세포 배양 전지는 기존 기술을 사용하여 성장 수 있지만 이미징 실험을하는 동안 분리 또는 이동에서 세포를 방지하기 위해 세포 접착제 (polylysine, polyornithine 또는 laminin과 같은)과 코팅 # 1 유리 coverslips에 도금해야합니다. 솔루션 칼슘 이미징 실험은 세포 배양 매체를 포함하여 생리 솔루션의 다양한 사용하여 수행할 수 있습니다. 이것은 솔루션이 크게 형광 배경을 증가 페놀 레드, 무료되었는지 확인하기 위해, 그러나, 중요합니다. 우리가 쉽게 만들어 뇌척수를 모방하고, 우리가 알부민 0.1 % 소 혈청 그것을 보충합니다 Tyrodes 솔루션을 사용합니다. 우리는 가게 운영 CRAC 채널을 활성화하기 위해 전압 게이 티드 칼슘 채널과 1μM Thapsigargin (DMSO 1 MM 재고) 또는 2μM Ionomycin (DMSO 1 MM 주식)을 활성화 60-90 MM 염화칼륨과 탈분극을 사용합니다. 그것은 칼슘 고도는 칼슘 유입에 의한 것을 표시하는 세포외 용액에서 칼슘을 제거하는 것이 편리합니다. 칼슘을 제거하면 그것은 이가의 양이온의 총 농도 (MG 2 + 및 CA 2 +) 상수.을 유지하기 위해 필요합니다 나트륨에 대한 칼륨을 대체하면 그것은 삼투 균형을 유지하기 위해 필요합니다. Tyrodes 솔루션 : <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 낮은 칼륨 2mM 칼슘 2 + Tyrodes (㎜) </td><td> 낮은 칼륨 0 칼슘 2 + Tyrodes (㎜) </td><td> 높은 칼륨 2mM 칼슘 2 + Tyrodes (㎜) </td><td> 높은 칼륨 0 칼슘 2 + Tyrodes (㎜) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 129 </td><td> 129 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 129 </td><td> 129 </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td> 25 </td></tr></tbody></table> NaOH와 7.4으로 산도를 조정 Fura - 2 칼슘 염료의 로딩 우리와 함께 세포를로드 acetoxy - 메틸 에스테르 Fura - 2 세포막에 걸쳐 diffuses 및 Fura - 2 무료 산성을 나타낼 세포 esterases로 드 esterified입니다 (Fura - 2 AM). Fura - 2 로딩에 대한 정확한 매개 변수는 세포 종류에 걸쳐 광범위하게 다릅니다. 4 μm의 15 2 시간 분 실온에서로드 테스트에서 시대의 다양한 로딩 솔루션 세포를 잠복기하고 - 우리는 1에서 성난 Fura - 2의 여러 농도를 포함하는 여러 로딩 솔루션을 준비하여 다양한 조건을 테스트하는 것이 좋습니다 37 데그에서. 대뇌 피질의 뉴런에 단순 프로토콜은 아래 주어집니다 : <ol><li> 첫째, Invitrogen에서 사용할 수 50μg 유리병에 DMSO의 50μl를 추가하여 Fura - 2 AM 재고가 1 ㎜를 준비합니다. 그것을 질소하에 포장 건조 DMSO를 사용하는 것이 중요하고 그것은 DMSO의 수화을 방지하기 위해 심장을 펑쳐링하여 바늘로 DMSO를 제거하는 것이 필요합니다. 준비 후 Fura - 2 오전 솔루션은 어두운 건조한 장소에 보관하십시오. Fura - 2는 24 시간 동안 RT에서 DMSO에 안정 오전에 안정 - 몇 개월 동안 건조한 용기에 20도. </li><li> 37 데그에 따뜻한 15 ML 원뿔 튜브로 문화 미디어 나누어지는 두 MLS. 및 Fura - 2의 2μl을 추가 Fura - 2 AM 솔루션 1μM를 생성 재고입니다. 1 분 적극적으로 소용돌이 솔루션입니다. </li><li> 35mm 조직 문화 요리에 로딩 솔루션을 전송하고 접시에 세포로 coverslip을 전송. </li><li> 어두운 인큐베이터에서 30 분 동안 37도에서 뉴런을 품어. 부화 정확하게 시간. </li><li> Fura - 2 AM없이 조직 문화 미디어 2 MLS를 포함하는 35mm 요리를 준비합니다. 새 접시에 로딩 솔루션과 장소에서 coverslip을 제거합니다. </li><li> 이미징 챔버에 coverslip를 탑재합니다. 35mm 요리에서 coverslip을 제거하고 빠르게 세포의 건조를 방지해야하는 챔버에 탑재합니다. 우리는 아래와 샌드위치를​​ 형성 상단에 장착하는 두 번째 coverslip에 장착할 수있는 세포를 포함하는 10mm coverslip을 허용 워너 계측기 제조 이미징 챔버를 사용합니다. 두 coverslips은 챔버를 통해 솔루션의 재관류를 허용 챔버의 양쪽 끝에 진공 챔버에 기름 두 튜브를 확보하고 있습니다. 입력 라인은 주사기에 연결하고 출력 라인은 진공 트랩에 연결된 흡입 라인에 의해납니다 잘 연결되어 있습니다. </li></ol> 현미경 우리는 크세논 아크 램프 (셔터 인 스트 루먼트), 자동 무대 (Ludl), 여기 필터 휠 (Ludl) 및 냉각 비용 - 부부 장치 (CCD) 카메라 (하마 마츠 Orka 갖춘 거꾸로 니콘 이클립스 TE2000 - U 현미경을 사용하여 II). 현미경은 매킨토시 COM에 의해 제어됩니다퓨터 열기 랩 소프트웨어 (순발력)를 실행. 여러 다른 소프트웨어 패키지 ratiometric 이미징 사용할 수 있습니다. 영상을 위해 40, 60 또는 NA가 1.2를 초과와 100x 니콘 플루어 오일 침지 목표를 사용합니다. 이미징 프로토콜 <ol><li> 현미경의 무대를 보정합니다. </li><li> 부하는 공기 거품의 형성을 방지하기 위해 돌보는 입력 라인에 솔루션을 Tyrodes. </li><li> 챔버에있는 거품의 형성을 방지하기 위해 간병, 다시 한 번 챔버를 통해 재관류 라인과 perfuse의 Tyrodes 솔루션에 챔버를 연결 </li><li> 목적에 기름 한 방울 장소 현미경 단계에 챔버를 배치하고 전달 빛을 사용하여 세포에 중점을두고 있습니다. </li><li> 340에서와 eyepieces를 사용하여 380 nm의에서 조명을 사용하여 세포의 형광을 검사합니다. 휴식 세포는 380에서 340에 희미 밝은해야합니다. 일반적으로 세포는 10 개 이상 또는 15 초 동안 자외선과 켜지지하지 않아야하며 여기 빛의 강도는 phototoxicity을 방지하기 위해 필터 중립적인 밀도 감소한다. </li><li> 카메라를 사용하여 세포를 검사하고 잘 340 nm의에서 조명 채도 아래 380 nm의에서 조명 및 채도 (하지만 포화되지 않음)에 가까운 이미지를 생성하는 카메라의 이득과 노출을 설정합니다. 가능하면 200ms 아래의 노출을 유지. 당신은 또한 배경을 변경하지 않는 한 번만 설정할 계획, 카메라 게인이나 노출을 변경하지 마십시오, RMin 및 RMax (아래 참조). </li><li> 각 파장에서 이미지를 수집하고 각 파장에 대한 이미지에 위치 다양한 배경의 강도를 측정하기 관심 (ROI) 도구의 영역을 사용합니다. </li><li> 평균 배경 값과 이미징 프로그램의 적절한 위치에 배경 값을 입력합니다. 배경 값이 분야에서 각 픽셀에서 빼는 것입니다. </li><li> 연습 비율 이미지를 수집하고 오직 세포 아니라 배경과 그 세포의 가장자리에 가까운 지역에 소음되지 않습니다을 포함하는 비율 이미지를 생성하여 각 파장에 대한 경계 값을 조정합니다. </li><li> 10 % 현장의 모든 세포의 가장 낮은 비율 아래로 최소 비율 값 (RMin)을 설정합니다. </li><li> 12 회 RMin에 대해되도록 RMax을 설정합니다. 당신이 비교가 어렵게되므로 비교하는 실험 계획 간의 RMin 또는 RMax을 변경하지 마십시오. 우리는 거의 우리의 이미징 장비에 RMin 및 Rmax 값을 변경하지 않습니다. </li><li> 이 이미지를하려는 필드를 찾기 위해 자동으로 단계를 사용하여 소프트웨어를 사용하여 각 필드의 위치를​​ 기록합니다. 우리는 일반적으로 실험 도중 볼 다섯 분야를 수집합니다. 필드에 자동으로 무대의 움직임은 비율 이미지를 수집하고 다음 필드로 이동합니다. </li><li> 떨어져 보는 기대되는 신호의 종류에 따라 0.1 10 초 사이에 이미지를 수집하기 위해 시간 경과 간격을 설정합니다. </li><li> 실험을 시작합니다. </li><li> 칼슘 이미징 시스템을 테스트를 할 때 그것은 세포내 칼슘 증가와 칼슘을 무료로 세포 솔루션을 일으킬 것입니다 높은 칼륨의 tyrodes (65 MM KCl) 또는 ionomycin (2μM)과 같은 자극을 사용하는 것이 유용입니다 (EGTA 및 BAPTA 같은 칼슘 버퍼를 포함하는 것입니다 ) 그것은 칼슘 농도를 줄일 수 있습니다. </li></ol> 분석 일단 실험은 세포 내의 개별 셀 또는 관심있는 지역에 대한 시간 저속 칼슘 측정에 비율 이미지의 집합을 변환하는 것이 좋습니다 완료됩니다. 이 작업을 수행하려면 : <ol><li> 당신은 칼슘을 측정하고자하는 이미지의 영역을 정의에 관심이 도구 (ROI)의 영역을 사용합니다. 그것은 세포의 세포 시체를 포함 적어도 한 투자 수익 (ROI)을 가지고 일반적으로 유용합니다. 로아을 정의할 때, 그것은 세포 실험의 과정 중에 이동하지 않도록 확인하는 이미지의 동영상을 재생하는 데 유용합니다. </li><li> 각 이미지의 각 투자 수익 (ROI) 시간 - 저속 비율 측정을 수집하는 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 분석 프로그램에 비율 측정을 가져옵니다. 당신은 특정 세포 또는 로아, 평균 다중 셀 또는 로아에 대한 칼슘 성분을 확인하고 칼슘 가치를 세포에 대한 비율 측정을 변환해야합니다. 이하 편리도 사용할 수 있지만 우리는, 우리 모두가 이러한 일반적인 분석 작업을하지만, Excel과 같은 다른 프로그램을 수행할 수 있습니다 이고르 프로로 작성된 매크로의 집합을 사용합니다. </li><li> 방정식 [칼슘] = (RR 분) / (R 최대 - R) SF * KD는 칼슘 농도를 세포에 Fura - 2 비율로 값을 변환하는 데 사용할 수 있습니다. [칼슘] 칼슘 농도는, R은 Fura - 2 380분의 340의 비율이며, RMin 및 RMax는 각각 칼슘의 부재 또는 칼슘의 포화 농도의 존재에 380분의 340 비율되며 그리고 SF * KD입니다 Fura - 2의 KD (RT에서 약 12​​0 nm의)과 스케일링 값의 제품입니다. R 분, R 맥스와 SF * KD을 측정하려면 체외 교정의 생체내 또는에서 중 수행하는 것이 필요합니다. 생체내 교정에 필요한복잡하지만 수있는 패치 클램핑 및 칼슘 이미징의 결합도 매우 정확합니다. 관내 교정에서 교정을 수행하기 위해있는 솔루션의 얇은 레이어를 생성하는 얇은 coverslip 스페이서로 구분이 coverslips 구성된 집에서 만든 교정 챔버를 사용하여 수행할 수 있습니다. 칼슘 농도의 함수로 Fura - 2 비율 값을 측정하는 가장 편리한 방법은 여러 개의 버퍼 칼슘 솔루션 및 Fura - 2 무료 산성을 포함 교정 키트를 사용하는 것입니다. 이들은 Invitrogen (분자 프로브)에서 얻은 및 사용에 대한 정확한 지침을 포함할 수 있습니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Grynkiewicz, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li><li>Lewis, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2++and+transmembrane+Ca2++current+in+human+leukemic+T+cells.">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li><li>Dolmetsch, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+between+intracellular+Ca2++stores+and+depletion-activated+Ca2++channels+generates+[Ca2+]i+oscillations+in+T+lymphocytes.">Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).</li></ol>

이 프레 젠 테이션에서 우리는 AM Fura - 2를 사용하여 칼슘 이미징을 수행하는 모든 단계를 통과했습니다. 우리는 모델로 대뇌 피질의 뉴런을 사용하지만, 칼슘 이미징은 세포의 다양한 실시간으로 세포 내 칼슘을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 그것은 플라스틱 종종 영상이 어려운하게 자외선 파장에서 형광 있기 때문에, 대신에 플라스틱 유리 coverslips를 사용하는 것이 중요합니다. 또한, ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Fura-2 AM</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F1221</td>
<td>Protect from light</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>DMSO</td>
<td>EM Science</td>
<td>MX1457-6</td>
<td>Keep in dry place to prevent hydration</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Albumin from bovine serum</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8022-100G</td>
<td>Store at 4&#176;</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Imaging Chamber</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>Model RC-20H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>Eclipse TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Potassium chloride</td>
<td>SIGMA</td>
<td>P9333-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Calibration Kit</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>F6774</td>
<td>Protect from light</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

calcium imaging of cortical neurons using fura-2 am

칼슘 이미징은 교양 세포의 칼슘 신호를 측정하는 데 유용합니다 일반적인 기법입니다. 칼슘 이미징 기술은 Ca2 + 이온의 바인딩에 대한 응답으로 자신의 분광 특성을 변경 BAPTA 기반 유기 분자 칼슘 지표 염료의 활용. 칼슘 표시기 염료는 두 가지 범주, Fura - 2 및 인도 1 Fluo - 4와 같은 단일 파장 염료와 같은 비율 - 통계 염료에 빠지다. 비율 - 통계 염료는 세포 내 칼슘의 농도가 서로 다른 파장의 형광 방출이나 여기의 비율에서 결정 수 있도록, 칼슘에 대한 응답으로 자신의 여기 또는 발광 스펙트럼 중 하나를 변경합니다. 단일 파장 프로브를 통해 비율 - 통계 염료를 사용하여의 주요 장점은 비율 신호가 염료 농도, 조도, 그리고 세포 내 칼슘의 농도가 독립적으로 이러한 유물을 결정 수 있도록 광학 경로 길이의 독립적이다. 가장 일반적인 칼슘 지표 중 하나는 바인딩 칼슘에 대한 응답으로 방출 505 NM에서 피크와 380 nm의 변경 사항 340 nm의 여기에서 그 피크가 Fura - 2입니다. 여기 우리는 뉴런과 다른 고르기 세포의 세포내 칼슘 고도를 측정하는 Fura - 2의 사용을 설명합니다.

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Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

칼슘 신호는 유전자 발현, 생존과 분화 등 많은 세포 과정에 중요한 역할을한다. 여기 Fura - 2 오전 사용하여 칼슘 이미징을 수행하는 방법을 보여줍니다. 칼슘 이미징은 실시​​간 신호 폭포 자사의 규제에 세포 내 칼슘의 규정을 연구하기위한 귀중한 도구입니다.

Fura - 2 오전 사용하여 두피 뉴런의 칼슘 이미징

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

calcium-imaging-of-cortical-neurons-using-fura-2-am

Research

JoVE Journal

Biology

60.6K 조회수.  Stanford University. 칼슘 신호는 유전자 발현, 생존과 분화 등 많은 세포 과정에 중요한 역할을한다. 여기 Fura - 2 오전 사용하여 칼슘 이미징을 수행하는 방법을 보여줍니다. 칼슘 이미징은 실시​​간 신호 폭포 자사의 규제에 세포 내 칼슘의 규정을 연구하기위한 귀중한 도구입니다.

비디오: Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Microfluidic 장치에서 Compartmentalization에 대한 E18 두피 랫 뉴런 준비

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

연구

생물학

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  Vital fluorescent probes, particularly green fluorescent protein (GFP) have revolutionized cell biology stemming from the ability to label specific intracellular compartments and cellular structures. For example, the live imaging of GFP (and its spectral variants) chimeras have allowed for a dynamic 
analysis of the cytoskeleton, organelle transport, and membrane dynamics in a multitude of organisms and cell types [1-3].  Although live imaging has become prevalent, this approach still poses many technical challenges, particularly in primary cultured neurons.  One challenge is the expression of GFP-tagged proteins in post-mitotic neurons; the other is the ability to capture fluorescent images while minimizing phototoxicity, photobleaching, 
and maintaining general cell health.  Here we provide a protocol that describes a lipid-based transfection method that yields a relatively low transfection rate (~0.5%), however is ideal for the imaging of fully polarized neurons.  A low transfection rate is essential so that single axons and dendrites can be characterized as to their orientation to the cell body to confirm directionality of transport, i.e., anterograde v. retrograde.  Our approach to imaging 
GFP expressing neurons relies on a standard wide-field fluorescent microscope outfitted with a CCD camera, image capture software, and a heated imaging chamber. We have imaged a wide variety of organelles or structures, for example, dense-core vesicles, mitochondria, growth cones, and actin without any special optics or excitation requirements other than a fluorescent light source. Additionally, spectrally-distinct, fluorescently 
labeled proteins, e.g., GFP and dsRed-tagged proteins, can be visualized near simultaneously to characterize co-transport or other coordinated cellular events.  The imaging approach described here is flexible for a variety of imaging applications and can be adopted by a laboratory for relatively little cost provided a microscope is available.

Live cell imaging is of particular utility when studying the dynamics of organelle trafficking. Here we describe a protocol for live imaging of dense-core vesicles in cultured neurons using wide-field fluorescence microscopy. This protocol is flexible and can be adapted to image other organelles such as mitochondria, endosomes, and peroxisomes.

기본 교양 Hippocampal 신경에 덴스 코어 Vesicles의 라이브 영상

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

Microprism를 사용하여 딥 두피 레이어의 생체내 이미징에서

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

대상 - 에스테르 가수 분해 효소와 ER 칼슘의 직접 이미징 유발 염료 로딩 (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Concurrent EEG and Functional MRI Recording and Integration Analysis for Dynamic Cortical Activity Imaging

Electroencephalography (EEG) and functional magnetic resonance imaging (fMRI) are two of the fundamental noninvasive methods for identifying brain activity. Multimodal methods have sought to combine the high temporal resolution of EEG with the spatial precision of fMRI, but the complexity of this approach is currently in need of improvement. The protocol presented here describes the recently developed spatiotemporal fMRI-constrained EEG source imaging method, which seeks to rectify source biases and improve EEG-fMRI source localization through the dynamic recruitment of fMRI sub-regions. The process begins with the collection of multimodal data from concurrent EEG and fMRI scans, the generation of 3D cortical models, and independent EEG and fMRI processing. The processed fMRI activation maps are then split into multiple priors, according to their location and surrounding area. These are taken as priors in a two-level hierarchical Bayesian algorithm for EEG source localization. For each window of interest (defined by the operator), specific segments of the fMRI activation map will be identified as active to optimize a parameter known as model evidence. These will be used as soft constraints on the identified cortical activity, increasing the specificity of the multimodal imaging method by reducing cross-talk and avoiding erroneous activity in other conditionally active fMRI regions. The method generates cortical maps of activity and time-courses, which may be taken as final results, or used as a basis for further analyses (analyses of correlation, causation, etc.) While the method is somewhat limited by its modalities (it will not find EEG-invisible sources), it is broadly compatible with most major processing software, and is suitable for most neuroimaging studies.

An EEG-fMRI multimodal imaging method, known as the spatiotemporal fMRI-constrained EEG source imaging method, is described here. The presented method employs conditionally-active fMRI sub-maps, or priors, to guide EEG source localization in a manner that improves spatial specificity and limits erroneous results.

동시 뇌 파와 기능적 MRI 기록과 동적 대뇌 피 질의 활동 영상에 대 한 통합 분석

Electroencephalography (EEG) and functional magnetic resonance imaging (fMRI) are two of the fundamental noninvasive methods for identifying brain ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Zebrafish 독도에서 단일 셀 해상도 칼슘 이미징 사용 하 여 베타 세포 기능 분석

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...