خلية ثقافة يمكن زراعة الخلايا باستخدام تقنيات راسخة ولكن يجب أن يكون مطلي على # 1 coverslips الزجاج المطلي مع مادة لاصقة الخلوية (مثل polyornithine ، أو متعدد الليزين laminin) لمنع الخلايا من فصل أو نقل خلال تجارب التصوير. الحلول يمكن إجراء تجارب التصوير الكالسيوم باستخدام مجموعة متنوعة من الحلول بما فيها وسائط الثقافة الفسيولوجية الخلية. من المهم ، مع ذلك ، للتأكد من أن الحلول تكون خالية من الفينول الأحمر ، الذي يزيد كثيرا من الخلفية الفلورسنت. نستخدم Tyrodes حل ، والتي تتم بسهولة ويحاكي السائل النخاعي ، ونحن مع تكملة مصل الزلال البقري بنسبة 0.1 ٪. نستخدم الاستقطاب مع كلوريد البوتاسيوم 60-90 ملي الجهد لتنشيط قنوات الكالسيوم وبوابات Thapsigargin 1μM (1 ملم في الأسهم DMSO) أو 2μM ​​Ionomycin (1 ملم في الأسهم DMSO) لتنشيط قنوات تخزين CRAC تشغلها. غالبا ما يكون مناسبة لإزالة الكالسيوم من الحل خارج الخلية لإظهار أن ترتفع الكالسيوم ومن المقرر أن تدفق الكالسيوم. عند إزالة الكالسيوم الضروري للحفاظ على التركيز الكلي للكاتيونات ثنائي التكافؤ (2 + المغنيسيوم والكالسيوم 2 +) ثابتة. عند استبدال البوتاسيوم الصوديوم لأنه من الضروري الحفاظ على التوازن التناضحي. Tyrodes الحلول : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> انخفاض البوتاسيوم 2mm وكا 2 + Tyrodes (ملم) </td><td> انخفاض البوتاسيوم 0 كا 2 + Tyrodes (ملم) </td><td> ارتفاع البوتاسيوم 2mm وكا 2 + Tyrodes (ملم) </td><td> ارتفاع البوتاسيوم 0 كا 2 + Tyrodes (ملم) </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 129 </td><td> 129 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 129 </td><td> 129 </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> جلوكوز </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td> 25 </td></tr></tbody></table> ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم تحميل صبغ الكالسيوم Fura - 2 نحن مع تحميل خلايا acetoxy ميثيل استر Fura - 2 (Fura ، 02:00) ، والذي ينتشر عبر غشاء الخلية ، واجتثاث أسترته بواسطة esterases الخلوية لانتاج حامض Fura - 2 مجانا. المعلمات الدقيق لFura - 2 تحميل تختلف على نطاق واسع عبر أنواع الخلايا. نوصي اختبار مختلف الظروف من خلال إعداد حلول التحميل عدة تحتوي على تركيزات متعددة من Fura - 2 مستعرة 1-4 ميكرومتر ، تفرخ الخلايا في حل تحميل لمجموعة متنوعة من الأوقات من 15 دقيقة الى 2 ساعة ، واختبار التحميل في درجة حرارة الغرفة و في 37 درجة. ويرد بروتوكول مبسط للعصبونات القشرية أدناه : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا ، إعداد ملي 1 - Fura 2:00 الأسهم بإضافة 50μl من DMSO إلى قارورة 50μg المتاحة من Invitrogen. من المهم استخدام DMSO جافة معبأة تحت النيتروجين وأنه من الضروري لإزالة DMSO بإبرة بواسطة ثقب الحاجز لمنع الماء من DMSO. بعد إعداد الحل Fura AM - 2 يبقيه في مكان جاف ومظلم. Fura - 2 صباحا في DMSO غير مستقرة عند RT لمدة 24 ساعة ومستقرة في -- 20 درجة في حاوية جافة لعدة أشهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 2 ملل من وسائل الإعلام الثقافة في أنبوب 15 مل المخروطية ، الحارة الى 37 درجة. وإضافة 2μl من Fura ، 02:00 المخزون لتوليد 1μM Fura ، 02:00 الحل. دوامة الحل بقوة لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل حل التحميل لصحن 35 ملم زراعة الأنسجة ونقل ساترة مع الخلايا في الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا العصبية في 37 درجة لمدة 30 دقيقة في حاضنة الظلام. الوقت حضانته بدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طبق يحتوي على 35 مم 2 ملل من وسائل الإعلام من دون زراعة الأنسجة ، Fura 02:00. إزالة ساترة من الحل التحميل ومكان في صحن جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل ساترة على غرفة التصوير. إزالة ساترة من الطبق 35 ملم وتحميل بسرعة على غرفة مع التأكد من منع جفاف الخلايا. نستخدم غرفة التصوير آلات صنعت من قبل وارنر الذي يسمح لساترة 10MM تحتوي على خلايا لتركيبها على الجزء السفلي وساترة الثانية التي يتم تركيبها على القمة تشكيل لبيع الشطائر. يتم تأمين coverslips مع اثنين من الشحوم فراغ الى الغرفة ومواسير اثنان في طرفي الغرفة تسمح نضح من الحلول من خلال الغرفة. توصيل خط الإدخال إلى حقنة وتوصيل خط الانتاج الى البئر التي يتم تفريغها بواسطة خط الشفط متصلة فخ الفراغ. </li></ol> المجهر نستخدم مقلوب نيكون الكسوف TE2000 - U المجهر مجهزة مصباح قوس زينون (سوتر صكوك) ، وهي مرحلة الآلي (Ludl) ، وعجلة الإثارة تصفية (Ludl) ، وجهاز تبريد المسؤول عن زوجين (CCD) الكاميرا (هاماماتسو Orka الثاني). يتم التحكم بواسطة المجهر كوم ماكنتوشحاسوبية تشغيل البرمجيات مفتوحة مختبر (الارتجال). العديد من حزم البرامج الأخرى المتوفرة للتصوير ratiometric. التصوير نستخدم 40 ، 60 أو 100X النفط الأهداف فلور الغمر نيكون مع NA تتجاوز 1.2. التصوير البروتوكول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة مرحلة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل Tyrodes الحل في سطر الإدخال مع الحرص على منع تشكيل فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط الغرفة الى خطوط الارواء ويروي Tyrodes حل من خلال غرفة مرة أخرى ، مع الحرص على منع تكون الفقاعات في الغرفة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة من الزيت على الهدف ، ومكان الغرفة على الساحة المجهر والتركيز على الخلايا باستخدام الضوء المرسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص مضان من الخلايا باستخدام الإضاءة في 340 و 380 نانومتر في استخدام العدسات. وينبغي أن يستريح الخلايا خافت في 340 و 380 في مشرق. عموما ، يجب ألا تكون خلايا ضوئية للأشعة فوق البنفسجية لأكثر من 10 أو 15 ثانية ، وينبغي خفض كثافة الضوء الإثارة ذات الكثافة محايدة فلتر لمنع الضيائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص الخلايا باستخدام الكاميرا ، وتعيين وكسب التعرض للكاميرا لتوليد الصورة التي هي قريبة من التشبع (ولكن ليس المشبعة) عندما يضاء في 380 نانومتر ، وأقل بكثير من التشبع عندما مضيئة في 340 نانومتر. إبقاء التعرض أدناه 200ms إذا أمكن ذلك. مجموعة مرة واحدة ، لا تتغير كسب الكاميرا أو التعرض إلا إذا كنت تخطط أيضا لتغيير الخلفية ، وRMin RMax (أنظر أدناه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع كل صورة في الطول الموجي واستخدام أداة منطقة (ROI) الفائدة لقياس كثافة الخلفية في مجموعة متنوعة من المواقع في صور لكل طول موجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متوسط ​​القيم الأساسية وإدخال القيم الأساسية في المواقع المناسبة في برنامج التصوير. سيتم خصم قيمة الخلفية من كل بكسل في هذا المجال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع صورة نسبة الممارسة وضبط القيم عتبة لكل طول موجي لتوليد صورة يتضمن فقط نسبة الخلايا وليس الخلفية ، وأنه ليس صاخبة في المنطقة على مقربة من حواف الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين قيمة النسبة الأدنى (RMin) أن حوالي 10 ٪ أقل من أدنى نسبة من أي خلية في الميدان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين RMax أن حوالي 12 أضعاف RMin. لا تغيير أو RMin RMax بين التجارب التي كنت تخطط للمقارنة لأنها سوف تجعل من الصعب المقارنة. نادرا ما نغير RMin والقيم Rmax على منصة التصوير لدينا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المرحلة الآلي للعثور على الحقول التي كنت تخطط لصورة ، وتسجيل موقع كل مجال استخدام البرمجيات. نجمعها عموما خمسة حقول من خلال عرض تجربة. التحركات المرحلة الآلي إلى حقل ، ويجمع صورة النسبة وينتقل إلى الحقل التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الفاصل الزمني الفاصل بين لجمع الصور بين 0.1 و 10 ثوان يتوقف بغض النظر عن نوع من الإشارات التي تتوقع أن ترى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند اختبار نظام التصوير الكالسيوم غالبا ما يكون من المفيد استخدام المنبهات مثل البوتاسيوم tyrodes عالية (65 ملي بوكل) أو ionomycin (2μM) التي من شأنها أن تتسبب في ارتفاع الكالسيوم داخل الخلايا ، والكالسيوم حل خارج الخلية الحرة التي من شأنها (التي تحتوي على الكالسيوم مثل المخازن وEGTA BAPTA ) من شأنها أن تقلل من تركيز الكالسيوم. </li></ol> تحليل بمجرد اكتمال التجربة كنت تريد تحويل مجموعة من الصور في قياسات نسبة الكالسيوم الوقت الفاصل بين لخلايا فردية أو مناطق ذات الاهتمام داخل الخلايا. للقيام بذلك : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام أداة الفائدة من المنطقة (ROI) لتحديد مناطق من الصورة التي تريد لقياس الكالسيوم. هو عموما من المفيد أن يكون واحد على الأقل ROI الذي يغطي جسم الخلية للخلية. عند تحديد رويس ، من المفيد لتشغيل الفيلم من الصور للتحقق من أن الخلايا لا تتحرك أثناء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرنامج لجمع قياسات نسبة مرور الزمن لكل عائد الاستثمار في كل صورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استيراد قياسات نسبة إلى برنامج التحليل. سوف تحتاج لعرض آثار الكالسيوم لخلايا معينة أو رويس ، أو خلايا متعددة متوسط ​​رويس وتحويل القياسات النسبة إلى داخل الخلايا قيم الكالسيوم. نحن نستخدم مجموعة من وحدات الماكرو المكتوبة في برو ايغور التي تسمح لنا للقيام بكل هذه المهام المشتركة ولكن تحليل برامج أخرى مثل Excel ، وإن كان يمكن أيضا أن تستخدم أقل ملاءمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المعادلة [كا] = (RR دقيقة) / (R ماكس - R) يمكن استخدامها SF * دينار لتحويل القيم نسبة Fura - 2 لتركيزات الكالسيوم داخل الخلايا. [كا] هو تركيز الكالسيوم ، R هو Fura - 2 340/380 النسبة ، وRMin RMax هي نسب 340/380 في غياب الكالسيوم أو في وجود تركيز تشبع من الكالسيوم على التوالي ؛ وSF * دينار نتاج دينار من Fura - 2 (ما يقارب 120 نيوتن متر عند RT) وقيمة التحجيم. لقياس R مين ، وماكس R SF دينار * فمن الضروري لتنفيذ إما في الجسم الحي أو في المختبر المعايرة. في الجسم الحي يتطلب معايرةمزيج من لقط التصحيح والتصوير الكالسيوم الذي يمكن أن يكون معقدا ولكن أيضا دقيقة جدا. في المختبر يمكن أن تتم المعايرة باستخدام محلية الصنع غرفة المعايرة التي تتألف من اثنين من coverslips مفصولة هل ساترة رقيقة لتوليد طبقة رقيقة من الحل الذي لإجراء المعايرة. الطريقة الأكثر ملاءمة لقياس القيم Fura - 2 نسبة كدالة للتركيزات الكالسيوم هو استخدام طقم المعايرة التي تحتوي على الكالسيوم حلول متعددة معزولة وFura - 2 حامض الحرة. ويمكن الحصول على هذه من Invitrogen (المسابر الجزيئية) وتحتوي على تعليمات دقيقة للاستخدام. </li></ol>

<ol>
	<li>Grynkiewicz, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li><li>Lewis, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2++and+transmembrane+Ca2++current+in+human+leukemic+T+cells.">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li><li>Dolmetsch, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+between+intracellular+Ca2++stores+and+depletion-activated+Ca2++channels+generates+[Ca2+]i+oscillations+in+T+lymphocytes.">Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).</li></ol>

في هذا العرض لقد مررنا كافة الخطوات لتنفيذ التصوير باستخدام الكالسيوم Fura - 2 AM. استخدمنا العصبونات القشرية كنموذج ولكن يمكن استخدامها لقياس التصوير الكالسيوم الكالسيوم داخل الخلايا في الوقت الحقيقي في مجموعة متنوعة من الخلايا. عندما تفعل هذا الإجراء المهم لاستخدام الزجاج بدلا ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Fura-2 AM</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F1221</td>
<td>Protect from light</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>DMSO</td>
<td>EM Science</td>
<td>MX1457-6</td>
<td>Keep in dry place to prevent hydration</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Albumin from bovine serum</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8022-100G</td>
<td>Store at 4&#176;</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Imaging Chamber</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>Model RC-20H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>Eclipse TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Potassium chloride</td>
<td>SIGMA</td>
<td>P9333-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Calibration Kit</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>F6774</td>
<td>Protect from light</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

calcium imaging of cortical neurons using fura-2 am

التصوير الكالسيوم هو تقنية مشتركة يمكن أن يكون مفيدا لقياس اشارات الكالسيوم في الخلايا المستزرعة. تقنيات التصوير الكالسيوم الاستفادة من الأصباغ مؤشر الكالسيوم ، والتي مقرها BAPTA الجزيئات العضوية التي تغير خصائصها الطيفية ردا على ربط أيونات + CA2. الأصباغ مؤشر الكالسيوم في فئتين ، ونسبة - متري الأصباغ مثل Fura - 2 - 1 والهندية وحيدة الطول الموجي مثل الأصباغ Fluo - 4. نسبة الأصباغ ، إما تغيير متري من الإثارة أو أطياف من الانبعاثات ردا على الكالسيوم ، مما يسمح تحديد تركيز الكالسيوم داخل الخلايا من نسبة انبعاث مضان أو الإثارة في موجات مختلفة. والميزة الرئيسية لاستخدام نسبة - متري الأصباغ خلال تحقيقات الطول الموجي واحد هو أن نسبة إشارة مستقلة للتركيز الأصباغ ، وشدة الإضاءة ، والبصرية طول مسار السماح تحديد تركيز الكالسيوم داخل الخلايا بشكل مستقل من هذه التحف. أحد المؤشرات الأكثر شيوعا هو الكالسيوم Fura - 2 ، التي لديها ذروة الانبعاثات في 505 نانومتر ، والتغييرات الإثارة ذروتها من 340 نانومتر إلى 380 نانومتر ردا على الكالسيوم ملزمة. نحن هنا وصف استخدام Fura - 2 لقياس الارتفاعات الكالسيوم في الخلايا العصبية والخلايا الأخرى منفعل.

Watch this Scientific Journal Video about Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM at JoVE.com

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

إشارات الكالسيوم يلعب دورا رئيسيا في العديد من العمليات الخلوية بما في ذلك بقاء الجينات والتعبير والتمايز. نحن هنا لشرح كيفية القيام به Fura التصوير الكالسيوم ، 02:00. التصوير الكالسيوم هو أداة قيمة لدراسة تنظيم الكالسيوم داخل الخلايا في الوقت الحقيقي ولائحته التعاقب الإشارة.

التصوير الكالسيوم من الخلايا العصبية باستخدام Fura القشرية ، 02:00

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

calcium-imaging-of-cortical-neurons-using-fura-2-am

Research

JoVE Journal

Biology

60.5K Views.  Stanford University. إشارات الكالسيوم يلعب دورا رئيسيا في العديد من العمليات الخلوية بما في ذلك بقاء الجينات والتعبير والتمايز. نحن هنا لشرح كيفية القيام به Fura التصوير الكالسيوم ، 02:00. التصوير الكالسيوم هو أداة قيمة لدراسة تنظيم الكالسيوم داخل الخلايا في الوقت الحقيقي ولائحته التع?...

Video: Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

إعداد E18 العصبونات القشرية للتجزئة الجرذ في جهاز ميكروفلويديك

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

في فيفو 2 فوتون التصوير الكالسيوم في طبقة 2 / 3 من الفئران

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  Vital fluorescent probes, particularly green fluorescent protein (GFP) have revolutionized cell biology stemming from the ability to label specific intracellular compartments and cellular structures. For example, the live imaging of GFP (and its spectral variants) chimeras have allowed for a dynamic 
analysis of the cytoskeleton, organelle transport, and membrane dynamics in a multitude of organisms and cell types [1-3].  Although live imaging has become prevalent, this approach still poses many technical challenges, particularly in primary cultured neurons.  One challenge is the expression of GFP-tagged proteins in post-mitotic neurons; the other is the ability to capture fluorescent images while minimizing phototoxicity, photobleaching, 
and maintaining general cell health.  Here we provide a protocol that describes a lipid-based transfection method that yields a relatively low transfection rate (~0.5%), however is ideal for the imaging of fully polarized neurons.  A low transfection rate is essential so that single axons and dendrites can be characterized as to their orientation to the cell body to confirm directionality of transport, i.e., anterograde v. retrograde.  Our approach to imaging 
GFP expressing neurons relies on a standard wide-field fluorescent microscope outfitted with a CCD camera, image capture software, and a heated imaging chamber. We have imaged a wide variety of organelles or structures, for example, dense-core vesicles, mitochondria, growth cones, and actin without any special optics or excitation requirements other than a fluorescent light source. Additionally, spectrally-distinct, fluorescently 
labeled proteins, e.g., GFP and dsRed-tagged proteins, can be visualized near simultaneously to characterize co-transport or other coordinated cellular events.  The imaging approach described here is flexible for a variety of imaging applications and can be adopted by a laboratory for relatively little cost provided a microscope is available.

Live cell imaging is of particular utility when studying the dynamics of organelle trafficking. Here we describe a protocol for live imaging of dense-core vesicles in cultured neurons using wide-field fluorescence microscopy. This protocol is flexible and can be adapted to image other organelles such as mitochondria, endosomes, and peroxisomes.

يعيش تصوير الكثيفة الأساسية الحويصلات في الخلايا العصبية الأولية الحصين مثقف

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

في التصوير المجراة من الطبقات العميقة القشرية باستخدام Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

التصوير المباشر من الكالسيوم مع ER-المستهدفة استريز المستحثة صبغ تحميل (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

التصوير متحد البؤر قياس التقلبات الكالسيوم داخل الهيولى العضلية شبكية من مثقف خلايا العضلات الملساء عن طريق الحنق المستندة إلى

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Concurrent EEG and Functional MRI Recording and Integration Analysis for Dynamic Cortical Activity Imaging

Electroencephalography (EEG) and functional magnetic resonance imaging (fMRI) are two of the fundamental noninvasive methods for identifying brain activity. Multimodal methods have sought to combine the high temporal resolution of EEG with the spatial precision of fMRI, but the complexity of this approach is currently in need of improvement. The protocol presented here describes the recently developed spatiotemporal fMRI-constrained EEG source imaging method, which seeks to rectify source biases and improve EEG-fMRI source localization through the dynamic recruitment of fMRI sub-regions. The process begins with the collection of multimodal data from concurrent EEG and fMRI scans, the generation of 3D cortical models, and independent EEG and fMRI processing. The processed fMRI activation maps are then split into multiple priors, according to their location and surrounding area. These are taken as priors in a two-level hierarchical Bayesian algorithm for EEG source localization. For each window of interest (defined by the operator), specific segments of the fMRI activation map will be identified as active to optimize a parameter known as model evidence. These will be used as soft constraints on the identified cortical activity, increasing the specificity of the multimodal imaging method by reducing cross-talk and avoiding erroneous activity in other conditionally active fMRI regions. The method generates cortical maps of activity and time-courses, which may be taken as final results, or used as a basis for further analyses (analyses of correlation, causation, etc.) While the method is somewhat limited by its modalities (it will not find EEG-invisible sources), it is broadly compatible with most major processing software, and is suitable for most neuroimaging studies.

An EEG-fMRI multimodal imaging method, known as the spatiotemporal fMRI-constrained EEG source imaging method, is described here. The presented method employs conditionally-active fMRI sub-maps, or priors, to guide EEG source localization in a manner that improves spatial specificity and limits erroneous results.

التخطيط الدماغي المتزامنة وتسجيل الرنين المغناطيسي الوظيفية وتحليل التكامل لتصوير نشاط القشرية ديناميكية

Electroencephalography (EEG) and functional magnetic resonance imaging (fMRI) are two of the fundamental noninvasive methods for identifying brain ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

تحليل وظيفة خلايا بيتا باستخدام تصوير الكالسيوم القرار خلية واحدة في الجزيرات الزرد

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

تصوير ديناميات الكالسيوم في السكان الفرعيين من خلايا الفئران جزيرة البنكرياس

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...