Cell Culture Die Zellen können gewachsen mit etablierten Techniken hergestellt werden, sondern muss sich auf # 1 Deckgläser mit einem zellulären Selbstklebend (wie Polylysin, Polyornithin oder Laminin) zu den Zellen von Ablösen oder Verschieben während der Bildgebung Experimente zu verhindern beschichtet werden. Lösungen Kalzium-Imaging Experimente können mit Hilfe einer Vielzahl von physiologischen Lösungen wie Zellkulturmedien werden. Es ist jedoch wichtig, um sicherzustellen, dass die Lösungen frei von Phenolrot, das erhöht die fluoreszierenden Hintergrund. Wir verwenden Tyrodes Lösung, die leicht gemacht wird und Mimik Liquor, und wir ergänzen sie mit 0,1% Rinderserumalbumin. Wir verwenden Depolarisation mit 60-90 mm Kaliumchlorid Spannung Calciumkanäle und 1 &amp;mgr; Thapsigargin (1 mM Lager in DMSO) oder 2 um Ionomycin (1 mM Lager in DMSO) aktivieren zu speichern betrieben CRAC Kanäle zu aktivieren. Es ist oft zweckmäßig, Calcium aus der extrazellulären Lösung, um zu zeigen, dass Kalzium die Erhöhungen durch die Calcium-Einstrom zu entfernen. Beim Entfernen von Kalzium ist es notwendig, die gesamte Konzentration an zweiwertigen Kationen (Mg 2 + und Ca 2 +) konstant. Pflegen Wird die Behandlung von Kalium für Natrium ist es notwendig, das osmotische Gleichgewicht aufrecht zu erhalten. Tyrodes Lösungen: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Niedrige Kalium 2mM Ca 2 + Tyrodes (mM) </td><td> Niedrige Kalium 0 CA 2 + Tyrodes (mM) </td><td> Hohe Kalium 2mM Ca 2 + Tyrodes (mM) </td><td> Hohe Kalium 0 CA 2 + Tyrodes (mM) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 129 </td><td> 129 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 129 </td><td> 129 </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td> 25 </td><td> 25 </td></tr></tbody></table> Der pH-Wert auf 7,4 mit NaOH Lädt der Fura-2 Calcium-Farbstoff Wir Wägezellen mit Acetoxy-Methyl-Ester Fura-2 (Fura-2 AM), die durch die Zellmembran diffundiert und ist de-verestert durch zelluläre Esterasen zu Fura-2 freie Säure zu erhalten. Die genauen Parameter für Fura-2 Beladung variieren von Zelltypen. Wir empfehlen, verschiedene Bedingungen durch die Vorbereitung zahlreichen Be-Lösungen, die ein Vielfaches Konzentrationen von Fura-2 tobt 1 bis 4 uM, Inkubation von Zellen in der Be-Lösung für eine Vielzahl von Zeiten zwischen 15 Minuten bis 2 Stunden und Prüfung der Beladung bei Raumtemperatur und bei 37 Grad. Ein vereinfachtes Protokoll für kortikalen Neuronen ist unten angegeben: <ol><li> Zuerst bereiten Sie die 1 mM Fura-2 AM Lager, indem 50 ul DMSO zu einer 50 Mikrogramm Fläschchen von Invitrogen erhältlich. Es ist wichtig, trockenem DMSO unter Stickstoff verpackt verwenden und es ist notwendig, um das DMSO mit einer Nadel entfernen durch Punktion des Septums zur Hydratation des DMSO zu verhindern. Nach der Vorbereitung der Fura-2 AM-Lösung halten es in einem dunklen, trockenen Ort. Fura-2 AM in DMSO bei RT stabil für 24 Stunden und ist stabil - 20 Grad in einem trockenen Behältnis für mehrere Monate. </li><li> Aliquot 2 ml Kulturmedium in eine 15 ml konischen Rohr, warm bis 37 Grad. und fügen 2μl von Fura-2 AM Lager zu einer 1 &amp;mgr; Fura-2 AM-Lösung zu generieren. Vortex die Lösung 1 Minute kräftig. </li><li> Übertragen Sie die Be-Lösung für ein 35 mm Gewebe-Kulturschale und übertragen Sie die Deckgläschen mit den Zellen in die Schüssel. </li><li> Inkubieren Sie die Neuronen bei 37 Grad 30 Minuten lang in einem dunklen Brutkasten. Die Zeit der Inkubation genau. </li><li> Bereiten Sie eine 35 mm Schale mit 2 ml Gewebekultur-Medien ohne Fura-2 AM. Entfernen Sie das Deckglas aus dem Laden-Lösung und in der neuen Schale. </li><li> Montieren Sie das Deckglas auf dem Imaging-Kammer. Entfernen Sie das Deckglas aus den 35 mm-Schale und schnell auf den Messschacht stellen, um Austrocknen der Zellen zu verhindern montieren. Wir verwenden ein bildgebendes Kammer von Warner Instruments hergestellt, dass ein 10mm Deckglas mit den Zellen auf dem Boden und ein zweites Deckglas auf der Oberseite bildet ein Sandwich montiert werden gemountet werden können. Die beiden Deckgläser sind mit Vakuum-Fett auf der Kammer und zwei Röhren an beiden Enden der Kammer sicherte damit für die Perfusion der Lösungen durch die Kammer. Die Eingabezeile ist mit einer Spritze verbunden und der Ausgang Linie ist es, eine gut, dass durch eine Saugleitung angeschlossen, um ein Vakuum Falle geleert ist. </li></ol> Das Mikroskop Wir verwenden eine umgekehrte Nikon Eclipse TE2000-U-Mikroskop mit einer Xenon-Bogenlampe (Sutter Instruments), ein automatisiertes Stufe (Ludl), einer Anregung Filterrad (Ludl) und einer gekühlten Charge-Coupled Device (CCD)-Kamera (Hamamatsu Orka ausgestattet II). Das Mikroskop wird von einem Macintosh com gesteuertputer läuft Open Lab Software (Improvisation). Mehrere andere Software-Pakete stehen für ratiometrische Bildgebung. Für die Bildgebung verwenden wir 40, 60 oder 100x Nikon Fluor Ölimmersionsobjektive mit einer NA von mehr als 1,2. Imaging Protocol <ol><li> Kalibrieren Sie den Mikroskoptisch. </li><li> Laden Tyrodes Lösung in die Eingabezeile darauf achten, dass die Bildung von Luftblasen zu verhindern. </li><li> Schließen Sie die Kammer auf die Perfusion Linien und perfuse Tyrodes Lösung durch die Kammer wieder, kümmert sich um die Bildung von Luftblasen in der Kammer zu verhindern </li><li> Geben Sie einen Tropfen Öl auf das Ziel, Ort der Kammer auf dem Mikroskoptisch und konzentrieren sich auf die Zellen im Durchlicht. </li><li> Untersuchen Sie die Fluoreszenz der Zellen mit der Beleuchtung bei 340 und bei 380 nm mit der Okulare. Ruhende Zellen sollten dim bei 340 und hell bei 380. Im Allgemeinen sollten die Zellen nicht mit UV-Licht für mehr als 10 oder 15 Sekunden beleuchtet werden und die Intensität des Anregungslichtes sollte mit einem Graufilter zu Phototoxizität verhindern reduziert werden. </li><li> Die Zellen werden mit der Kamera und stellen Sie die Verstärkung und Belichtungszeit der Kamera auf ein Bild, das nahe an der Sättigung (aber nicht gesättigt), wenn bei 380 nm beleuchtet und auch unterhalb der Sättigung, wenn bei 340 nm beleuchtet wird zu generieren. Halten Sie die Exposition unter 200 ms, wenn möglich. Einmal eingestellt, ändern nichts an der Kamera zu gewinnen oder Exposition, es sei denn Sie verändern auch den Hintergrund zu planen, Rmin und Rmax (siehe unten). </li><li> Sammeln Sie ein Bild bei jeder Wellenlänge und nutzen Sie die Region of Interest (ROI)-Tool, um die Intensität der Hintergrund in einer Vielzahl von Orten zu messen in den Bildern für jede Wellenlänge. </li><li> Durchschnittliche Hintergrund Werte und geben Sie den Hintergrund-Werte in die entsprechenden Stellen in der Imaging-Programm. Der Hintergrund Wert wird von jedem Pixel auf dem Gebiet abgezogen werden. </li><li> Sammeln Sie eine Praxis-Verhältnis Bild und stellen Sie die Grenzwerte für jede Wellenlänge ein Verhältnis Bild, dass nur die Zellen und nicht der Hintergrund und das ist nicht in der Region in der Nähe der Ränder der Zellen lauten gehören zu generieren. </li><li> Stellen Sie die minimale Verhältniswert (Rmin) auf etwa 10% unter dem niedrigsten Verhältnis von einer beliebigen Zelle in dem Feld sein. </li><li> Stellen Sie die Rmax etwa 12-fache des Rmin werden. Ändern Sie nicht die Rmin oder Rmax zwischen den Experimenten, dass Sie planen, zu vergleichen, da sie den Vergleich schwierig. Wir selten ändern Rmin und Rmax Werte auf unsere Imaging-rig. </li><li> Verwenden Sie die automatische Bühne, um die Felder, die Sie planen, Bild zu finden, und notieren Sie den Speicherort der einzelnen Felder mit Hilfe der Software. Wir sammeln in der Regel fünf Felder der Blick während eines Experiments. Die automatisierte Bühne bewegt, um ein Feld, sammelt ein Verhältnis Bild und bewegt sich auf das nächste Feld. </li><li> Richten Sie den Zeitraffer-Intervall, um Bilder zwischen 0,1 und 10 Sekunden auseinander, je nach der Art der Signale, die Sie erwarten zu sehen, zu sammeln. </li><li> Starten Sie das Experiment. </li><li> Bei der Prüfung der Kalzium-Imaging-System ist es oft nützlich, auf Reize wie hohe Kalium Tyrodes (65 mM KCl) oder Ionomycin (2 um), die einen intrazellulären Calcium-Anstieg und Kalzium freien extrazellulären Lösung führen wird verwenden, wird (mit dem Kalzium-Puffer wie EGTA und BAPTA ), das reduziert die Calcium-Konzentration. </li></ol> Analyse Nachdem das Experiment abgeschlossen ist, wollen die Menge der Ratio-Bildern in Zeitraffer-Kalzium-Messungen konvertieren für einzelne Zellen oder Regionen von Interesse innerhalb der Zellen. Um dies zu tun: <ol><li> Verwenden Sie die Region of Interest-Werkzeug (ROI) auf die Bereiche des Bildes, in dem Sie Kalzium Maß zu definieren. Es ist generell nützlich, um mindestens einen ROI, dass die Zellkörper der Zelle abdeckt. Bei der Definition der ROIs, ist es sinnvoll, den Film der Bilder, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht im Laufe des Experiments zu bewegen spielen. </li><li> Mit der Software können Zeitraffer-Verhältnis Messungen für jede ROI in jedem Bild zu sammeln. </li><li> Import das Verhältnis Messungen in ein Analyse-Programm. Sie müssen die Calcium-Spuren für bestimmte Zellen oder ROIs, durchschnittlich mehrere Zellen oder ROIs und wandelt das Verhältnis Messungen Calcium-Werte intrazellulär. Wir verwenden eine Reihe von Makros in Igor Pro geschrieben, die uns all diese gemeinsamen Analyse Aufgaben, sondern auch andere Programme wie Excel erlauben, wenn auch weniger komfortabel auch verwendet werden können. </li><li> Die Gleichung [Ca] = (RR min) / (R max-R) Sf * Kd kann der Fura-2-Ratio-Werte zu konvertieren intrazellulären Kalziumkonzentration werden. [Ca] ist der Calcium-Konzentration, R der Fura-2 340/380 Verhältnis ist, sind Rmin und Rmax die 340/380 Verhältnisse in Abwesenheit von Calcium oder in Gegenwart von einer sättigenden Konzentration von Kalzium-bzw. und Sf * Kd ist das Produkt der Kd von Fura-2 (ca. 120 nM bei RT) und einen Skalierungswert. Zur Messung R Min, R Max und Sf * Kd ist es notwendig, entweder eine In-vivo-oder in vitro-Kalibrierung. In-vivo-Kalibrierung erfordert eineKombination von Patch-Clamp-und Kalzium-Imaging, die kompliziert, kann aber auch sehr präzise. In-vitro-Kalibrierung kann mit einem hausgemachten Kalibrierkammer, die aus zwei Deckgläsern mit einer dünnen Deckglas spacer getrennt, um eine dünne Schicht der Lösung, in der die Kalibrierung zu erzeugen besteht. Die bequemste Methode zur Messung der Fura-2-Ratio-Werte als Funktion der Calcium-Konzentrationen ist es, ein Kalibrierungs-Kit, das mehrere gepufferte Calcium-Lösungen und Fura-2 freie Säure enthalten, verwenden. Diese können von Invitrogen (Molecular Probes) erhältlich und enthalten genaue Anweisungen für die Verwendung. </li></ol>

<ol>
	<li>Grynkiewicz, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li><li>Lewis, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2++and+transmembrane+Ca2++current+in+human+leukemic+T+cells.">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li><li>Dolmetsch, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+between+intracellular+Ca2++stores+and+depletion-activated+Ca2++channels+generates+[Ca2+]i+oscillations+in+T+lymphocytes.">Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).</li></ol>

In dieser Präsentation haben wir alle Schritte für die Durchführung von Kalzium-Imaging mit Fura-2 AM gegangen. Wir verwendeten kortikalen Neuronen als Modell, sondern Kalzium-Imaging kann zur intrazellulären Calcium in Echtzeit gemessen in einer Vielzahl von Zellen sein. Wenn Sie dieses Verfahren ist es wichtig, Deckgläser statt Kunststoff zu verwenden, da Kunststoff wird häufig fluoreszierende bei ultravioletten Wellenlängen, die Bildgebung erschwert. Auch ist es wichtig, pre-Beschichtung der Deckgläser mit Polyornithin und Lamini...

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		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Fura-2 AM</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F1221</td>
<td>Protect from light</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>DMSO</td>
<td>EM Science</td>
<td>MX1457-6</td>
<td>Keep in dry place to prevent hydration</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Albumin from bovine serum</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8022-100G</td>
<td>Store at 4&#176;</td>
</tr>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Imaging Chamber</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>Model RC-20H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>Eclipse TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Potassium chloride</td>
<td>SIGMA</td>
<td>P9333-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>Calibration Kit</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>F6774</td>
<td>Protect from light</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

calcium imaging of cortical neurons using fura-2 am

Calcium-Bildgebung ist eine verbreitete Technik, die nützlich für die Messung Calcium-Signale in kultivierten Zellen ist. Kalzium-Imaging-Techniken nutzen Kalzium-Indikator-Farbstoffe, die BAPTA-basierte organische Moleküle, die ihre spektralen Eigenschaften in Reaktion auf die Bindung von Ca2 +-Ionen zu ändern sind. Calcium Indikatorfarbstoffe fallen in zwei Kategorien, ratio-metrischen Farbstoffe wie Fura-2 und Indo-1 und einer einzigen Wellenlänge Farbstoffe wie Fluo-4. Ratio-metrischen Farbstoffe ändern entweder ihre Anregung oder deren Emissionsspektren in Reaktion auf Calcium, so dass die Konzentration der intrazellulären Kalzium aus dem Verhältnis der Fluoreszenz-Emission oder Absorption bei verschiedenen Wellenlängen ermittelt werden. Der Hauptvorteil der Verwendung von ratio-metrischen Farbstoffe über einzelne Wellenlänge Sonden ist, dass das Verhältnis Signal unabhängig von der Farbstoffkonzentration, Beleuchtungsstärke und optische Weglänge ermöglicht die Konzentration der intrazellulären Calcium-unabhängig von dieser Artefakte zu bestimmen ist. Einer der häufigsten Calcium-Indikatoren ist Fura-2, die ein Emissionsmaximum bei 505 nm und ändert seine Anregung Spitzenwert von 340 nm bis 380 nm wurde als Reaktion auf Calcium-Bindung. Hier beschreiben wir die Verwendung von Fura-2 zur intrazellulären Calcium-Erhöhungen in Neuronen und anderen erregbaren Zellen zu messen.

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Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Calcium-Signale eine wichtige Rolle spielen in vielen zellulären Prozessen, einschließlich Genexpression, das Überleben und die Differenzierung. Hier zeigen wir, wie Kalzium-Imaging mit Fura-2 AM durchzuführen. Kalzium-Imaging ist ein wertvolles Werkzeug, um die Regulierung des intrazellulären Calcium in Echtzeit und seiner Regulation von Signalkaskaden zu untersuchen.

Calcium Imaging von kortikalen Neuronen mit Fura-2 AM

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

calcium-imaging-of-cortical-neurons-using-fura-2-am

Research

JoVE Journal

Biology

60.8K Aufrufe.  Stanford University. Calcium-Signale eine wichtige Rolle spielen in vielen zellulären Prozessen, einschließlich Genexpression, das Überleben und die Differenzierung. Hier zeigen wir, wie Kalzium-Imaging mit Fura-2 AM durchzuführen. Kalzium-Imaging ist ein wertvolles Werkzeug, um die Regulierung des intrazellulären Calcium in Echtzeit und seiner Regulation von Signalkaskaden zu untersuchen.

Serie: Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Vorbereitung E18 Kortikale Rattenneuronen für Kompartimentierung in einer mikrofluidischen Vorrichtung

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Forschung

Biologie

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2 / 3 der Mäuse

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

In-vivo-Imaging von Deep kortikalen Schichten mit einem MICROPRISMEN

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

Direct Imaging von Calcium ER mit Targeted-Esterase Induzierte Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Herstellung von Azinuszellen des Pankreas für die Zwecke von Calcium Imaging, Cell Verletzung Messungen und Adenovirus-Infektion

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Überwachung Endoplasmatischen Reticulum Calciumhomöostase Mit ein<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Die Messung von Calcium Schwankungen innerhalb des Retikulum von kultivierten glatten Muskelzellen Mit FRET-basierten konfokale Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Concurrent EEG and Functional MRI Recording and Integration Analysis for Dynamic Cortical Activity Imaging

Electroencephalography (EEG) and functional magnetic resonance imaging (fMRI) are two of the fundamental noninvasive methods for identifying brain activity. Multimodal methods have sought to combine the high temporal resolution of EEG with the spatial precision of fMRI, but the complexity of this approach is currently in need of improvement. The protocol presented here describes the recently developed spatiotemporal fMRI-constrained EEG source imaging method, which seeks to rectify source biases and improve EEG-fMRI source localization through the dynamic recruitment of fMRI sub-regions. The process begins with the collection of multimodal data from concurrent EEG and fMRI scans, the generation of 3D cortical models, and independent EEG and fMRI processing. The processed fMRI activation maps are then split into multiple priors, according to their location and surrounding area. These are taken as priors in a two-level hierarchical Bayesian algorithm for EEG source localization. For each window of interest (defined by the operator), specific segments of the fMRI activation map will be identified as active to optimize a parameter known as model evidence. These will be used as soft constraints on the identified cortical activity, increasing the specificity of the multimodal imaging method by reducing cross-talk and avoiding erroneous activity in other conditionally active fMRI regions. The method generates cortical maps of activity and time-courses, which may be taken as final results, or used as a basis for further analyses (analyses of correlation, causation, etc.) While the method is somewhat limited by its modalities (it will not find EEG-invisible sources), it is broadly compatible with most major processing software, and is suitable for most neuroimaging studies.

An EEG-fMRI multimodal imaging method, known as the spatiotemporal fMRI-constrained EEG source imaging method, is described here. The presented method employs conditionally-active fMRI sub-maps, or priors, to guide EEG source localization in a manner that improves spatial specificity and limits erroneous results.

Calcium Imaging von kortikalen Neuronen mit Fura-2 AM

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