונה בשל מורכבות ההליך. בשיטה הנוכחית אנו מתחילים את הדיסקציה דרך גולגולת הזנב ועובדים בצורה רוסטרלית על מנת לספק גישה באופן שמצמצם את הנזק לעצבי הראייה ומאפשר לעצב כולו להישאר שלם. יתר על כן, שמירה על העצב שלם ומחובר לעין היא קריטית לתהליך ההטמעה, שכן נזק לכל חלק בעצב יכול להתאים לתצפית פתולוגית אחרת24. חשוב לקחת בחשבון את הכיוון של עצב הראייה מכיוון שהאופן שבו הוא מוטבע מאפשר חתכים שונים, מה שעשוי להיות חשוב לניתוח היסטולוגי.

מכשיר בהתאמה אישית המכונה שולחן ניתוח עיניים במעבדה לבעלי חיים קטנים (SALOOT, פלטפורמה לניתוחי עיניים) מורכב מסדרה של חומרים מודפסים בתלת מימד כדי לספק הרדמה ולהחזיק את בעל החיים במצב יציב לזריקות טיפוליות לעיניים. עיצוב SALOOT מאפשר יציבות של מבני הראש והעיניים להליכים עיניים, מה שמשפר את המהירות והשחזור של הפעולות תוך מתן הרדמה בגז וניקוי חלקיקי נשיפה. ה-SALOOT הוא בלוק מודפס תלת מימדי הכולל הפחתה קעורה כדי להחזיק את גוף החולדה עם אזור צר יותר בחזית כדי להחזיק את ראש החיה לתוך חרוט אף עם כניסת איזופלורן. מתחת לחרוט האף נמצא מאגר קטן ומוצא פליטה. השיטות הבאות פותחו לאספקה טיפולית של העין ולשליפת רקמות עיניים מדויקות; הם תוכננו לחקר רקמות לאחר טראומה עינית, ולכן חיוני לתאר את השפעות הטראומה, ההזרקה, הטיפול והדיסקציה כדי למנוע פרשנות מבולבלת של הממצאים.

מאמר זה מציג שתי שיטות הזרקה טיפוליות לעיניים, הזריקות התוך-זגוגיות והזריקות הרטרובולבריות, לשימוש בחולדות בוגרות. בנוסף, מוצגת שיטת אחזור רקמות להסרת גוש של עצב הראייה והרשתית השלמים מחולדה בוגרת. טכניקות אלו מאפשרות לחקור את ההשפעות העיניים והעיניים של פתולוגיה וטיפול מושרים.

Protocol

כל הניסויים נערכו בהתאם להצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אוהיו. חולדות זכר Sprague Dawley במשקל ~200 גרם ובסביבות גיל חודשיים שימשו למחקר זה25. פרטי הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. הזרקה תוך זגוגית (IVI)

  1. חבר את האיזופלורן ומובילי הפסולת ליציאות החיבור של SALOOT. להרדים את בעל החיים באמצעות הליכי איזופלורן סטנדרטיים בהתאם להצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה ופרוטוקול IACUC מאושר.
    הערה: לחלופין, אם בעל החיים כבר היה תחת הרדמה מבדיקת עיניים אחרת (כלומר, תערובת קטמין/קסילזין; 90 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10 מ"ג/ק"ג קסילזין), העבירו את בעל החיים לפלטפורמת ניתוח העיניים וטיטראט הרדמה עם איזופלורן (יחס 3 חמצן: 3 איזופלורן) כדי להבטיח שמירה על עומק הרדמה נאות.
  2. הנח את פלטפורמת ניתוח העיניים עם החיה המורדמת תחת מיקרוסקופ הפעלה חי. העריכו את עומק ההרדמה באמצעות רפלקס נסיגת דוושה.
  3. יש להניח טיפה אחת או שתיים של תמיסת עיניים 0.5% טטרקאין הידרוכלוריד לתוך העין או העיניים המנותחות. יש למרוח משחת עיניים מקומית סיכה כגון היפרומלוז 0.3% על העין הנגדית אם אין לבצע מניפולציה.
    1. לאחר מכן, השתמשו בטיפה אחת עד שתיים של 5% פובידון-יוד על פני העין, ובעזרת צמר גפן מרחו פובידון-יוד על העור המקיף את העין.
  4. השתמש במזרק של 10 מיקרוליטר עם מחט של 33 גרם עם קצה בסגנון 4 באורך של 10 מ"מ וזווית של 15 מעלות ושרטט 0.9% נתרן כלורי בקטריוסטטי. יש לשטוף את המזרק והמחט במי המלח לפני שטובלים את המחט במעקר חרוזים חם.
    1. הניחו לו להתקרר לפני שתמשיכו. לאחר שהמחט התקררה, ערכו את התרופה המעניינת לכמות הרצויה (4 מיקרוליטר).
      הערה: למחקרי הוכחת רעיון, נעשה שימוש בדיו קעקוע לא מדולל ובצבע הכחול של אוון בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS). האבקה הכחולה של אוון עורבבה עם PBS עד שהיא אטומה. למחקרי הוכחת היתכנות טיפוליים, נעשה שימוש בריכוזים הבאים: איבודילסט במינון 1 מ"ג/מ"ל, חומצה טאורוסודאוקסיכולית (TUDCA) במינון 5 מ"ג/מ"ל, הזרקת ציקלוספורין, 250 מ"ג/מ"ל ואנקינרה: 100 מ"ג/0.67 מ"ל. אבקות טיפוליות דוללו במי מלח בקטריוסטטיים של 0.9%.
  5. בעזרת מלקחיים עיניים עדינים עם שיניים, אחוז בעדינות ברקמת הסקלר בלימבוס כדי להתייצב. תהיה טבעת אדומה קלושה סביב הקשתית. השתמש בטבעת זו כציון דרך, הכנס את המחט, הצד המשופע כלפי מטה והזריק אותה לעין האחורית.
    הערה: הקפד לכוון את המחט לכיוון הרשתית והכנס את המחט רק 2/3 מהדרך (איור 1). ודא שהמחט לא מגרדת את העדשה, מכיוון שהדבר יוביל להיווצרות קטרקט.
  6. לאחר הזרקת התרופה הטיפולית, הסר לאט את המחט. עצמו את העין והחזיקו לחץ למשך 10-15 שניות לפחות לפני שטיפה במי מלח.
  7. יש להפסיק את השימוש באיזופלורן ולהוציא אותו ממשטח ניתוחי העיניים. הניחו טיפת היפרומלוז 0.3% בכל עין ולאחר מכן הניחו לבעל החיים להתאושש על כרית חימום.

2. הזרקת רטרובולבר (RBI)

  1. חבר את האיזופלורן ומובילי הפסולת ליציאות החיבור של SALOOT. להרדים את בעל החיים באמצעות הליכי איזופלורן סטנדרטיים.
    הערה: לחלופין, אם בעל החיים כבר היה תחת הרדמה מבדיקת עיניים אחרת (כלומר, תערובת קטמין/קסילזין; 90 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10 מ"ג/ק"ג קסילזין), העבירו את בעל החיים לפלטפורמת ניתוח העיניים וטיטראט הרדמה עם איזופלורן (יחס 3 חמצן: 3 איזופלורן) כדי להבטיח שמירה על עומק הרדמה נאות.
  2. הנח את פלטפורמת ניתוח העיניים עם החיה המורדמת תחת מיקרוסקופ הפעלה חי. העריכו את עומק ההרדמה באמצעות רפלקס נסיגת דוושה.
  3. יש להניח טיפה אחת או שתיים של תמיסת עיניים 0.5% טטרקאין הידרוכלוריד לתוך העין או העיניים המנותחות. מרחו משחת עיניים מקומית סיכה (היפרומלוז 0.3%) על העין הנגדית אם אין לבצע מניפולציה.
    1. לאחר מכן, השתמשו בטיפה אחת עד שתיים של 5% פובידון-יוד על פני העין ובעזרת חנית עיניים, מרחו פובידון-יוד על העור המקיף את העין.
  4. השג מזרק אינסולין 0.5 מ"ל עם מחט 28 גרם. ערכו את הטיפול המעניין לכמות הרצויה (100 מיקרוליטר).
    הערה: למחקרי הוכחת רעיון, נעשה שימוש בדיו קעקוע לא מדולל ובצבע הכחול של אוון בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS). האבקה הכחולה של אוון עורבבה עם PBS עד שהיא אטומה. למחקרי הוכחת היתכנות טיפוליים, נעשה שימוש בריכוזים הבאים: איבודילסט ב-10 מ"ג/מ"ל, TUDCA ב-50 מ"ג/מ"ל, הזרקת ציקלוספורין ב-250 מ"ג/מ"ל ואנקינרה ב-100 מ"ג/0.67 מ"ל. אבקות טיפוליות דוללו במי מלח בקטריוסטטיים של 0.9%.
  5. בעזרת מלקחיים עדינים לעיניים עם השיניים, אחוז בעדינות בעפעף התחתון כדי לייצב. הכנס את המחט, עם הצד המשופע כלפי מטה, בזווית באמצע הדרך בין השעה 6 ל-7 לאורך שפת המסלול התחתונה עד שמורגש החלק האחורי של שקע העין. משכו מעט את המחט לאחור ואז הזריקו לאט את התרופה (איור 2).
  6. הסר בעדינות ולאט את המחט. לאחר מכן, עצמו את העין והחזיקו לחץ למשך 10-15 שניות לפחות לפני שטיפה במי מלח.
  7. יש להפסיק את השימוש באיזופלורן ולהוציא אותו ממשטח ניתוחי העיניים. הניחו טיפת היפרומלוז 0.3% בכל עין ולאחר מכן הניחו לבעל החיים להתאושש על כרית חימום.

3. דיסקציה של בידוד רקמות עיניים

  1. לאחר שהחיה הורדמה באמצעות חנקCO2 או כפי שצוין אחרת בפרוטוקול IACUC מאושר, הנח את החיה בשכיבה על עצם החזה. השתמש בחתך עור רוחבי מעל הצוואר הגבי, המשתרע עד לגובה אפרכסת האוזן.
  2. נתח את שרירי הגב כדי לחשוף את המפרק האטלנטו-עורפי. השתמשו במספריים של מיונז כדי לחתוך דרך המפרק האטלנטו-עורפי, ולהפריד את הראש מהגוף (איור 3). בעזרת דיסקציה קהה, הסר בעדינות את העור מהגולגולת הגבית מגובה האף ועד הצוואר הגבי, והשאיר את העור סביב שתי העיניים שלם.
  3. הכנס זוג המוסטטים ישרים בינוניים או דרייברים של מחט לתוך הפורמן מגנום בבסיס הגולגולת. השתמשו בהמוסטטים כדי לפרוץ בעדינות את הגולגולת הצדדית המשתרעת מהנקב מגנום ועד לאזור הטמפורלי משני הצדדים (איור 3).
    1. כאשר מסירים את החלק העליון של הגולגולת, שמרו על ההמוסטטים מקבילים לצד הגבי של המוח. זה יבטיח שהמוח יישאר שלם ולא ייפגע בתהליך הסרת העצם.
  4. בעזרת מרית שטוחה, החזירו בעדינות את המוח בצורה רוסטרלית כדי לחשוף את עצבי הראייה. יש לנקוט בזהירות כדי שהמתח ממשקל המוח לא יופעל על עצבי הראייה.
  5. כשהעצבים חשופים, קחו זוג מספריים בינוניים ובצעו חתך קטן על פני הכיאזמה האופטית, תוך ניתוק שני העצבים מהמוח. בשלב זה, ניתן להשליך את המוח או למקם אותו בפרפורמלדהיד ב-PBS (4% PFA) למשך 24 שעות ב-4 מעלות צלזיוס לצורך הערכה היסטולוגית.
  6. בעזרת זוג מספריים קטנים לקשתית וזוג מיקרו מלקחיים עיניים משוננים, הסר בזהירות את הרקמה העודפת (כלומר, עפעפיים, רקמת חיבור וכו') מסביב לעין. לאחר השלמתו, העין צריכה להיות ממוקמת בארובת העין, אך רק השריר והבלוטות החוץ-עיניים עדיין קיימים.
  7. בעזרת ההמוסטטים בשילוב עם מספרי הקשתית הקטנים, חותכים את מסלול העין, תוך הקפדה רבה לא לחתוך את עצב הראייה כשהוא עובר בתעלת האופטיקה. שברו בזהירות את העצם בחלק האחורי של שקע העין בעזרת ההמוסטטים, ולשליטה מדויקת יותר, השתמשו במספריים הקטנים לדיסקציה.
  8. לאחר הסרת העצם, יש לחתוך בעדינות סביב מסלול העין בעזרת מספריים ומלקחיים עדינים כדי להסיר את כריות השומן, הבלוטות והשרירים החוץ-עיניים. הקפד לשמור על עצבי הראייה במהלך תהליך זה.
  9. העין אמורה להיות מסוגלת להשתקף בעדינות בזנב לכיוון החלק הפנימי של הגולגולת. בשלב זה, השתמש במספריים קטנים ובמלקחיים עדינים כדי להסיר את רקמת החיבור המקיפה את העצב ברכס הגולגולת התחתון.
  10. לאחר הסרת רקמה זו, יש להרים את העין ועצב הראייה המלא מהגולגולת. חזור על שלבים אלה עבור העין והעצב הנגדיים.
  11. יתר על כן, נקה את עצב הראייה והעין מרקמות עודפות כגון מעטפת הדוראל. אם אין צורך לשמר רקמות לצורך ניתוח היסטולוגי, יש להקפיא בזק באמצעות קרח יבש או חנקן נוזלי לפני האחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  12. עבור ספקטרומטריית מסה, יש לבודד את הרשתית מהאזור הפנימי של כדור הארץ, ולבודד את עצב הראייה. הפרד את עצב הראייה מהגלובוס בנקודה החיצונית הקרובה ביותר. הנח את העצב בצינור קריו על קרח לפני העברתו ל-80 מעלות צלזיוס.
    1. הנח את כדור העין על צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ ניתוח. השתמש בזוג מלקחיים מעוקלים כדי להחזיק את העין יציבה לפני ביצוע חתך בלימבוס עם זוג מספריים קטנים.
    2. הרחב את החיתוך כך שיקיף את כל היקף הגלובוס. יש לחצות את הגלובוס, ולהשליך את החלק הקדמי.
    3. הניחו את הצד הפנימי של החלק האחורי כלפי מעלה, ובעזרת פינצטה עדינה הסירו את הרקמה הדקה בצבע קרם. זה עשוי להיראות כאילו הוא נדבק לדיסק האופטי. אם זה קורה, השתמש במספריים כדי לחתוך את הרשתית מהדיסק.
      הערה: לאחר מכן ניתן להניח את רקמת הרשתית בצינור קריו על קרח לפני העברתה ל-80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן ניתן להעביר רקמות למתקן ספקטרומטריית המסה להערכה.
  13. לצביעה אימונוהיסטולוגית באמצעות זלוף חלקי, הנח את העין השלמה על צלחת פטרי. השתמש בזוג מלקחיים מעוקלים כדי להחזיק את העין יציבה לפני נטילת מזרק אינסולין עם מחט 28 גרם והחדרתו ללימבוס, כשהמחט בזווית לכיוון הרשתית. חזור על שלב זה בשתי נקודות נוספות לאורך הלימבוס. ניקוב הגלובוס מסייע להבטיח זלוף נאות ומסייע בקיבוע מתאים.
    הערה: יש לקבע את הגלובוס ב-4% PFA למשך 40 דקות לפחות לפני המעבר לשייקר ולהתערבב במהירות נמוכה למשך 20 דקות נוספות כדי להקל על תנועת הנוזלים.
  14. לאחר השלמת שלב הקיבוע, הסר את ה-PFA והחלף אותו ב-PBS. יש להניח את הבקבוקונים על ניעור עדין למשך 15 דקות, ולאחר מכן לחזור על שלב זה לשטיפה נוספת של 15 דקות.
  15. לאחר מחזור השטיפה הסופי של PBS, שאפו את ה-PBS והחליפו אותו בתמיסת סוכרוז 30% ב-PBS, ולאחר מכן הכניסו למקרר למשך 24 שעות. לאחר שלב הדגירה של הסוכרוז, יש להטמיע רקמה ב-OCT להערכה היסטולוגית26.

תוצאות

ניסויי פיילוט ראשוניים בוצעו על חיות גופות באמצעות צבע הזרקה (צבע כחול אוונס) ודיו קעקוע (איור 2B) כדי לייעל את המיקום והגודל של המחט הן עבור RBI והן עבור IVI. דיו הקעקועים לא היה מדולל, ואז אבקת אוונס בלו עורבבה ב-PBS עד שהנוזל הפך אטום. הגענו למסקנה שה-RBI האידיאל?...

Discussion

האתגרים המורכבים הקשורים במתן טיפולים לרשתית ולעצב הראייה, בעיקר בשל המחסום האטום שמציב BRB, מדגישים את חשיבות המחקר 3,4. החקירה של טכניקות IVI ו-RBI לא רק מדגישה גישות חדשניות להתגברות על מכשולים אלה, אלא גם מדגישה את ההשלכות הרחבות יותר על טיפ?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים כלשהם שיכולים להתפרש כניגוד אינטרסים פוטנציאלי.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי פרסי תוכנית המחקר של משרד ההגנה האמריקני W81XWH-15-1-0074 ו-W81XWH-22-1-0989. הדעות או הטענות הכלולות במסמך זה הן דעותיהם הפרטיות של המחברים ואין לפרש אותן כרשמיות או כמשקפות את העמדות של משרד הצבא או משרד ההגנה. מענק מחקר זה נתמך בחלקו על ידי פרס מלגת הסטודנטים לחוקרים צעירים של Prevent Blindness באוהיו לחוקרות בחקר הראייה. אנו אסירי תודה על תמיכתה של קרן רוס. השירותים בוצעו בתוכנית הליבה למחקר מדעי הראייה של OSU תחת P30EY032857. ברצוננו להודות למעבדה ולמשאבי בעלי חיים של אוניברסיטת אוהיו סטייט (ULAR). בנוסף, ברצוננו להודות לחברי המעבדה לתואר ראשון של ריילי מישל מוסקו, אמה לאלי, סם דאקוורת' ואיב הווארד. ברצוננו להודות גם לבונגסו קים על תרומתם לעיצוב SALOOT, כמו גם לאליזבת אורבנסקי וריאן ווב. איור 1, איור 2A ואיור 3 נוצרו עם BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anakinra 100 mg/0.67 mL SobiNDC: 66658-0234-07
Antipamezole hydrochloride (Antisedan) 5.0 mg/mLZoetisNADA #141-033 | 107204-8
Bacteriostatic sodium chloride (0.9%)Hospira Inc.NDC: 0409-1966-02
CryotubeVWR76417-258 https://us.vwr.com/store/product?keyword=76417-258
Curved forceps Fischer Scientific 08-953F
cyclosporine injection 250 mg/mL PerrigoNDC: 00574-0866-10
cyclosporine topical, 0.05% (Restasis) AbbVie (Vizient)NDC: 00023-9163-30
Cyotube CapThermo Scientific3471BLKhttps://www.fishersci.com/shop/products/screw-cap-microcentrifuge-tube-caps/14755237?searchHijack=true&searchTerm=
screw-cap-microcentrifuge-tube-caps&searchType=Rapid&
matchedCatNo=14755237
Evans Blue Sigma-AldrichE2129-10G
Eye SpearsFischer Scientific NC0972725https://www.fishersci.com/shop/products/ultracell-pva-eye-spears-100-p/NC0972725
Fine forceps Fischer Scientific 08-953Ehttps://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-dissecting-jewelers-microforceps-2/08953E?gclid=Cj0KCQiAkJO8BhCGARIsAM
kswyiER9Kanmi3ZMgoXTr82Zg3
g44m1Q6WLftkYfb36hC7pbkwR
hVAy3MaAqkLEALw_wcB&ef_id
=Cj0KCQiAkJO8BhCGARIsAMks
wyiER9Kanmi3ZMgoXTr82Zg3g4
4m1Q6WLftkYfb36hC7pbkwRhV
Ay3MaAqkLEALw_wcB:G:s&ppc
_id=PLA_goog_2086145680_81
843405274_08953E__38624700
1354_6556597232892883360&
ev_chn=shop&s_kwcid=AL!4428
!3!386247001354!!!g!827721591
040!&gad_source=1
Fine ophthalmic forceps with teeth Fisher Scientific50-253-8287https://www.fishersci.com/shop/products/bonn-suturing-forceps-7-5-cm/502538287
Flat spatula Fischer Scientific 14-375-100https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-spoonula-lab-spoon/1437510#?keyword=
Hot bead Sterilizer Fine Science Tools18000-45https://www.finescience.com/en-US/Products/Instrument-Care-Accessories/Sterilization/Hot-Bead-Sterilizers
Hypromellose 0.3% (GenTeal Tears Severe Dry Eye Gel) Alcon Laboratories Inc.https://www.amazon.com/GenTeal-Tears-Lubricant-Ointment-Night-Time/dp/B01IN5G1L0/ref=sr_1_4?dib=eyJ2IjoiMSJ9.DxYpqjIIBNO
TVuPo7jln5xeGazA_YFg0cbt3
kCyC-0ouZARw5qIHYvCM7vB
R_vO30OWUEXDZhQmQfLQ9
ySld4mujpzrWjxbsEXLBs5JPhjZ
eUPgPY0sHoJA46f9EYULdxiTu
BQy5fVA2OB20RV09mbdW8hX
6j8-bXIYTZljPGMo5_GMq9jnJo8
3iR35c1THxEiEH2FsvSx7VXup-
QK9uCkWwAYrw2v3tyLUCq2JT
APPF34nsYqGnSASMgOARU_
2lVz-kIy-QUEYHGOoIimIWwBY
htz33RkFrq7YjtnC2uDbImNiudG
zWJv-uUhmJngYjbBGbeWE0VX
7CGPkEokUZrCQ8AI2HeXjSMph
gPhMbK88RcHJ63AyH0TiBtS2k1
Xceh-CD26_prJSNxF6Mv5-jgGf9
iLmXvVtKkkSwc-5uYLk7gZHaFC
Yj73F_imbmeHYr.4vfu7h4m4Jlfy-
qiqmgeAnDHlJTGYV22HJ2w_xD
ir0k&dib_tag=se&keywords=Gent
eal+gel&qid=1736793609&sr=8-4
ibudilast Millipore SigmaI0157-10MG
insulin syringe 0.5 mL with a 28 gauge Micro-Fine IV NeedleBecton, Dickinson and Company (BD)14-826-79
Isoflurane CovetrusNDC: 11695-6777-2
Ketamine CovetrusNDC: 11695-0703-1
Long Evans RatCharles River Laboratories International, Inc.https://www.criver.com/products-services/find-model/long-evans-rat?region=3611
Mayo Scissors Electron Microscopy Sciences72968-03
Medium microscissors Amazonhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z168866#product-documentation
Medium straight hemostats or needle drivers Sigma-AldrichZ168866-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z168866#product-documentation
Needle 33 G with a style 4 tip at a length of 10 mm and angle of 15 degrees Hamilton7803-05
paraformaldehyde 4 in phosphate-buffered saline (PBS) (4% PFA) Thermo Fischer J61899.AK
Petri dish Millipore SigmaP5606-400EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5606?utm_source=google&utm_medium=
cpc&utm_campaign=8674694095
&utm_content=105162454052&
gad_source=1&gclid=Cj0KCQiA
kJO8BhCGARIsAMkswygXXfgY
ABr7EfLtf4tvuLS0E8A4SxX4XM
NJQDaI80Yi4FO-iahCsPcaAp9E
EALw_wcB
phosphate-buffered saline (PBS)Sigma-AldrichP3813-10PAKhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p3813
Povidone-Iodine (Betadine) 5% Alcon Laboratories Inc.NDC: 0065-0411-30
Shaker Model 3500 VWR89032-092
Small iris scissors Sigma-AldrichZ265977-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z265977&
small microscissors Fisher Scientific17-456-004https://www.fishersci.com/shop/products/self-opening-scissors-2/17456004?keyword=true
Sprague Dawley RatCharles River Laboratories International, Inc.SAS 400https://emodels.criver.com/product/400
Sucrose Millipore Sigma57-50-1https://www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/sucrose3423057501
syringe 10 µL (Model 701 RN)Hamilton80330
Tattoo Ink (Intenze Tattoo Ink True Black 1 oz)Amazonhttps://www.amazon.com/Intenze-Tattoo-Ink-True-Black/dp/B01GW747L2
tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) Milipore Sigma580549-1GM
Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%Bausch & Lomb Inc.NDC: 68682-920-64
Xylazine (Rompun) 100 mg/mLDechraNADA #047-956 |

References

  1. Nguyen, D. D., Lai, J. -. Y. Advancing the stimuli response of polymer-based drug delivery systems for ocular disease treatment. Polym Chem. 11 (44), 6988-7008 (2020).
  2. Tsai, C. -. H., et al. Ocular drug delivery: Role of degradable polymeric nanocarriers for ophthalmic application. Int J Mol Sci. 19 (9), ijms19092830 (2018).
  3. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules (Basel, Switzerland). 24 (8), 24081583 (2019).
  4. Ryan, A. K., Rich, W., Reilly, M. A. Oxidative stress in the brain and retina after traumatic injury. Front Neurosci. 17, 1021152 (2023).
  5. De Matteis, V., Rizzello, L. Noble metals and soft bio-inspired nanoparticles in retinal diseases treatment: A perspective. Cells. 9 (3), 679 (2020).
  6. O'Leary, F., Campbell, M. The blood-retina barrier in health and disease. FEBS J. 290 (4), 878-891 (2023).
  7. del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Prog Retin Eye Res. 57, 134-185 (2017).
  8. Nguyen, D. D., Luo, L. -. J., Yang, C. -. J., Lai, J. -. Y. Highly retina-permeating and long-acting resveratrol/metformin nanotherapeutics for enhanced treatment of macular degeneration. ACS Nano. 17 (1), 168-183 (2023).
  9. Luo, L. -. J., et al. Targeting nanocomposites with anti-oxidative/inflammatory/angiogenic activities for synergistically alleviating macular degeneration. App Mat Today. 24, 101156 (2021).
  10. Naik, S., et al. Small interfering RNAs (siRNAs) based gene silencing strategies for the treatment of glaucoma: Recent advancements and future perspectives. Life Sci. 264, 118712 (2021).
  11. Luo, L. -. J., Nguyen, D. D., Lai, J. -. Y. Dually functional hollow ceria nanoparticle platform for intraocular drug delivery: A push beyond the limits of static and dynamic ocular barriers toward glaucoma therapy. Biomat. 243, 119961 (2020).
  12. Ghate, D., Brooks, W., McCarey, B. E., Edelhauser, H. F. Pharmacokinetics of intraocular drug delivery by periocular injections using ocular fluorophotometry. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (5), 2230-2237 (2007).
  13. Soni, V., Pandey, V., Tiwari, R., Asati, S., Tekade, R. K. Chapter 13 - Design and evaluation of ophthalmic delivery formulations. Basic Fund Drug Deliv. , 473-538 (2019).
  14. Varela-Fernández, R., et al. Drug delivery to the posterior segment of the eye: Biopharmaceutic and pharmacokinetic considerations. Pharmaceutics. 12 (3), 313 (2020).
  15. Chiu, K., Chang, R. C. -. C., So, K. -. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), e313 (2007).
  16. Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes. PLOS One. 16 (8), e0256344 (2021).
  17. Cosan, S., et al. Effect of retrobulbar prostaglandin analog injection on orbital fat in rats. Int Ophthal. 43 (12), 4985-4990 (2023).
  18. Levy, Y., Kremer, I., Shavit, S., Korczyn, A. D. The pupillary effects of retrobulbar injection of botulinum toxin A (oculinum) in albino rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (1), 122-125 (1991).
  19. Jbara, D., Eiger-Moscovich, M., Didkovsky, E., Keshet, Y., Avisar, I. In vivo effects of prostaglandin analogs application by topical drops or retrobulbar injections on the orbital fat of a rat model. Ocular Imm Inflamm. 31, 1-6 (2022).
  20. Eftekhari, K., et al. Histologic evidence of orbital inflammation from retrobulbar alcohol and chlorpromazine injection: A clinicopathologic study in human and rat orbits. Ophthal Plastic and Reconstr Surg. 32 (4), 302-304 (2016).
  21. Bohnert, B. N., et al. Retrobulbar sinus injection of doxorubicin is more efficient than lateral tail vein injection at inducing experimental nephrotic syndrome in mice: A pilot study. Lab Animals. 53 (6), 564-576 (2019).
  22. Socher, M., Kuntz, J., Sawall, S., Bartling, S., Kachelrieß, M. The retrobulbar sinus is superior to the lateral tail vein for the injection of contrast media in small animal cardiac imaging. Lab Animals. 48 (2), 105-113 (2014).
  23. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals. 40 (5), 155-160 (2011).
  24. Pozyuchenko, K., et al. Investigating animal models of optic neuropathy: An accurate method for optic nerve and chiasm dissection in mice. J Neurosci Methods. 331, 108527 (2020).
  25. Sengupta, P. The laboratory rat: Relating its age with human's. Int J Prevent Med. 4 (6), 624-630 (2013).
  26. Ryan, A. K., et al. Torsion-Induced Traumatic Optic Neuropathy (TITON): A physiologically relevant animal model of traumatic optic neuropathy. PLOS One. 20 (1), e0312220 (2025).
  27. Bora, K., et al. Assessment of Inner blood-retinal barrier: Animal models and methods. Cells. 12 (20), 2443 (2023).
  28. Vinores, S. A. Breakdown of the blood-retinal barrier. Encyc Eye. , 216-222 (2010).
  29. Heisler-Taylor, T., et al. Multimodal imaging and functional analysis of the chick NMDA retinal damage model. PLOS One. 16 (9), e0257148 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved