성체 쥐의 안구 치료 전달 및 고급 조직 회수(Ocular Therapeutic Delivery and Advanced Tissue Retrieval in adult rats)

요약

이 연구는 성체 쥐의 망막과 시신경에 치료제를 전달하는 방법론을 제시합니다. 또한, 성체 쥐의 시신경과 망막을 하향식으로 일괄적으로 수집하기 위해 독특한 조직 회수 방법이 도입되었습니다.

초록

망막과 시신경을 포함한 눈의 후부에 대한 치료 전달은 혈액-뇌 및 혈액-망막 장벽의 존재로 인해 복잡합니다. 쥐와 같은 작은 동물 모델은 다양한 안구 병리를 연구하는 데 활용됩니다. 후안으로의 치료적 전달은 까다롭지만, 이를 달성하는 것은 안구 질환을 치료하는 데 필수적이며, 그 중 많은 부분이 중개 관련성을 위해 소동물 모델에서 검증을 필요로 합니다. 따라서 성체 쥐에 사용하기 위한 유리체강내 주사(IVI)와 후궁 주사(RBI)의 두 가지 후방 치료 전달 기술이 제시됩니다. 또한, 눈과 시신경을 일괄적으로 제거하는 방법이 다양한 조직학 및 분자 분석 기술을 위해 도입되었습니다. 해부 프로토콜은 신경 시각 시스템을 완전히 관찰하는 동시에 망막 및 시신경 조직의 사후 손상을 최소화합니다. 치료용 사이클로스포린이 망막과 시신경에 성공적으로 전달되었으며, IVI와 RBI를 모두 사용하여 주사 후 24시간 후에 검출 가능한 농도가 관찰되었습니다. 또한, 전체 눈 조직학적 조직 분석을 위해 망막 및 신경 샘플을 성공적으로 추출하여 망막과 더 넓은 신경-시각 시스템에 대한 포괄적인 관찰을 용이하게 했습니다.

서문

눈의 복잡한 해부학적 구조 ^1,2, 특히 혈액-망막 장벽(BRB)^3,4,5의 존재로 인해 망막과 시신경에 치료제를 전달하는 것은 매우 어렵습니다. BRB는 전신 순환의 침입으로부터 망막을 보호하는 역할을 하지만, 전신 치료 순환이 BRB ^6,7에 의해 차단되는 경우가 많기 때문에 치료 투여에 대한 도전적인 반대자입니다. 작은 친유성 분자는 BRB를 통해 쉽게 확산될 수 있지만, 더 크고 친수성 분자는 망막에 접근하기가 더 어렵습니다⁶. 유리체강내(IVI) 및 후강근(RBI) 주사는 BRB에 의해 부과된 한계를 극복하여 안구 조직에 약물을 전달할 수 있습니다. IVI는 눈의 내부 환경에 치료제를 투여함으로써 유망한 절충안을 제시한다 ^8,9. 이 방법은 약물이 유리체를 통과하여 BRB를 우회하고 시신경(⁷)에 도달하기 위해 망막과 맥락막을 통해 확산되어야 합니다. RBI는 눈 뒤에서 retrobulbar 공간¹⁰으로 전달됩니다. 치료제는 후구(retrobulbar space)의 조직과 땀샘을 통한 확산에 의해 전달될 수 있으며, 망막에 직접 들어가지 않고도 시신경 및 주변 구조에 영향을 미쳐 BRB의 무결성을 유지할 수 있습니다. 유리체강내 및 후궁 주사 모두 약물을 직접 또는 간접적으로 눈에 전달함으로써 치료 약물의 국소 농도를 높일 수 있으며, 이는 국소 또는 전신 투여(경구 또는 정맥 주사)에 비해 효과를 향상시킵니다². 이는 많은 안구 질환에서 볼 수 있듯이 빠른 작용이나 높은 효능이 필요한 치료에 특히 중요합니다. 표적 투여는 또한 신체의 나머지 부분이 약물에 노출되는 것을 제한하여 표적을 벗어난 효과의 위험을 줄이고 약물을 국소, 경구 또는 정맥 투여할 때 발생할 수 있는 잠재적인 부작용을 최소화하는 데 도움이 됩니다¹¹.

결막하주사(subconjunctival), 후방시테논(posterior subtenon), 망막하주사(subretinal)와 같은 다른 안구 주사법은 나름의 장점과 한계가 있다 ^2,5. 후방 서브테논 주사는 높은 약물 농도를 안구 조직에 전달하는 것으로 관찰되었습니다. 그러나, 장부 주사는 안와 정관(orbital vasscularture)보다 공막(scleral)에 더 가깝습니다 ^5,12. 이와는 대조적으로, RBI는 치료제를 후결막(posterior subtenon) 또는 결막하(subconjunctival¹³)보다 시신경에 더 가깝게 배치한다. 이는 시신경 병리학이 다른 안구 주사 유형보다 RBI 전달 치료제를 선호한다는 것을 의미할 수 있습니다. 후장부 주사는 사시, 하이프마, 안압 상승 등의 위험이 있다⁵. 안압 상승은 IVI, 결막하 주사, 망막하 주사에서도 보고된 위험 인자이다². 이러한 주사 유형은 원하는 치료 효과를 얻기 위해 반복적인 투여가 필요한 경우가 많습니다². 망막하 주사, 결막하 주사, IVI와 관련된 다른 위험 요인으로는 백내장 형성, 망막 출혈, 망막 박리, 염증 등이 있다². 이러한 IVI, 망막하 주사 및 결막하 주사는 안구^{내 2}차 주사이기 때문에 RBI 주사보다 더 침습적입니다. RBI는 바늘을 눈구에 직접 넣지 않고 치료제를 후구(retrobulbar) 공간에 배치하기 때문에 덜 침습적인 것으로 간주될 수 있습니다. 국소 투여와 같은 다른 덜 침습적인 치료 전달 전략은 충분한 약물 전달에 미치지 못하며, 안^{구 표면에 유지}되는 약물의 5% 미만이 ^2,5.

IVI는 전임상 모델에서 두드러진 기법으로, 치료제를 안구 후부에 직접 전달하는 능력으로 인해 사용됩니다. IVI는 이 약물을 유리체액에 직접 전달하기 때문에 국소 치료에 선호되는 전달 기법이다¹⁴. IVI 기법은 약물이 망막으로 침투하는 것을 막는 흔한 장애물인 혈액-망막 장벽을 우회할 수 있도록 한다¹⁴. IVI는 염증과 안구 손상의 가능성을 유발하므로 절차를 꼼꼼하게 준수해야 한다¹⁴. 망막 박리와 백내장 형성을 최소화하기 위해, Chiu 등은 수정체, 망막, 안구 근육 및 혈관을 피하면서 평면 평면에서 45도 경사 삽입 및 주입을 강조하는 IVI 접근법을 설명한다¹⁵. 이 기술에서는 30G 바늘을 비강 공막에 삽입하여 치료 전달을 수행합니다¹⁵. IVI는 침습적 특성으로 인해 여전히 위험과 관련이 있습니다. 잠재적 위험으로는 망막 박리, 백내장 형성, 안구내염 또는 출혈 등이 있다¹⁶. IVI 기법의 침습적 특성은 또한 안압을 증가시키는데, 이는 박익종 등이 수행한 돼지 눈 실험에서 볼 수 있다.¹⁶. 이 연구는 바늘 삽입과 수액 주입의 여러 단계에서 안압의 변화를 보여줍니다. 그들은 시술 중 안압에 상당한 변화가 있다고 보고했다¹⁶.

RBI는 이전 연구에서 설치류에 대한 치료 전달 수단으로 성공적으로 활용되었습니다. 그러한 연구 중 하나는 RBI¹⁷을 통해 제공된 다양한 프로스타글란딘 유사체의 효과를 비교했습니다. 알비노 쥐는 45도 각도로 하포닉스의 측면 영역을 통해 삽입된 0.1mL 주사액의 26G 바늘로 RBI를 투여했습니다¹⁷. 이 연구에 사용된 프로토콜은 클로랄하이드레이트의 복강내(IP) 주사를 통해 쥐를 마취시키는 이전에 설명된 방법을 채택했습니다¹⁸. 쥐를 대상으로 한 또 다른 연구에서는 국소 점안액과 후궁 주사를 비교했다¹⁹. 쥐는 케타민/자일라진의 IP 주사를 통해 마취되었고, RBI는 30G 바늘을 통해 투여되었다¹⁹. 앞서 논의된 진정 방법과는 대조적으로, RBI가 안와 지방에 미치는 영향을 관찰한 한 연구에서는 RBI²⁰ 이전에 쥐를 진정시키기 위해 흡입 이소플루란을 사용했다. 이러한 연구는 어떤 마취제와 바늘 사양이 성공할 수 있는지에 대한 통찰력을 제공하지만, 시술 중 동물의 위치 및 취급에 대해서는 논의되지 않습니다.

생쥐를 대상으로 한 다양한 연구에서도 치료 전달 방법에 대한 RBI를 수행합니다. 1건의 연구에서는 RBI를 신증후군을 성공적으로 유발하기 위해 RBI와 외측 꼬리 정맥 주사를 비교했다²¹. 두 번째 연구에서는 심장 영상 촬영을 위한 조영제 투여에서 동일한 두 가지 주입 기법을 비교했다²². 마우스는 흡입용 이소플루란으로 마취하고 눈의 내측에 주사하였다²². 두 연구 모두 이전에 작성된 프로토콜에서 RBI 방법을 조정했습니다. 이 프로토콜은 주사를 retro-orbital로 명명했지만 주입 위치를 눈 뒤의 retrobulbar 공간으로 설명했다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜의 저자는 흡입 이소플루란을 선호되는 진정 방법으로 사용했으며, 마우스의 빠른 활성화 및 회복 시간에 주목했습니다²³. RBI의 경우, 눈 주위 피부에 압력을 가하여 눈이 소켓에서 부분적으로 돌출되었습니다²³. 그런 다음, 바늘을 내측 안각 베벨 쪽에서 30도 각도로 아래로 향하게 삽입하고 눈의 기저부에 도달할 때까지 삽입하였다(²³). 동물에게 압력을 가할 때는 우발적인 혈류 차단이나 기관 붕괴가 발생할 수 있으므로 주의해야 한다²³. 또한 인젝터는 삽입 시 바늘 끝을 볼 수 없으므로 눈을 손상시킬 수 있습니다. ²³ 치료 투여 시 눈을 손상시키는 것은 이 실험에서 치명적인 위험인데, 추가적인 손상을 일으키는 것은 연구 결과를 직접적으로 훼손하기 때문이다. 또한, 앞서 설명한 포지셔닝 및 핸들링 기술은 마우스에서 수행되었으며 랫드에 대한 적용 가능성에 대한 언급을 포함하지 않았다는 점에 유의해야 합니다.

시신경과 망막을 제거하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 그러한 방법 중 하나는 시신경과 눈을 일괄적으로 제거하여 온전한 시신경을 보존하는 방법을 탐구했습니다²⁴. 이 방법은 개별 눈과 시신경도 일괄적으로 제거하기 위해 보존된다는 점에서 현재 연구와 가장 유사합니다. 그러나 시신경은 분리되어 있습니다. 이 절차에서는 절차가 복잡하기 때문에 주의를 기울이는 것이 가장 중요합니다. 현재 방법에서는 꼬리 두개골을 통해 해부를 시작하고 시신경 손상을 제한하고 전체 신경이 손상되지 않은 상태로 유지될 수 있는 방식으로 접근을 제공하기 위해 주둥이로 작업합니다. 더욱이, 신경을 온전하게 유지하고 눈에 부착하는 것은 신경의 각 부분에 대한 손상이 다른 병리학적 관찰에 해당할 수 있기 때문에 포매 과정에 매우 중요하다²⁴. 시신경의 방향은 시신경이 삽입되는 방식이 다양한 단면을 허용하기 때문에 고려하는 것이 중요하며, 이는 조직학적 분석에 중요할 수 있습니다.

소동물 실험실 안과 수술대(SALOOT, 안과 수술 플랫폼)로 알려진 맞춤형 장치는 일련의 3D 프린팅 재료로 구성되어 마취를 제공하고 안구 치료 주사를 위해 동물을 안정적인 자세로 고정합니다. SALOOT 설계는 안과 시술을 위한 머리와 안구 구조의 안정성을 허용하여 수술의 속도와 재현성을 향상시키는 동시에 가스 마취 전달 및 호기 미립자 청소를 가능하게 합니다. SALOOT는 이소플루란 주입구가 있는 콧방울 안에 동물의 머리를 고정하기 위해 앞쪽에 더 좁은 영역이 있는 쥐 몸체를 고정하는 오목한 축소 기능을 특징으로 하는 3차원 인쇄 블록입니다. 노즈 콘 아래에는 작은 저장소와 배기 배출구가 있습니다. 치료적 안구 전달 및 정확한 안구 조직 회수를 위해 다음과 같은 방법이 개발되었습니다. 그들은 안구 외상 후 조직을 연구하기 위해 설계되었으므로 외상, 주사, 치료 및 해부의 효과를 설명하여 결과에 대한 혼란스러운 해석을 피하는 것이 중요합니다.

이 기사는 성인 쥐에 사용하기 위한 두 가지 안구 치료 주사 방법, 유리체강내 주사와 후구강 주사를 제시합니다. 또한, 성체 쥐에서 온전한 시신경과 망막을 일괄적으로 제거하기 위한 조직 회수 방법이 제시됩니다. 이러한 기술을 통해 유도 병리 및 치료의 안구 및 안구 주위 효과를 조사할 수 있습니다.

프로토콜

모든 실험은 안과 및 시각 연구에서의 동물 사용에 대한 ARVO 성명서에 따라 수행되었으며 오하이오 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구에는 체중이 ~200g이고 생후 약 2개월인 수컷 Sprague Dawley 쥐가 사용되었습니다²⁵. 시약 및 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 유리체강내 주사(IVI)

1. 이소플루란과 폐기물 리드를 SALOOT 부착 포트에 부착합니다. ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Visual Research 및 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 표준 이소플루란 절차를 사용하여 동물을 마취합니다.
   참고: 또는 동물이 이미 다른 안과 검사 세션에서 마취된 경우(예: 케타민/자일라진 혼합, 90mg/kg 케타민 및 10mg/kg 자일라진), 동물을 안과 수술 플랫폼으로 옮기고 이소플루란(산소 3: 이소플루란 3 비율)으로 마취를 적정하여 적절한 마취 깊이가 유지되도록 합니다.
2. 마취된 동물과 함께 안과 수술 플랫폼을 라이브 수술 현미경 아래에 놓습니다. 페달 철수 반사를 통해 마취 깊이를 평가합니다.
3. 0.5% 테트라카인 염산염 점안액을 눈이나 수술 중인 눈에 1-2방울 떨어뜨립니다. 조작을 수행하지 않을 경우 hypromellose 0.3%와 같은 윤활 국소 안과 연고를 반대쪽 눈에 바르십시오.
   1. 그런 다음 안구 표면에 5% 포비돈 요오드 1-2방울을 떨어뜨리고 면봉을 사용하여 포비돈 요오드를 눈 주변 피부에 바릅니다.
4. 길이 10mm, 각도 15도의 스타일 4팁이 있는 33G 바늘이 있는 10μL 주사기를 사용하여 0.9% 정균 염화나트륨을 추출합니다. 주사기와 바늘을 식염수로 세척한 후 바늘을 뜨거운 비드 살균기에 담그십시오.
   1. 계속하기 전에 식히십시오. 바늘이 냉각된 후 원하는 양(4μL)으로 관심 치료제를 추출합니다.
      참고: 개념 증명 연구를 위해 비희석 문신 잉크와 인산염 완충 식염수(PBS)에 함유된 Evan's Blue 염료를 사용했습니다. Evan's Blue 분말은 불투명해질 때까지 PBS와 혼합되었습니다. 치료적 개념 증명 연구를 위해 1mg/mL의 이부딜라스트, 타우로우르소데옥시콜산(TUDCA) 5mg/mL, 사이클로스포린 주사, 250mg/mL 및 아나킨라 100mg/0.67mL의 농도가 사용되었습니다. 치료용 분말을 0.9% 정균 식염수에 희석하였다.
5. 치아가 있는 미세한 안과 겸자를 사용하여 가장자리의 공막 조직을 부드럽게 잡고 안정화합니다. 홍채 주위에 희미한 붉은 고리가 있습니다. 이 링을 랜드마크로 사용하여 바늘을 삽입하고 베벨 면이 아래로 향하게 하여 눈 뒤쪽에 주입합니다.
   참고: 바늘을 망막 쪽으로 기울이고 바늘을 2/3 정도만 삽입하십시오(그림 1). 바늘이 렌즈를 긁지 않도록 하면 백내장이 발생할 수 있습니다.
6. 치료제를 주입한 후 천천히 바늘을 제거합니다. 눈을 감고 식염수로 씻어내기 전에 최소 10-15초 동안 압력을 유지하십시오.
7. 동물의 이소플루란을 중단하고 안과 수술 플랫폼에서 제거합니다. 각 눈에 하이프로멜로스 0.3% 한 방울을 떨어뜨린 다음 동물이 발열 패드에서 회복할 수 있도록 합니다.

2. 후궁 주사(RBI)

1. 이소플루란과 폐기물 리드를 SALOOT 부착 포트에 부착합니다. 표준 이소플루란 절차를 사용하여 동물을 마취합니다.
   참고: 또는 동물이 이미 다른 안과 검사 세션에서 마취된 경우(예: 케타민/자일라진 혼합, 90mg/kg 케타민 및 10mg/kg 자일라진), 동물을 안과 수술 플랫폼으로 옮기고 이소플루란(산소 3: 이소플루란 3 비율)으로 마취를 적정하여 적절한 마취 깊이가 유지되도록 합니다.
2. 마취된 동물과 함께 안과 수술 플랫폼을 라이브 수술 현미경 아래에 놓습니다. 페달 철수 반사를 통해 마취 깊이를 평가합니다.
3. 0.5% 테트라카인 염산염 점안액을 눈이나 수술 중인 눈에 1-2방울 떨어뜨립니다. 조작을 수행하지 않을 경우 반대쪽 눈에 윤활 국소 안연 연고(하이프로멜로스 0.3%)를 바르십시오.
   1. 그런 다음 안구 표면에 5% 포비돈 요오드 1-2방울을 떨어뜨리고 눈 창을 사용하여 포비돈 요오드를 눈 주변 피부에 바릅니다.
4. 28G 바늘이 있는 0.5mL 인슐린 주사기를 구합니다. 관심 치료제를 원하는 양(100μL)으로 추출합니다.
   참고: 개념 증명 연구를 위해 비희석 문신 잉크와 인산염 완충 식염수(PBS)에 함유된 Evan's Blue 염료를 사용했습니다. Evan's Blue 분말은 불투명해질 때까지 PBS와 혼합되었습니다. 치료적 개념 증명 연구를 위해 10mg/mL의 이부딜라스트, 50mg/mL의 TUDCA, 250mg/mL의 사이클로스포린 주사, 100mg/0.67mL의 아나킨라 농도가 사용되었습니다. 치료용 분말을 0.9% 정균 식염수에 희석하였다.
5. 치아가 있는 미세한 안과 겸자를 사용하여 아래 눈꺼풀을 부드럽게 잡고 안정시킵니다. 안구 뒤쪽이 느껴질 때까지 아래쪽 안와 가장자리를 따라 6시와 7시 방향 사이의 중간 방향으로 바늘을 비스듬히 삽입합니다. 바늘을 약간 뒤로 당긴 다음 치료제를 천천히 주입합니다(그림 2).
6. 바늘을 부드럽고 천천히 제거합니다. 그런 다음 눈을 감고 식염수로 씻어내기 전에 최소 10-15초 동안 압력을 유지하십시오.
7. 동물의 이소플루란을 중단하고 안과 수술 플랫폼에서 제거합니다. 각 눈에 하이프로멜로스 0.3% 한 방울을 떨어뜨린 다음 동물이 발열 패드에서 회복할 수 있도록 합니다.

3. 안구 조직 격리 해부

1. CO₂ 질식을 통해 동물을 안락사시킨 후 또는 승인된 IACUC 프로토콜에 달리 명시된 대로 동물을 흉골 누운 상태로 눕힙니다. 등쪽 목 위의 가로 피부 절개를 사용하여 귓바퀴 높이까지 확장합니다.
2. 대서양-후두 관절을 노출시키기 위해 등쪽 근육을 절개합니다. 마요네즈 가위를 사용하여 대서양-후두 관절을 절개하여 머리와 몸통을 분리합니다(그림 3). 둔기 해부를 사용하여 코 높이에서 등쪽 목까지 등쪽 두개골의 피부를 부드럽게 제거하고 양쪽 눈 주위의 피부는 그대로 둡니다.
3. 한 쌍의 중간 직선 지혈기 또는 바늘 드라이버를 두개골 기저부의 구멍에 삽입합니다. 지혈기를 사용하여 foramen magnum에서 양쪽의 측두 영역까지 연장된 측면 두개골을 부드럽게 절단합니다(그림 3).
   1. 두개골 상단을 제거할 때는 지혈을 뇌의 등쪽과 평행하게 유지한다. 이렇게 하면 뇌가 손상되지 않고 뼈 제거 과정에서 흠집이 나지 않습니다.
4. 편평한 주걱을 사용하여 뇌를 가로질러 부드럽게 반사하여 시신경을 노출시킵니다. 뇌의 무게로 인한 긴장이 시신경에 가해지지 않도록 주의해야 합니다.
5. 신경이 노출된 상태에서 중간 크기의 마이크로가위를 사용하여 시신경을 가로질러 작게 절개하여 뇌에서 두 신경을 모두 절단합니다. 이 시점에서 뇌는 조직학적 평가를 위해 4°C에서 24시간 동안 PBS(4% PFA)의 파라포름알데히드에 버리거나 배치할 수 있습니다.
6. 한 쌍의 작은 홍채 가위와 한 쌍의 톱니가 있는 안과 마이크로 집게를 사용하여 눈 주위의 여분의 조직(예: 눈꺼풀, 결합 조직 등)을 조심스럽게 제거합니다. 완료되면 눈은 안와에 위치해야 하지만 안구 외 근육과 땀샘만 남아 있어야 합니다.
7. 지혈기를 작은 홍채 가위와 함께 사용하여 안구를 절단하고 시신경이 시관을 통과할 때 시신경을 절단하지 않도록 세심한 주의를 기울이십시오. 지혈기로 안구 뒤쪽의 뼈를 조심스럽게 부러뜨리고 보다 정확한 제어를 위해 작은 해부 가위를 사용합니다.
8. 뼈를 제거한 후 마이크로 가위와 가는 집게로 안구 주위를 섬세하게 잘라 지방 패드, 땀샘 및 안구 외 근육을 제거합니다. 이 과정에서 시신경을 관찰하십시오.
9. 눈은 두개골 내부를 향해 꼬리 방향으로 부드럽게 반사될 수 있어야 합니다. 이 시점에서 작은 마이크로 가위와 가는 집게를 사용하여 두개골 아래쪽 융기선에 있는 신경을 둘러싼 결합 조직을 제거합니다.
10. 이 조직이 제거되면 눈과 전체 시신경을 두개골에서 일괄적으로 들어 올릴 수 있어야 합니다. 반대쪽 눈과 신경에 대해 이 단계를 반복합니다.
11. 또한 경막초와 같은 과도한 조직의 시신경과 눈을 청소합니다. 조직학적 분석을 위해 조직을 보존할 필요가 없는 경우 -80°C에서 보관하기 전에 드라이아이스 또는 액체 질소를 사용하여 급속 동결합니다.
12. 질량 분석의 경우 망막을 지구의 내부 영역과 분리해야 하고 시신경을 분리해야 합니다. 가장 가까운 외부 지점에서 시신경을 지구본과 분리합니다. 신경을 얼음 위의 냉동 튜브에 넣고 -80°C로 옮기십시오.
    1. 작동 현미경 아래 페트리 접시에 눈의 지구본을 놓습니다. 한 쌍의 작은 마이크로 가위로 가장자리를 절개하기 전에 한 쌍의 구부러진 집게를 사용하여 눈을 안정적으로 고정하십시오.
    2. 지구의 전체 둘레를 포함하도록 절단면을 확장합니다. 지구본은 이등분되어야 하며 앞쪽 부분은 버릴 수 있습니다.
    3. 뒤쪽 부분을 안쪽이 위로 향하게 놓고 한 쌍의 미세한 안과 핀셋을 사용하여 얇은 크림색 조직을 제거합니다. 광학 디스크에 달라붙는 것처럼 보일 수 있습니다. 이 경우 마이크로 가위를 사용하여 디스크에서 망막을 잘라냅니다.
       참고: 그런 다음 망막 조직을 얼음 위의 냉동 튜브에 넣은 후 -80°C로 옮길 수 있습니다. 그런 다음 평가를 위해 조직을 질량 분석 시설로 옮길 수 있습니다.
13. 부분 관류를 사용한 면역조직학 염색의 경우, 손상되지 않은 눈을 페트리 접시에 놓습니다. 구부러진 집게를 사용하여 눈을 안정되게 한 다음 28G 바늘이 있는 인슐린 주사기를 바늘로 잡고 바늘이 망막 쪽으로 기울어지도록 가장자리에 삽입합니다. 림버스를 따라 다른 두 지점에서 이 단계를 반복합니다. 지구의 천공은 적절한 관류를 보장하고 적절한 고정을 돕는 데 도움이 됩니다.
    알림: 글로브는 셰이커로 전환하기 전에 최소 40분 동안 4% PFA로 고정하고 유체 이동을 용이하게 하기 위해 추가로 20분 동안 저속으로 교반해야 합니다.
14. 고정 단계가 완료되면 PFA를 제거하고 PBS로 교체합니다. 바이알을 부드러운 셰이크에 15분 동안 놓고 이 단계를 반복하여 두 번째 15분 PBS 헹굼을 합니다.
15. 최종 PBS 헹굼 주기 후 PBS를 흡입하고 PBS의 30% 자당 용액으로 교체한 다음 24시간 동안 냉장 보관합니다. 자당 배양 단계에 이어 조직학적 평가를 위해 OCT에 조직을 삽입한다²⁶.

결과

RBI와 IVI 모두에 대한 바늘의 배치와 크기를 최적화하기 위해 주입 염료(Evans Blue 염료)와 문신 잉크(그림 2B)를 사용하여 사체 동물에 대한 예비 파일럿 실험을 수행했습니다. 문신 잉크는 희석되지 않았고 Evans Blue 분말은 액체가 불투명해질 때까지 PBS에 혼합되었습니다. 우리는 이상적인 RBI는 28G 바늘을 6시와 7시 방향 사이의 중간에 안구 뒤쪽이 느?...

토론

주로 BRB에 의해 제기된 불침투성 장벽으로 인해 망막과 시신경에 치료제를 전달하는 것과 관련된 복잡한 어려움은 이 연구의 중요성을 강조합니다 ^3,4. IVI와 RBI 기법에 대한 탐구는 이러한 장애물을 극복하기 위한 혁신적인 접근법을 강조할 뿐만 아니라 안과 치료 및 치료 개발에 대한 광범위한 함의를 강조합니다. 이러한 연구...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anakinra 100 mg/0.67 mL	Sobi	NDC: 66658-0234-07
Antipamezole hydrochloride (Antisedan) 5.0 mg/mL	Zoetis	NADA #141-033 | 107204-8
Bacteriostatic sodium chloride (0.9%)	Hospira Inc.	NDC: 0409-1966-02
Cryotube	VWR	76417-258	https://us.vwr.com/store/product?keyword=76417-258
Curved forceps	Fischer Scientific	08-953F
cyclosporine injection 250 mg/mL	Perrigo	NDC: 00574-0866-10
cyclosporine topical, 0.05% (Restasis)	AbbVie (Vizient)	NDC: 00023-9163-30
Cyotube Cap	Thermo Scientific	3471BLK	https://www.fishersci.com/shop/products/screw-cap-microcentrifuge-tube-caps/14755237?searchHijack=true&searchTerm= screw-cap-microcentrifuge-tube-caps&searchType=Rapid& matchedCatNo=14755237
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129-10G
Eye Spears	Fischer Scientific	NC0972725	https://www.fishersci.com/shop/products/ultracell-pva-eye-spears-100-p/NC0972725
Fine forceps	Fischer Scientific	08-953E	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-dissecting-jewelers-microforceps-2/08953E?gclid=Cj0KCQiAkJO8BhCGARIsAM kswyiER9Kanmi3ZMgoXTr82Zg3 g44m1Q6WLftkYfb36hC7pbkwR hVAy3MaAqkLEALw_wcB&ef_id =Cj0KCQiAkJO8BhCGARIsAMks wyiER9Kanmi3ZMgoXTr82Zg3g4 4m1Q6WLftkYfb36hC7pbkwRhV Ay3MaAqkLEALw_wcB:G:s&ppc _id=PLA_goog_2086145680_81 843405274_08953E__38624700 1354_6556597232892883360& ev_chn=shop&s_kwcid=AL!4428 !3!386247001354!!!g!827721591 040!&gad_source=1
Fine ophthalmic forceps with teeth	Fisher Scientific	50-253-8287	https://www.fishersci.com/shop/products/bonn-suturing-forceps-7-5-cm/502538287
Flat spatula	Fischer Scientific	14-375-100	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-spoonula-lab-spoon/1437510#?keyword=
Hot bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	https://www.finescience.com/en-US/Products/Instrument-Care-Accessories/Sterilization/Hot-Bead-Sterilizers
Hypromellose 0.3% (GenTeal Tears Severe Dry Eye Gel)	Alcon Laboratories Inc.		https://www.amazon.com/GenTeal-Tears-Lubricant-Ointment-Night-Time/dp/B01IN5G1L0/ref=sr_1_4?dib=eyJ2IjoiMSJ9.DxYpqjIIBNO TVuPo7jln5xeGazA_YFg0cbt3 kCyC-0ouZARw5qIHYvCM7vB R_vO30OWUEXDZhQmQfLQ9 ySld4mujpzrWjxbsEXLBs5JPhjZ eUPgPY0sHoJA46f9EYULdxiTu BQy5fVA2OB20RV09mbdW8hX 6j8-bXIYTZljPGMo5_GMq9jnJo8 3iR35c1THxEiEH2FsvSx7VXup- QK9uCkWwAYrw2v3tyLUCq2JT APPF34nsYqGnSASMgOARU_ 2lVz-kIy-QUEYHGOoIimIWwBY htz33RkFrq7YjtnC2uDbImNiudG zWJv-uUhmJngYjbBGbeWE0VX 7CGPkEokUZrCQ8AI2HeXjSMph gPhMbK88RcHJ63AyH0TiBtS2k1 Xceh-CD26_prJSNxF6Mv5-jgGf9 iLmXvVtKkkSwc-5uYLk7gZHaFC Yj73F_imbmeHYr.4vfu7h4m4Jlfy- qiqmgeAnDHlJTGYV22HJ2w_xD ir0k&dib_tag=se&keywords=Gent eal+gel&qid=1736793609&sr=8-4
ibudilast	Millipore Sigma	I0157-10MG
insulin syringe 0.5 mL with a 28 gauge Micro-Fine IV Needle	Becton, Dickinson and Company (BD)	14-826-79
Isoflurane	Covetrus	NDC: 11695-6777-2
Ketamine	Covetrus	NDC: 11695-0703-1
Long Evans Rat	Charles River Laboratories International, Inc.		https://www.criver.com/products-services/find-model/long-evans-rat?region=3611
Mayo Scissors	Electron Microscopy Sciences	72968-03
Medium microscissors	Amazon		https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z168866#product-documentation
Medium straight hemostats or needle drivers	Sigma-Aldrich	Z168866-1EA	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z168866#product-documentation
Needle 33 G with a style 4 tip at a length of 10 mm and angle of 15 degrees	Hamilton	7803-05
paraformaldehyde 4 in phosphate-buffered saline (PBS) (4% PFA)	Thermo Fischer	J61899.AK
Petri dish	Millipore Sigma	P5606-400EA	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5606?utm_source=google&utm_medium= cpc&utm_campaign=8674694095 &utm_content=105162454052& gad_source=1&gclid=Cj0KCQiA kJO8BhCGARIsAMkswygXXfgY ABr7EfLtf4tvuLS0E8A4SxX4XM NJQDaI80Yi4FO-iahCsPcaAp9E EALw_wcB
phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813-10PAK	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p3813
Povidone-Iodine (Betadine) 5%	Alcon Laboratories Inc.	NDC: 0065-0411-30
Shaker Model 3500	VWR	89032-092
Small iris scissors	Sigma-Aldrich	Z265977-1EA	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z265977&
small microscissors	Fisher Scientific	17-456-004	https://www.fishersci.com/shop/products/self-opening-scissors-2/17456004?keyword=true
Sprague Dawley Rat	Charles River Laboratories International, Inc.	SAS 400	https://emodels.criver.com/product/400
Sucrose	Millipore Sigma	57-50-1	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/sucrose3423057501
syringe 10 µL (Model 701 RN)	Hamilton	80330
Tattoo Ink (Intenze Tattoo Ink True Black 1 oz)	Amazon		https://www.amazon.com/Intenze-Tattoo-Ink-True-Black/dp/B01GW747L2
tauroursodeoxycholic acid (TUDCA)	Milipore Sigma	580549-1GM
Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%	Bausch & Lomb Inc.	NDC: 68682-920-64
Xylazine (Rompun) 100 mg/mL	Dechra	NADA #047-956 |