Hücre Kültürü Hücreler kurulan teknikleri kullanılarak yetiştirilen olabilir ama görüntüleme deneyler sırasında ayrılmakta veya hareketli hücreler önlemek için (polylysine polyornithine ya da laminin gibi) hücresel bir yapıştırıcı ile kaplanmış # 1 bardak lamelleri kaplama olmalıdır. Çözümler Kalsiyum görüntüleme deneyleri, hücre kültürü medya da dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik çözümleri kullanılarak yapılabilir. Bu çözümler floresan arka plan büyük ölçüde artırır fenol kırmızısı, emin olun, ancak önemlidir. Biz Tyrodes çözümü, kolay yapılan ve beyin omurilik sıvısı taklit ve Albumin% 0.1 Bovine Serum ile takviye kullanın. Biz mağaza çalışan Kerek kanalları etkinleştirmek için voltaj bağımlı kalsiyum kanalları ve 1 mikrona kadar Thapsigargin (1 mM stok DMSO içinde) veya 2μM Ionomycin (DMSO içinde 1 mM stok) etkinleştirmek için 60-90 mM potasyum klorür ile depolarizasyon kullanın. Ekstraselüler kalsiyum yükselmeler kalsiyum akını nedeniyle olduğunu göstermek için bir çözüm kalsiyum kaldırmak için çok uygundur. Kalsiyum çıkarırken bu iki değerli katyonların toplam konsantrasyonu (Mg 2 + ve Ca 2 +) sabit. Korumak için gerekli olan Sodyum potasyum yerine zaman ozmotik dengesini korumak için gereklidir. Tyrodes çözümleri: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Düşük potasyum 2mm Ca 2 + Tyrodes (mM) </td><td> Düşük potasyum 0 Ca 2 + Tyrodes (mM) </td><td> Yüksek Potasyum 2mm Ca 2 + Tyrodes (mM) </td><td> Yüksek Potasyum 0 Ca 2 + Tyrodes (mM) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 129 </td><td> 129 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 129 </td><td> 129 </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td> 25 </td></tr></tbody></table> NaOH ile pH 7.4 &#39;e ayarlayın. Fura-2 kalsiyum boya yükleme Biz hücreleri yük asetoksi-metil ester Fura-2 hücre zarı boyunca yayılır ve hücresel esterazlar Fura-2 serbest asit verim de esterleşmiş (Fura 02:00). Fura-2 yükleme için tam parametreleri hücre tipleri arasında büyük ölçüde değişmektedir. , 4 mcM, 15 dakika ve 2 saat oda sıcaklığında yükleme test bir çok kez yükleme çözüm hücreleri kuluçka ve Fura-2 1 - azgın bir çok konsantrasyonları içeren çeşitli yükleme çözümleri hazırlayarak çeşitli koşullarda test tavsiye 37 derece. Kortikal nöronlar için basitleştirilmiş bir protokol aşağıda verilmiştir: <ol><li> Birincisi, DMSO, 50μl Invitrogen edinilebilir 50μg flakon ekleyerek Fura-2 stok 1 mM hazırlar. Azot gazı altında paketlenmiş kuru DMSO kullanmak için çok önemlidir ve septum batırılarak DMSO hidrasyon önlemek için bir iğne ile DMSO kaldırmak için gereklidir. Hazırladıktan sonra Fura 02:00 çözümü, karanlık ve kuru bir yerde saklayın. Fura-2, 24 saat boyunca oda sıcaklığında DMSO istikrarlı AM ve istikrarlı birkaç ay boyunca kuru bir kapta 20 derece. </li><li> 37 derece sıcak bir 15 ml konik tüp, kültür ortamı kısım 2 ml. Fura-2 2μl eklemek ve bir 1 mikrona kadar Fura-2 çözüm üretmek için stok AM. 1 dakika boyunca kuvvetlice vorteksleyin çözüm. </li><li> Transfer yükleme çözümü ve 35 mm doku kültürü çanak çanak içine hücreleri ile lamel transfer. </li><li> 37 derece 30 dakika boyunca karanlık bir inkübatör nöronlar inkübe edin. Inkübasyon tam zamanı. </li><li> Fura-2 AM olmadan 2 ml doku kültürü ortamı içeren 35 mm çanak hazırlayın. Lamel yeni çanak yükleme çözüm ve yerden çıkarın. </li><li> Görüntüleme odasının lamel monte edin. 35 mm çanak lamel çıkarın ve hızla hücrelerin kurumasını önlemek için emin olun odasının üzerine monte. Biz, alt ve bir sandviç oluşturan üstüne monte edilmek üzere ikinci bir lamel üzerine monte edilmek üzere hücreleri içeren bir 10mm lamel sağlayan Warner Instruments tarafından üretilmiş bir görüntüleme odası kullanın. Odanın iki ucunda iki lamelleri haznesinden çözümler perfüzyon için izin vakum odasına yağ ve iki tüp ile teminat altına alınmıştır. Bir şırınga giriş hattı bağlanır ve bir vakum tuzak bağlı bir emme hattı ile boşaltılır iyi çıkış hattı bağlı. </li></ol> Mikroskop Biz, xenon ark lambası (Sutter Aletleri), otomatik bir sahne (Ludl), eksitasyon (Ludl) filtre tekerleği ve soğutmalı, çift şarj cihazı (CCD) kamera (Hamamatsu Orka ile donatılmış bir ters Nikon Eclipse TE2000-U mikroskop II). Mikroskobu, bir Macintosh com tarafından kontrol edilirputer Open Lab yazılım (Doğaçlama) çalışıyor. Birçok diğer yazılım paketleri oranlı metrik görüntüleme için mevcuttur. Görüntüleme için 40, 60 veya NA 1.2 aşan 100x Nikon Fluor immersiyon yağı hedefleri kullanın. Görüntüleme Protokolü <ol><li> Mikroskop aşamasında Kalibre. </li><li> Yük giriş hattı içine hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için özen çözüm Tyrodes. </li><li> Odasında kabarcıklarının oluşmasını önlemek için özen, bir kez daha haznesinden perfüzyon hatları ve serpmek Tyrodes çözüm odasına bağlayın </li><li> Hedefi üzerine petrol bir damla koyun, mikroskop sahnede odasına yerleştirin ve iletilen ışık kullanarak hücrelere odaklanmak. </li><li> 340 ve göz mercekleri kullanarak 380 nm dalga aydınlatma kullanarak hücrelerin floresans inceleyin. Dinlenme hücreleri 380 340 az loş ve parlak olmalıdır. Genel olarak, hücreler daha 10 ya da 15 saniye süreyle UV ışığı ile aydınlatılmış değildir ve uyarma ışık yoğunluğunu fototoksisite önlemek için nötr yoğunluk filtresi ile azaltılmalıdır. </li><li> Kamerayı kullanarak hücrelerin inceleyin ve doygunluk 340 nm&#39;de aydınlatılmış çok altında 380 nm&#39;de aydınlatılmış ve doygunluk (ama doymuş) yakın bir görüntü oluşturmak için kamera kazanç ve pozu ayarlamak. Pozlama mümkünse 200ms altında tutun. Aynı zamanda arka plan değiştirmek için düşünmüyorsanız kez ayarlandıktan sonra, kamera kazanç veya pozlama değişmez, Rmin ve rmax (aşağıya bakın). </li><li> Her bir dalga boyunda bir görüntü toplayın ve her dalga boyu için görüntüleri çeşitli yerlerde arka planda yoğunluğunu ölçmek için ilgi (ROI) aracı bölgesi kullanın. </li><li> Ortalama arka plan değerleri ve görüntüleme programı uygun yerlerde içine arka plan değerleri girin. Arka plan değeri alanında her pikselin düşülecektir. </li><li> Bir uygulama oranı resmi toplayın ve her dalga boyu için, sadece ve arka plan hücreleri ve bu hücrelerin kenarlarına yakın bölgede gürültülü değildir içeren bir oran görüntü oluşturmak için Eşik değerleri ayarlayın. </li><li> Alanında herhangi bir hücrenin en düşük oran yaklaşık% 10 altında olması, asgari oran değeri (Rmin) ayarlayın. </li><li> 12 kez Rmin hakkında Rmax ayarlayın. Rmin veya Rmax deneyler arasında karşılaştırma zor hale getirecek olarak karşılaştırmak için planladığınız bir değişiklik yapmayınız. Biz nadiren görüntüleme teçhizat Rmin ve Rmax değerleri değiştirin. </li><li> Görüntü planı alanları bulmak için otomatik sahne kullanın ve yazılımı kullanarak her alanın yerini kaydedebilir. Biz bir deney sırasında genellikle beş alan görüş topluyoruz. Bir alana otomatik sahne hamle, bir oran görüntü toplar ve bir sonraki alana geçer. </li><li> Dışında görmeyi beklediğiniz sinyallerin türüne göre 0.1 ile 10 saniye arasında görüntü toplamak için geçen zaman aralığı ayarlayın. </li><li> Denemeyi başlat. </li><li> Kalsiyum görüntüleme sistemi test ederken bir hücre içi kalsiyum artışı ve kalsiyum ücretsiz ekstrasellüler çözüm sebep olur, yüksek potasyum tyrodes (65 mM KCl) veya ionomycin (2μM) gibi uyaranlara kullanmak çok yararlı olur (EGTA ve BAPTA gibi kalsiyum tamponlar içeren ) kalsiyum konsantrasyonunu azaltmak olacaktır. </li></ol> Analiz Bir kez deney, tek tek hücrelerin veya hücre içinde ilgi bölgelerde zaman atlamalı kalsiyum ölçümleri oranı görüntüleri dönüştürmek isteyecektir. Bunu yapmak için: <ol><li> Faiz aracı (ROI) bölgede kalsiyum ölçmek için istediğiniz resmin alanları tanımlamak için kullanın. Bu hücre hücre gövdesi kapsayan en az bir yatırım getirisi genellikle yararlıdır. ROI&#39;ler tanımlarken, bu hücreleri deney seyri sırasında hareket etmez doğrulamak için görüntülerin film oynatmak için yararlıdır. </li><li> Her görüntünün her bir yatırım getirisi için zaman atlamalı oranı ölçümleri toplamak için yazılımı kullanın. </li><li> Bir analiz programı içine İthalat oranı ölçümleri. Belirli hücreler veya ROI&#39;ler, ortalama birden fazla hücreleri veya ROI&#39;ler için kalsiyum izlerini görmek ve kalsiyum değerleri intrasellüler oranı ölçümleri dönüştürmek için ihtiyacınız olacak. Daha az elverişli da kullanılabilmesine rağmen, bize bütün bu ortak analiz görevleri ancak Excel gibi diğer programlar yapmak için izin İgor Pro yazılmış makroları bir dizi kullanın. </li><li> Denklemi [Ca] = (RR min) / (R max-R) Sf * Kd kalsiyum konsantrasyonları hücre içi Fura-2 oranı değerleri dönüştürmek için kullanılabilir. [Ca] Rmin ve rmax kalsiyum konsantrasyonu, R Fura-2 340 / 380 oranı, sırasıyla kalsiyum veya kalsiyum doyurarak konsantrasyon varlığında yokluğunda 340/380 oranları; Sf * Kd. Fura-2 Kd (RT yaklaşık 120 nM) ve bir ölçeklendirme değeri ürünü. R Min, R Max ve Sf * Kd bunu ölçmek için bir in vivo veya in vitro kalibrasyon birini gerçekleştirmek için gerekli. In vivo kalibrasyon gerektiren birkarmaşık olabilir ama yama sıkma ve kalsiyum görüntüleme kombinasyonu da çok hassas. In vitro kalibrasyon kalibrasyon gerçekleştirmek için hangi çözüm ince bir tabaka oluşturmak için ince bir lamel ayırıcı ile ayrılmış iki lamelleri oluşan bir ev yapımı Kalibrasyon odası kullanılarak yapılabilir. Bir fonksiyonu olarak kalsiyum konsantrasyonlarının Fura-2 oranı değerleri ölçmek için en uygun yol, birden fazla tamponlu kalsiyum çözümleri ve Fura-2 serbest asit içeren bir kalibrasyon kiti kullanmaktır. Bu Invitrogen (Moleküler Problar) elde edilen ve kullanım için kesin talimatlar içeriyor olabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Grynkiewicz, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li><li>Lewis, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2++and+transmembrane+Ca2++current+in+human+leukemic+T+cells.">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li><li>Dolmetsch, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+between+intracellular+Ca2++stores+and+depletion-activated+Ca2++channels+generates+[Ca2+]i+oscillations+in+T+lymphocytes.">Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).</li></ol>

Bu sunumda PM Fura-2 kullanılarak kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için tüm adımları geçtiniz. Biz bir model olarak kortikal nöronların kullanılan ancak kalsiyum görüntüleme, gerçek zamanlı olarak çeşitli hücrelerden oluşan bir hücre içi kalsiyum ölçmek için kullanılan olabilir. Bu işlemi yaparken plastik görüntüleme zor kılan morötesi dalga boyunda, genellikle floresan olduğundan, plastik yerine cam lamelleri kullanmak önemlidir. Ayrıca, polyornithine ve laminin lamelleri ayrılmakta hücreleri ön...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Fura-2 AM</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F1221</td>
<td>Protect from light</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>DMSO</td>
<td>EM Science</td>
<td>MX1457-6</td>
<td>Keep in dry place to prevent hydration</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Albumin from bovine serum</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8022-100G</td>
<td>Store at 4&#176;</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Imaging Chamber</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>Model RC-20H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>Eclipse TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Potassium chloride</td>
<td>SIGMA</td>
<td>P9333-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Calibration Kit</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>F6774</td>
<td>Protect from light</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

calcium imaging of cortical neurons using fura-2 am

Kalsiyum görüntüleme kültürlü hücrelerde kalsiyum sinyalleri ölçmek için kullanılan yaygın bir tekniktir. Kalsiyum görüntüleme teknikleri, Ca2 + iyonları bağlama yanıt spektral özelliklerini değiştirmek BAPTA-temelli organik molekülleri kalsiyum göstergesi boyalar, yararlanmak. Kalsiyum göstergesi boyalar, iki kategoriye Fura-2 ve Hint-1 ve Fluo-4 gibi tek bir dalga boyu boyalar gibi oran-metrik boyalar ayrılır. Oranı-metrik boyalar, hücre içi kalsiyum konsantrasyonu farklı dalga boylarında floresans emisyon veya uyarma oranının belirlenmesine olanak sağlamıştır, kalsiyum yanıt uyarma ya da kendi emisyon spektrumları değişir. Tek bir dalga boyu probları üzerinden oran-metrik boyalar kullanarak ana avantajı oranı sinyal boya konsantrasyonu, aydınlatma yoğunluğu ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonu bu eserler bağımsız belirlenecek sağlayan optik yol uzunluğu bağımsız olmasıdır. En sık görülen kalsiyum göstergelerin biri bağlayıcı kalsiyum yanıt olarak bir emisyon 505 nM ve 380 nm 340 nm eksitasyon tepe tepe Fura-2,. İşte biz, nöronlar ve diğer Uyarılabilir hücreler hücre içi kalsiyum yükselmeler ölçmek için Fura-2 kullanımı açıklanmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM at JoVE.com

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Kalsiyum sinyalleri gen ekspresyonu, hayatta kalma ve farklılaşma dahil olmak üzere pek çok hücresel süreçlerinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada Fura-02:00 kullanarak kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için nasıl göstermektedir. Kalsiyum görüntüleme, gerçek zamanlı ve sinyalizasyon kaskadlar düzenlenmesi hücre içi kalsiyum düzenlemeyi incelemek için değerli bir araçtır.

Kortikal nöronlar kullanarak Fura-02:00 Kalsiyum Görüntüleme

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

calcium-imaging-of-cortical-neurons-using-fura-2-am

Research

JoVE Journal

Biology

60.7K Görüntüleme.  Stanford University. Kalsiyum sinyalleri gen ekspresyonu, hayatta kalma ve farklılaşma dahil olmak üzere pek çok hücresel süreçlerinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada Fura-02:00 kullanarak kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için nasıl göstermektedir. Kalsiyum görüntüleme, gerçek zamanlı ve sinyalizasyon kaskadlar düzenlenmesi hücre içi kalsiyum düzenlemeyi incelemek için değerli bir araçtır.

Video: Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Mikroakışkan Aygıt compartmentalization E18 Kortikal Rat Nöronlar hazırlanması

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Biyoloji

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

Derin Kortikal Katmanlar bir micropism kullanarak in vivo Görüntüleme

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

Hedefli-esteraz ile ER Kalsiyum Doğrudan Görüntüleme Kaynaklı Boya Yükleme (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Kalsiyum Görüntüleme amacı, Hücre Yaralanma Ölçümler ve Adenoviral Enfeksiyon için Pankreas Asiner Hücreleri hazırlanması

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme<em&gt; Gaussia</em&gt; Lusiferaz SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Concurrent EEG and Functional MRI Recording and Integration Analysis for Dynamic Cortical Activity Imaging

Electroencephalography (EEG) and functional magnetic resonance imaging (fMRI) are two of the fundamental noninvasive methods for identifying brain activity. Multimodal methods have sought to combine the high temporal resolution of EEG with the spatial precision of fMRI, but the complexity of this approach is currently in need of improvement. The protocol presented here describes the recently developed spatiotemporal fMRI-constrained EEG source imaging method, which seeks to rectify source biases and improve EEG-fMRI source localization through the dynamic recruitment of fMRI sub-regions. The process begins with the collection of multimodal data from concurrent EEG and fMRI scans, the generation of 3D cortical models, and independent EEG and fMRI processing. The processed fMRI activation maps are then split into multiple priors, according to their location and surrounding area. These are taken as priors in a two-level hierarchical Bayesian algorithm for EEG source localization. For each window of interest (defined by the operator), specific segments of the fMRI activation map will be identified as active to optimize a parameter known as model evidence. These will be used as soft constraints on the identified cortical activity, increasing the specificity of the multimodal imaging method by reducing cross-talk and avoiding erroneous activity in other conditionally active fMRI regions. The method generates cortical maps of activity and time-courses, which may be taken as final results, or used as a basis for further analyses (analyses of correlation, causation, etc.) While the method is somewhat limited by its modalities (it will not find EEG-invisible sources), it is broadly compatible with most major processing software, and is suitable for most neuroimaging studies.

An EEG-fMRI multimodal imaging method, known as the spatiotemporal fMRI-constrained EEG source imaging method, is described here. The presented method employs conditionally-active fMRI sub-maps, or priors, to guide EEG source localization in a manner that improves spatial specificity and limits erroneous results.