Somministrazione terapeutica oculare e recupero avanzato dei tessuti nei ratti adulti

Riepilogo

Questo studio presenta una metodologia per la somministrazione di terapie nella retina e nei nervi ottici del ratto adulto. Inoltre, viene introdotto un metodo unico di recupero dei tessuti per una raccolta in blocco top-down del nervo ottico e della retina in un ratto adulto.

Abstract

La somministrazione terapeutica al segmento posteriore dell'occhio, compresa la retina e il nervo ottico, è complicata dalla presenza di barriere emato-encefaliche e emato-retiniche. Piccoli modelli animali, come i ratti, sono utilizzati per lo studio di varie patologie oculari. Sebbene la somministrazione terapeutica all'occhio posteriore sia impegnativa, raggiungerla è essenziale per il trattamento dei disturbi oculari, molti dei quali richiedono la convalida in piccoli modelli animali per la rilevanza traslazionale. Pertanto, vengono presentate due tecniche di somministrazione terapeutica posteriore: l'iniezione intravitreale (IVI) e l'iniezione retrobulbare (RBI) per l'uso nei ratti adulti. Inoltre, viene introdotto un metodo per la rimozione in blocco degli occhi e dei nervi ottici per varie tecniche di analisi istologica e molecolare. Il protocollo di dissezione consente l'osservazione completa del sistema neuro-visivo, riducendo al minimo le lesioni post-mortem ai tessuti retinici e dei nervi ottici. La somministrazione terapeutica della ciclosporina terapeutica alla retina e al nervo ottico è stata raggiunta, con concentrazioni rilevabili osservate ventiquattro ore dopo l'iniezione utilizzando sia IVI che RBI. Inoltre, sono stati estratti con successo campioni di retina e nervosi in blocco per l'analisi istologica completa del tessuto oculare, facilitando l'osservazione completa della retina e del sistema neurovisivo in generale.

Introduzione

La somministrazione di terapie alla retina e al nervo ottico è incredibilmente difficile a causa della complessa anatomia dell'occhio ^1,2, in particolare della presenza della barriera emato-retinica (BRB)^3,4,5. Il BRB serve a proteggere la retina dall'invasione della circolazione sistemica, ma è un avversario impegnativo per la somministrazione terapeutica poiché la circolazione terapeutica sistemica è spesso bloccata dal BRB ^6,7. Piccole molecole lipofile possono facilmente diffondersi attraverso il BRB, ma le molecole più grandi e idrofile hanno più difficoltà ad accedere alla retina⁶. Le iniezioni intravitreali (IVI) e retrobulbari (RBI) consentono la somministrazione di farmaci ai tessuti oculari, superando le limitazioni imposte dal BRB. L'IVI rappresenta un compromesso promettente somministrando terapie nell'ambiente interno dell'occhio ^8,9. Questo metodo richiede che il farmaco attraversi il vitreo, bypassando così il BRB, e diffondendosi attraverso la retina e la coroide per raggiungere il nervo ottico⁷. L'RBI viene erogato dietro l'occhio nello spazio retrobulbare¹⁰. Le terapie possono essere somministrate per diffusione attraverso i tessuti e le ghiandole nello spazio retrobulbare, interessando il nervo ottico e le strutture circostanti senza entrare direttamente nella retina, che mantiene l'integrità del BRB. Somministrando farmaci direttamente o indirettamente nell'occhio, sia le iniezioni intravitreali che quelle retrobulbari possono raggiungere concentrazioni locali più elevate del farmaco terapeutico, il che ne migliora l'efficacia rispetto alla somministrazione topica o sistemica (orale o endovenosa)². Ciò è particolarmente importante per i trattamenti che richiedono un'azione rapida o un'elevata potenza, come si vede in molte malattie oculari. La somministrazione mirata limita anche l'esposizione del resto del corpo al farmaco, il che riduce il rischio di effetti fuori bersaglio e aiuta a ridurre al minimo i potenziali effetti avversi che possono verificarsi quando i farmaci vengono somministrati per via topica, orale o endovenosa¹¹.

Altre iniezioni perioculari, come quelle sottocongiuntivali, subtenali posteriori e sottoretiniche, hanno i loro benefici e limiti ^2,5. È stato osservato che le iniezioni posteriori di sottotenone forniscono alte concentrazioni di farmaco ai tessuti oculari; Tuttavia, l'iniezione subtenone è più vicina alla sclerale rispetto alla vasscularatura orbitale ^5,12. Al contrario, l'RBI posiziona il terapeutico più vicino al nervo ottico rispetto al sottotenone posteriore o al sottocongiuntivale¹³. Ciò può significare che le patologie del nervo ottico favoriscono le terapie somministrate da RBI rispetto ad altri tipi di iniezione perioculare. Le iniezioni posteriori di sottotenone hanno rischi associati, tra cui strabismo, ifemo e pressione intraoculare elevata⁵. L'elevata pressione intraoculare è anche un fattore di rischio segnalato nelle iniezioni IVI, sottocongiuntivali e sottoretiniche². Questi tipi di iniezione spesso richiedono un dosaggio ripetuto per ottenere l'effetto terapeutico desiderato². Altri fattori di rischio associati alle iniezioni sottoretiniche, alle iniezioni sottocongiuntivali e all'IVI includono la formazione di cataratta, l'emorragia retinica, il distacco di retina e l'infiammazione². Queste IVI, iniezioni sottoretiniche e iniezioni sottocongiuntivali sono più invasive delle iniezioni RBI, poiché queste iniezioni sono intraoculari². L'RBI può essere considerato meno invasivo in quanto colloca la terapia nello spazio retrobulbare, senza inserire direttamente l'ago nel globo dell'occhio. Altre strategie di somministrazione terapeutica meno invasive, come la somministrazione topica, non sono in grado di fornire un farmaco sufficiente, con meno del 5% del farmaco trattenuto sulla superficie oculare ^2,5.

L'IVI è una tecnica importante nei modelli preclinici che viene utilizzata per la sua capacità di somministrare agenti terapeutici direttamente nel segmento posteriore dell'occhio. L'IVI somministra il farmaco direttamente all'umor vitreo, rendendolo una tecnica di somministrazione preferita per il trattamento localizzato¹⁴. La tecnica IVI consente al terapeutico di aggirare la barriera emato-retinica, che è un ostacolo comune alla penetrazione del farmaco nella retina¹⁴. L'IVI introduce l'opportunità di infiammazione e danno alle strutture oculari, quindi è necessario impiegare un'aderenza meticolosa alla procedura¹⁴. Per ridurre al minimo il distacco della retina e la formazione di cataratta, Chiu et al. descrivono un approccio IVI che enfatizza l'inserimento e l'iniezione di uno smusso di 45 gradi a livello della par plana, evitando il cristallino, la retina, il muscolo oculare e i vasi¹⁵. In questa tecnica, un ago da 30 G viene inserito nella sclera nasale per la somministrazione terapeutica¹⁵. L'IVI è ancora associato a rischi a causa della sua natura invasiva. I potenziali rischi includono il distacco della retina, la formazione di cataratta, l'endoftalmite o l'emorragia¹⁶. La natura invasiva delle tecniche IVI aumenta anche la pressione intraoculare, come dimostrato in un esperimento sugli occhi suini eseguito da Ikjong Park et ^al.16. Lo studio mostra cambiamenti nella pressione intraoculare durante le diverse fasi dell'inserimento dell'ago e dell'iniezione di fluidi. Essi riportano variazioni sostanziali della pressione intraoculare durante la procedura¹⁶.

Gli RBI sono stati utilizzati con successo in studi precedenti come mezzo di somministrazione terapeutica ai roditori. Uno di questi studi ha confrontato gli effetti di vari analoghi delle prostaglandine somministrati tramite RBI¹⁷. Ai ratti albini è stato somministrato un RBI con un ago da 26 G di iniettato da 0,1 mL inserito attraverso l'area laterale del fornice inferiore con un angolo di 45 gradi¹⁷. Il protocollo utilizzato in questo studio è stato adattato da un metodo precedentemente descritto in cui i ratti sono stati anestetizzati tramite iniezione intraperitoneale (IP) di cloralidrato¹⁸. Un altro studio condotto sui ratti ha confrontato le gocce topiche con le iniezioni retrobulbari¹⁹. I ratti sono stati anestetizzati tramite un'iniezione IP di ketamina/xilazina e l'RBI è stato somministrato tramite un ago da 30 G¹⁹. In contrasto con i metodi di sedazione precedentemente discussi, uno studio che osservava gli effetti dell'RBI sul grasso orbitale ha utilizzato l'isoflurano per inalazione per sedare i ratti prima dell'RBI²⁰. Sebbene questi studi forniscano informazioni su quali anestetici e specifiche dell'ago potrebbero avere successo, il posizionamento e la manipolazione degli animali durante la procedura non vengono discussi.

Vari studi sui topi conducono anche RBI per metodi di somministrazione terapeutica. Uno studio ha confrontato l'RBI con l'iniezione laterale della vena caudale per indurre con successo la sindrome nefrosica²¹. Un secondo studio ha anche confrontato le stesse due tecniche di iniezione nella somministrazione di mezzi di contrasto per l'imaging cardiaco²². I topi sono stati anestetizzati con isoflurano per inalazione e iniettati nella parte mediale dell'occhio²². Entrambi gli studi hanno adattato il loro metodo RBI da un protocollo precedentemente scritto. È importante notare che questo protocollo ha chiamato la loro iniezione come retro-orbitale, ma ha descritto la posizione dell'iniezione come lo spazio retrobulbare dietro l'occhio. Gli autori di questo protocollo hanno utilizzato l'isoflurano per via inalatoria come metodo di sedazione preferito, notando la rapida attivazione e il tempo di recupero dei topi²³. Per un RBI, l'occhio è stato parzialmente sporgente dall'orbita applicando pressione sulla pelle intorno all'occhio²³. Quindi, l'ago è stato introdotto dal canto mediale con il lato smussato rivolto verso il basso con un angolo di 30 gradi ed è stato inserito fino a raggiungere la base dell'occhio²³. È necessario prestare attenzione quando si applica pressione all'animale, poiché può verificarsi un blocco accidentale del flusso sanguigno o un collasso tracheale²³. L'iniettore è anche cieco alla punta dell'ago al momento dell'inserimento e, pertanto, danneggiare l'occhio è un rischio associato. ²³ Danneggiare l'occhio durante la somministrazione terapeutica è un rischio critico in questo esperimento, poiché causare ulteriori lesioni mina direttamente i risultati dello studio. Va inoltre notato che la tecnica di posizionamento e manipolazione precedentemente descritta è stata condotta su topi e non includeva commenti sull'applicabilità ai ratti.

Ci sono molti modi in cui è stata tentata la rimozione del nervo ottico e della retina. Uno di questi metodi ha esplorato la rimozione dei nervi ottici e degli occhi in blocco, preservando un chiasma ottico intatto²⁴. Questo metodo è il più paragonabile allo studio attuale in quanto anche i singoli occhi e nervi ottici sono preservati per la rimozione in blocco; Tuttavia, il chiasma ottico è separato. Esercitare cautela in questa procedura sarebbe della massima importanza a causa della complessità della procedura. Nel metodo attuale, iniziamo la dissezione attraverso il cranio caudale e lavoriamo rostralmente per fornire l'accesso in modo da limitare i danni ai nervi ottici e consentire all'intero nervo di rimanere intatto. Inoltre, mantenere il nervo intatto e attaccato all'occhio è fondamentale per il processo di inclusione, poiché il danno a ciascuna parte del nervo può corrispondere a una diversa osservazione patologica²⁴. L'orientamento del nervo ottico è importante da considerare in quanto il modo in cui è incorporato consente diverse sezioni trasversali, che possono essere importanti per l'analisi istologica.

Un dispositivo su misura noto come tavolo operatorio oftalmico da laboratorio per piccoli animali (SALOOT, una piattaforma di chirurgia oftalmica) è composto da una serie di materiali stampati in 3D per fornire l'anestesia e mantenere l'animale in una posizione stabile per le iniezioni terapeutiche oculari. Il design SALOOT consente la stabilità della testa e delle strutture oculari per le procedure oftalmiche, migliorando la velocità e la riproducibilità delle operazioni, consentendo al contempo l'erogazione di anestesia gassosa e l'evacuazione del particolato di espirazione. Il SALOOT è un blocco stampato tridimensionale caratterizzato da una riduzione concava per sostenere il corpo del ratto con una regione più stretta nella parte anteriore per tenere la testa dell'animale in un cono nasale con un ingresso di isoflurano. Sotto il cono anteriore c'è un piccolo serbatoio e un'uscita di scarico. I seguenti metodi sono stati sviluppati per la somministrazione oculare terapeutica e il recupero preciso del tessuto oculare; Sono stati progettati per studiare i tessuti dopo un trauma oculare, quindi è fondamentale delineare gli effetti del trauma, dell'iniezione, del trattamento e della dissezione per evitare un'interpretazione confusa dei risultati.

Questo articolo presenta due metodi di iniezione terapeutica oculare, l'iniezione intravitreale e retrobulbare, per l'uso in ratti adulti. Inoltre, viene presentato un metodo di recupero dei tessuti per la rimozione in blocco del nervo ottico intatto e della retina da un ratto adulto. Queste tecniche consentono lo studio degli effetti oculari e peri-oculari della patologia indotta e del trattamento.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva e approvati dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Ohio State University. Per questo studio sono stati utilizzati ratti maschi Sprague Dawley del peso di ~ 200 g e di circa 2 mesi di età²⁵. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Iniezione intravitreale (IVI)

1. Collegare l'isoflurano e i cavi di scarto alle porte di attacco SALOOT. Anestetizzare l'animale utilizzando le procedure standard di isoflurano seguendo la dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva e il protocollo IACUC approvato.
   NOTA: In alternativa, se l'animale era già sotto anestesia da un'altra sessione di test oftalmici (ad esempio, miscela ketamina/xilazina; 90 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina), trasferire l'animale sulla piattaforma di chirurgia oftalmica e titolare l'anestesia con isoflurano (rapporto 3 ossigeno: 3 isoflurano) per garantire il mantenimento di un'adeguata profondità di anestesia.
2. Posizionare la piattaforma di chirurgia oftalmica con l'animale anestetizzato sotto un microscopio operatorio dal vivo. Valutare la profondità dell'anestetico tramite il riflesso di ritiro del pedale.
3. Mettere una o due gocce di soluzione oftalmica di tetracaina cloridrato allo 0,5% nell'occhio o negli occhi da operare. Applicare un unguento oftalmico topico lubrificante come l'ipromellosa 0,3% sull'occhio controlaterale se non deve essere eseguita alcuna manipolazione.
   1. Quindi, utilizzare una o due gocce di iodio povidone al 5% sulla superficie oculare e, utilizzando un batuffolo di cotone, applicare lo iodio povidone sulla pelle che circonda l'occhio.
4. Utilizzare una siringa da 10 μl con un ago da 33 G con una punta stilo 4 a una lunghezza di 10 mm e un angolo di 15 gradi e aspirare cloruro di sodio batteriostatico allo 0,9%. Sciacquare la siringa e l'ago con la soluzione fisiologica prima di immergere l'ago in uno sterilizzatore a microsfere caldo.
   1. Lasciar raffreddare prima di procedere. Dopo che l'ago si è raffreddato, aspirare la terapia di interesse alla quantità desiderata (4 μL).
      NOTA: Per gli studi di prova del concetto, sono stati utilizzati inchiostro per tatuaggi non diluito e colorante Evan's Blue in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). La polvere blu di Evan è stata mescolata con PBS fino a quando non è opaca. Per gli studi terapeutici proof of concept, sono state utilizzate le seguenti concentrazioni: ibudilast a 1 mg/mL, acido tauroursodesossicolico (TUDCA) 5 mg/mL, ciclosporina iniettabile, 250 mg/mL e anakinra 100 mg/0,67 mL. Le polveri terapeutiche sono state diluite in soluzione salina batteriostatica allo 0,9%.
5. Usando una pinza oftalmica sottile con i denti, afferrare delicatamente il tessuto sclerale al limbus per stabilizzarlo. Ci sarà un debole anello rosso attorno all'iride. Usa questo anello come punto di riferimento, inserisci l'ago, smussandolo con il lato rivolto verso il basso e iniettalo nell'occhio posteriore.
   NOTA: Assicurarsi di inclinare l'ago verso la retina e inserire l'ago solo a 2/3 (Figura 1). Assicurarsi che l'ago non graffi la lente, poiché ciò porterà alla formazione di cataratta.
6. Dopo che la terapia è stata iniettata, rimuovere lentamente l'ago. Chiudere l'occhio e mantenere la pressione per almeno 10-15 s prima di sciacquare con soluzione fisiologica.
7. Interrompere l'uso dell'isoflurano nell'animale e rimuoverlo dalla piattaforma di chirurgia oftalmica. Metti una goccia di ipromellosa allo 0,3% in ciascun occhio e poi lascia che l'animale si riprenda su un termoforo.

2. Iniezione retrobulbare (RBI)

1. Collegare l'isoflurano e i cavi di scarto alle porte di attacco SALOOT. Anestetizzare l'animale utilizzando le procedure standard di isoflurano.
   NOTA: In alternativa, se l'animale era già sotto anestesia da un'altra sessione di test oftalmici (ad esempio, miscela ketamina/xilazina; 90 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina), trasferire l'animale sulla piattaforma di chirurgia oftalmica e titolare l'anestesia con isoflurano (rapporto 3 ossigeno: 3 isoflurano) per garantire il mantenimento di un'adeguata profondità di anestesia.
2. Posizionare la piattaforma di chirurgia oftalmica con l'animale anestetizzato sotto un microscopio operatorio dal vivo. Valutare la profondità dell'anestetico tramite il riflesso di ritiro del pedale.
3. Mettere una o due gocce di soluzione oftalmica di tetracaina cloridrato allo 0,5% nell'occhio o negli occhi da operare. Applicare unguento oftalmico topico lubrificante (ipromellosa 0,3%) sull'occhio controlaterale se non è necessario eseguire alcuna manipolazione.
   1. Quindi, utilizzare una o due gocce di iodio povidone al 5% sulla superficie oculare e, utilizzando una lancia per occhi, applicare lo iodio povidone sulla pelle che circonda l'occhio.
4. Procurarsi una siringa da insulina da 0,5 ml con un ago da 28 G. Elaborare il terapeutico di interesse alla quantità desiderata (100 μL).
   NOTA: Per gli studi di prova del concetto, sono stati utilizzati inchiostro per tatuaggi non diluito e colorante Evan's Blue in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). La polvere blu di Evan è stata mescolata con PBS fino a quando non è opaca. Per gli studi terapeutici proof of concept, sono state utilizzate le seguenti concentrazioni: ibudilast a 10 mg/mL, TUDCA a 50 mg/mL, ciclosporina iniettabile a 250 mg/mL e anakinra a 100 mg/0,67 mL. Le polveri terapeutiche sono state diluite in soluzione salina batteriostatica allo 0,9%.
5. Usando una pinza oftalmica sottile con i denti, afferrare delicatamente la palpebra inferiore per stabilizzarla. Inserire l'ago, con il lato smussato rivolto verso il basso, con un angolo a metà tra le ore 6 e le ore 7 lungo il bordo orbitale inferiore fino a quando non si avverte la parte posteriore dell'alveolo oculare. Tirare leggermente indietro l'ago e poi iniettare lentamente la terapia (Figura 2).
6. Rimuovere delicatamente e lentamente l'ago. Quindi, chiudere l'occhio e mantenere la pressione per almeno 10-15 s prima di sciacquare con soluzione fisiologica.
7. Interrompere l'uso dell'isoflurano nell'animale e rimuoverlo dalla piattaforma di chirurgia oftalmica. Metti una goccia di ipromellosa allo 0,3% in ciascun occhio e poi lascia che l'animale si riprenda su un termoforo.

3. Dissezione con isolamento del tessuto oculare

1. Dopo che l'animale è stato soppresso per asfissia da CO₂ o come altrimenti indicato nel protocollo IACUC approvato, porre l'animale in decubito sternale. Utilizzare un'incisione cutanea trasversale sul collo dorsale, che si estende fino al livello del padiglione auricolare.
2. Sezionare la muscolatura dorsale per esporre l'articolazione atlanto-occipitale. Usa le forbici per maionese per incidere l'articolazione atlanto-occipitale, separando la testa dal corpo (Figura 3). Utilizzando la dissezione smussata, rimuovere delicatamente la pelle dal cranio dorsale dal livello del naso al collo dorsale, lasciando intatta la pelle intorno a entrambi gli occhi.
3. Inserire un paio di emostatici medi-dritti o trascinatori d'ago nel forame magno alla base del cranio. Utilizzare gli emostatici per sfondare delicatamente il cranio laterale che si estende dal forame magno alla regione temporale su entrambi i lati (Figura 3).
   1. Quando si rimuove la parte superiore del cranio, mantenere gli emostatici paralleli al lato dorsale del cervello. Ciò garantirà che il cervello rimanga intatto e non venga intaccato nel processo di rimozione dell'osso.
4. Usando una spatola piatta, rifletti delicatamente il cervello rostralmente per esporre i nervi ottici. Bisogna fare attenzione affinché la tensione del peso del cervello non venga applicata ai nervi ottici.
5. Con i nervi esposti, prendi un paio di microforbici medie e fai una piccola incisione attraverso il chiasma ottico, recidendo entrambi i nervi dal cervello. A questo punto, il cervello può essere scartato o posto in paraformaldeide in PBS (4% PFA) per 24 ore a 4 °C per la valutazione istologica.
6. Usando un paio di piccole forbici per l'iride e un paio di micro pinze oftalmiche dentate, rimuovi con cura il tessuto in eccesso (cioè palpebre, tessuto connettivo, ecc.) intorno all'occhio. Una volta completato, l'occhio dovrebbe essere situato nell'orbita oculare ma con solo il muscolo extraoculare e le ghiandole ancora presenti.
7. Utilizzando gli emostatici in combinazione con le piccole forbici dell'iride, tagliare l'orbita oculare, facendo molta attenzione a non tagliare il nervo ottico mentre passa attraverso il canale ottico. Staccare con cautela l'osso nella parte posteriore dell'alveolo oculare con gli emostatici e, per un controllo più preciso, utilizzare le piccole forbici da dissezione.
8. Dopo che l'osso è stato rimosso, tagliare delicatamente intorno all'orbita oculare con un paio di microforbici e una pinza fine per rimuovere i cuscinetti adiposi, le ghiandole e i muscoli extraoculari. Assicurati di prestare attenzione ai nervi ottici durante questo processo.
9. L'occhio dovrebbe poter essere riflesso delicatamente caudalmente verso l'interno del cranio. A questo punto, usa piccole microforbici e pinze fini per rimuovere il tessuto connettivo che circonda il nervo sulla cresta cranica inferiore.
10. Una volta che questo tessuto è stato rimosso, l'occhio e l'intero nervo ottico dovrebbero poter essere sollevati dal cranio in blocco. Ripeti questi passaggi per l'occhio e il nervo controlaterale.
11. Inoltre, pulire il nervo ottico e l'occhio dal tessuto in eccesso come la guaina durale. Se non è necessario conservare i tessuti per l'analisi istologica, eseguire il congelamento rapido con ghiaccio secco o azoto liquido prima di essere conservati a -80 °C.
12. Per la spettrometria di massa, la retina deve essere isolata dalla regione interna del globo e il nervo ottico deve essere isolato. Separare il nervo ottico dal globo nel punto esterno più vicino. Posizionare il nervo in una crioprovetta su ghiaccio prima di essere trasferito a -80 °C.
    1. Posizionare il globo oculare su una capsula di Petri al microscopio operatorio. Usa un paio di pinze curve per tenere fermo l'occhio prima di praticare un'incisione al limbus con un paio di piccole microforbici.
    2. Estendere il taglio fino a comprendere l'intera circonferenza del globo. Il globo deve essere diviso in due e la parte anteriore può essere scartata.
    3. Posiziona la sezione posteriore con l'interno rivolto verso l'alto e, utilizzando un paio di pinzette oftalmiche sottili, rimuovi il sottile tessuto color crema. Potrebbe sembrare che si attacchi al disco ottico. In tal caso, utilizzare le microforbici per tagliare la retina dal disco.
       NOTA: Il tessuto retinico può quindi essere posizionato in una crioprovetta su ghiaccio prima di essere trasferito a -80 °C. I tessuti possono quindi essere trasferiti all'impianto di spettrometria di massa per la valutazione.
13. Per la colorazione immunoistologica mediante perfusione parziale, posizionare l'occhio intatto su una capsula di Petri. Utilizzare un paio di pinze curve per tenere fermo l'occhio prima di prendere una siringa da insulina con un ago da 28 G e inserirla nel limbus, con l'ago angolato verso la retina. Ripeti questo passaggio in altri due punti lungo il limbus. La puntura del globo aiuta a garantire un'adeguata perfusione e aiuta a fissare in modo appropriato.
    NOTA: Il globo deve essere fissato in PFA al 4% per almeno 40 minuti prima di passare a un agitatore e agitare a bassa velocità per altri 20 minuti per facilitare il movimento del fluido.
14. Una volta completata la fase di fissaggio, rimuovere il PFA e sostituirlo con PBS. Posizionare le fiale su un leggero agitare per 15 minuti, quindi ripetere questo passaggio per un secondo risciacquo PBS di 15 minuti.
15. Dopo l'ultimo ciclo di risciacquo PBS, aspirare il PBS e sostituirlo con una soluzione di saccarosio al 30% in PBS, quindi conservare in frigorifero per 24 ore. Dopo la fase di incubazione del saccarosio, incorporare il tessuto nell'OCT per la valutazione istologica²⁶.

Risultati

Gli esperimenti pilota preliminari sono stati eseguiti su animali cadaveri utilizzando colorante per iniezione (colorante Evans Blue) e inchiostro per tatuaggi (Figura 2B) per ottimizzare il posizionamento e le dimensioni dell'ago sia per RBI che per IVI. L'inchiostro del tatuaggio non era diluito, quindi la polvere di Evans Blue veniva mescolata in PBS fino a quando il fluido non diventava opaco. Abbiamo concluso che l'RBI ideale prevedeva un ago da 28 G in...

Discussione

Le intricate sfide associate alla somministrazione di terapie alla retina e al nervo ottico, principalmente a causa della barriera impermeabile posta dal BRB, sottolineano l'importanza di questo studio ^3,4. L'esplorazione delle tecniche IVI e RBI non solo evidenzia approcci innovativi per superare questi ostacoli, ma sottolinea anche le implicazioni più ampie per la cura oculare e lo sviluppo terapeutico. Questi risultati dimost...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anakinra 100 mg/0.67 mL	Sobi	NDC: 66658-0234-07
Antipamezole hydrochloride (Antisedan) 5.0 mg/mL	Zoetis	NADA #141-033 | 107204-8
Bacteriostatic sodium chloride (0.9%)	Hospira Inc.	NDC: 0409-1966-02
Cryotube	VWR	76417-258	https://us.vwr.com/store/product?keyword=76417-258
Curved forceps	Fischer Scientific	08-953F
cyclosporine injection 250 mg/mL	Perrigo	NDC: 00574-0866-10
cyclosporine topical, 0.05% (Restasis)	AbbVie (Vizient)	NDC: 00023-9163-30
Cyotube Cap	Thermo Scientific	3471BLK	https://www.fishersci.com/shop/products/screw-cap-microcentrifuge-tube-caps/14755237?searchHijack=true&searchTerm= screw-cap-microcentrifuge-tube-caps&searchType=Rapid& matchedCatNo=14755237
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129-10G
Eye Spears	Fischer Scientific	NC0972725	https://www.fishersci.com/shop/products/ultracell-pva-eye-spears-100-p/NC0972725
Fine forceps	Fischer Scientific	08-953E	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-dissecting-jewelers-microforceps-2/08953E?gclid=Cj0KCQiAkJO8BhCGARIsAM kswyiER9Kanmi3ZMgoXTr82Zg3 g44m1Q6WLftkYfb36hC7pbkwR hVAy3MaAqkLEALw_wcB&ef_id =Cj0KCQiAkJO8BhCGARIsAMks wyiER9Kanmi3ZMgoXTr82Zg3g4 4m1Q6WLftkYfb36hC7pbkwRhV Ay3MaAqkLEALw_wcB:G:s&ppc _id=PLA_goog_2086145680_81 843405274_08953E__38624700 1354_6556597232892883360& ev_chn=shop&s_kwcid=AL!4428 !3!386247001354!!!g!827721591 040!&gad_source=1
Fine ophthalmic forceps with teeth	Fisher Scientific	50-253-8287	https://www.fishersci.com/shop/products/bonn-suturing-forceps-7-5-cm/502538287
Flat spatula	Fischer Scientific	14-375-100	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-spoonula-lab-spoon/1437510#?keyword=
Hot bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	https://www.finescience.com/en-US/Products/Instrument-Care-Accessories/Sterilization/Hot-Bead-Sterilizers
Hypromellose 0.3% (GenTeal Tears Severe Dry Eye Gel)	Alcon Laboratories Inc.		https://www.amazon.com/GenTeal-Tears-Lubricant-Ointment-Night-Time/dp/B01IN5G1L0/ref=sr_1_4?dib=eyJ2IjoiMSJ9.DxYpqjIIBNO TVuPo7jln5xeGazA_YFg0cbt3 kCyC-0ouZARw5qIHYvCM7vB R_vO30OWUEXDZhQmQfLQ9 ySld4mujpzrWjxbsEXLBs5JPhjZ eUPgPY0sHoJA46f9EYULdxiTu BQy5fVA2OB20RV09mbdW8hX 6j8-bXIYTZljPGMo5_GMq9jnJo8 3iR35c1THxEiEH2FsvSx7VXup- QK9uCkWwAYrw2v3tyLUCq2JT APPF34nsYqGnSASMgOARU_ 2lVz-kIy-QUEYHGOoIimIWwBY htz33RkFrq7YjtnC2uDbImNiudG zWJv-uUhmJngYjbBGbeWE0VX 7CGPkEokUZrCQ8AI2HeXjSMph gPhMbK88RcHJ63AyH0TiBtS2k1 Xceh-CD26_prJSNxF6Mv5-jgGf9 iLmXvVtKkkSwc-5uYLk7gZHaFC Yj73F_imbmeHYr.4vfu7h4m4Jlfy- qiqmgeAnDHlJTGYV22HJ2w_xD ir0k&dib_tag=se&keywords=Gent eal+gel&qid=1736793609&sr=8-4
ibudilast	Millipore Sigma	I0157-10MG
insulin syringe 0.5 mL with a 28 gauge Micro-Fine IV Needle	Becton, Dickinson and Company (BD)	14-826-79
Isoflurane	Covetrus	NDC: 11695-6777-2
Ketamine	Covetrus	NDC: 11695-0703-1
Long Evans Rat	Charles River Laboratories International, Inc.		https://www.criver.com/products-services/find-model/long-evans-rat?region=3611
Mayo Scissors	Electron Microscopy Sciences	72968-03
Medium microscissors	Amazon		https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z168866#product-documentation
Medium straight hemostats or needle drivers	Sigma-Aldrich	Z168866-1EA	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z168866#product-documentation
Needle 33 G with a style 4 tip at a length of 10 mm and angle of 15 degrees	Hamilton	7803-05
paraformaldehyde 4 in phosphate-buffered saline (PBS) (4% PFA)	Thermo Fischer	J61899.AK
Petri dish	Millipore Sigma	P5606-400EA	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5606?utm_source=google&utm_medium= cpc&utm_campaign=8674694095 &utm_content=105162454052& gad_source=1&gclid=Cj0KCQiA kJO8BhCGARIsAMkswygXXfgY ABr7EfLtf4tvuLS0E8A4SxX4XM NJQDaI80Yi4FO-iahCsPcaAp9E EALw_wcB
phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813-10PAK	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p3813
Povidone-Iodine (Betadine) 5%	Alcon Laboratories Inc.	NDC: 0065-0411-30
Shaker Model 3500	VWR	89032-092
Small iris scissors	Sigma-Aldrich	Z265977-1EA	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z265977&
small microscissors	Fisher Scientific	17-456-004	https://www.fishersci.com/shop/products/self-opening-scissors-2/17456004?keyword=true
Sprague Dawley Rat	Charles River Laboratories International, Inc.	SAS 400	https://emodels.criver.com/product/400
Sucrose	Millipore Sigma	57-50-1	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/sucrose3423057501
syringe 10 µL (Model 701 RN)	Hamilton	80330
Tattoo Ink (Intenze Tattoo Ink True Black 1 oz)	Amazon		https://www.amazon.com/Intenze-Tattoo-Ink-True-Black/dp/B01GW747L2
tauroursodeoxycholic acid (TUDCA)	Milipore Sigma	580549-1GM
Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%	Bausch & Lomb Inc.	NDC: 68682-920-64
Xylazine (Rompun) 100 mg/mL	Dechra	NADA #047-956 |