نشكر زيهافيت فرانكل وTolchinsky ساندرا لتقديم المساعدة التقنية. وتدعم البحوث المتعلقة في هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم إسرائيل (1229-1207) والألمانية والإسرائيلية لمشاريع التعاون (DIP - DFG).

ويهدف البروتوكول التالي لتحليل سلاسل من السكر جليكوبروتينات الكلي أو من بروتين سكري محددة من الفائدة. هذا الإجراء هو في الأساس نفسه لكلا الحالتين مع إجراء تعديلات قليلة كما هو مذكور في جميع أنحاء البروتوكول. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوصفها الأيضية من N - مرتبطة glycans واحد يحتاج إلى استخدام الثقافة subconfluent من خلايا الثدييات نمت بين عشية وضحاها في صحن 90 مم لكل عينة (عينات قد تمثل نقطة زمنية مختلفة أو العلاج). هو الأمثل لهذا البروتوكول الخلايا NIH 3T3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجويع الخلايا للجلوكوز عن طريق حضانة في 5 مل من المتوسط ​​قبل حرارة (37 درجة مئوية) خالية من السكر الطازجة ، المزود مع FCS مدال 10 ٪ و 4 ملم لالبيروفات الصوديوم 5-15 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المتوسطة التجويع مع 1 مل من قبل حرارة (37 درجة مئوية) خالية من السكر تحتوي على 400 μCi المتوسطة من [2-3 H] المسمى مانوز (أقل من 65 تركيز يستخدم μCi / مليلتر بالنسبة لوضع العلامات على جليكوبروتينات الإجمالي) ، واحتضان الخلايا في نسيج الثقافة الظروف العادية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العلامات المتوسطة من كل عينة ، وإضافة بعناية 2 مل من برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية الى العينات المطابقة لنبض ووضعها على الجليد (ويشار إلى أن هذه العينات والبقول) ، في حين أن العينات المطابقة لمطاردة يلزم تشطف 3 مرات مع 2 مل من قبل حرارة (37 درجة مئوية) العادي المتوسط ​​ثقافة كاملة ، ومن ثم وضعها في حاضنة 2 أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية مع 5 مل من قبل حرارة متوسطة لفترات منتظمة لمطاردة المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف عينات نبض (وضعت في وقت سابق على الجليد) 3 مرات مع 2 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني. ثم يتم كشط الخلايا قبالة صحن في برنامج تلفزيوني مل 2 باستخدام مكشطة الخلية ، ووضعها في أنبوب إيبندورف 2 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قصيرة تدور في الخلايا 16000Xg (60-10 ثانية) ، تجاهل طاف بيليه وتجميد الخلايا في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ الخطوات 5 و 6 أيضا على عينات من مطاردة في نهاية الوقت مطاردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا من الثلاجة وليز لهم باضافة 300 ألف ميكرولتر من العازلة ، واحتضان vortexing لفترة وجيزة لمدة 20 دقيقة على الجليد ، أو في حالة تحليل جليكوبروتينات الكلي ، من خلال احتضان 20 دقيقة على الجليد مع B العازلة ، تليها صوتنة (4 مرات و 10 ثانية ، والحد الأقصى السعة) ، وتغلي ثم عينات ل5min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في lysates في 16000Xg لمدة 20 دقيقة في درجة مئوية 4 طاف لنقل أنبوب إيبندورف جديدة وتجاهل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان مجموع تحليل جليكوبروتينات ، انتقل إلى الترشيح الجزيئية وdeglycosylation (الخطوة 17). للمناعي للبروتين سكري H2A أظهر هنا ، إضافة 20l/sample من (Repligen) البروتين A - agarose تعليق الخرز 1:01 و 3 ميكروليتر / لدينا عينة من الأرانب ضد متعدد النسائل H2A المضادة للبروتين سكري المطلوب (الضد لدينا في مكافحة H2A المثال ) ، لطاف من الخطوة 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات المطلوبة لل4-16 ساعات في 4 درجات مئوية ، والخلط باستمرار دوران بطيء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار في حبات 16000Xg لمدة 30 ثانية ، وإزالة بعناية الفراغ طاف به. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الخرز ، وذلك بإضافة 500 ميكروليتر D العازلة وvortexing. تدور كما في الخطوة 12 وإزالة طاف. تكرار غسيل 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10μl العازلة تغيير طبيعة (مرفق مع عدة إندو NEB - H) إلى بيليه حبة وتغلى العينات لمدة 5 دقائق (عندما يتم تحليل البروتينات الكلية ، يتم تنفيذ deglycosylation على تصفية Microcon ، الخطوة 17). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار الخرز (16000Xg لمدة 30 ثانية) ، ونقل في أنبوب طاف إيبندورف جديدة. ثم تضاف 0.5μl إنزيم H إندو لكل عينة مع 10 ميكرولتر من المنطقة العازلة التفاعل (زودت أيضا مع عدة NEB إندو H) ، وحضنت العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفصل glycans المفرج عنهم من البروتينات ، ويتم تخفيف العينة 5 مرات مع الماء منزوع الأيونات ووضعها على رأس مرشح الجزيئي (Microcon Ultracel YM30) ، مع 30kDa قطع ، ثم طرد في 14000Xg لمدة 3 دقائق. تطبيق 50μl من الماء منزوع الأيونات والطرد المركزي تكرار العينات. ويتكرر هذا الاخفاق 2 مرات أكثر ، والحفاظ على التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كنت تحليل جليكوبروتينات مجموع تطبيق طاف للlysates (من الخطوة 9) لتصفية Microcon. غسل استخراج مع 100 ميكرولتر من E العازلة ، و 3 مرات عن طريق الطرد المركزي في 14000Xg المتكررة لمدة 3 دقائق. إضافة 3 ميكرولتر من 10X إندو العازلة رد فعل H و 1.5 ميكرولتر من أنزيم H إندو إلى retentate Microcon ، واحتضان لمدة 3 ساعات في 37 درجة مئوية. وeluted في glycans إصداره مع منزوع الأيونات الماء بنسبة 3 centrifugations المتكررة ، كما في الخطوة 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا رغبت في ذلك ، ثم يتم تحضين retentates من الخطوات 16 و 17 ، التي تحتوي على إندو H - مقاومة جليكوبروتينات مع 200mU من N - F غليكوزيداز في 15 ميكرولتر من C العازلة ، على 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. يتم شطف مع الماء منزوع الأيونات كما في الخطوة 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب يحتوي على رد فعل H إندو التدفق من خلال (الخطوات 16 و 17) في المكثف SpeedVacوالعينات الجافة تماما (يمكن القيام بذلك تصل إلى 45 درجة مئوية لتسريع هذه العملية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحضير العينات لHPLC ، resuspend الكريات الجافة في 12 ميكرولتر من المذيب HPLC (أسيتونتريل : المياه ، 60:40 ، 1 ٪ حامض الفوسفوريك). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط جهاز HPLC (متصلا إلى العمود Spherisorb) إلى تدفق مستمر من المذيب (1 مل / دقيقة) وضغط (قيمة معينة بين عامي 1000 و 2000 رطل) ، ومكان جامع الكسر لتغيير أنبوب كل 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل العينات في جهاز HPLC وبدء جمع جزء واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 48 كسور 1 مل من العينة وتشغيل كل من سلسلة من خليط oligosaccharide القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 500 ميكرولتر من كل جزء إلى قارورة التلألؤ ، وتخلط محتويات مع 3 مل من السوائل غير قابلة للامتزاج المياه التلألؤ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل وقراءة في قارورة عداد التلألؤ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم رسم حرف في الدقيقة قراءات بوصفها وظيفة من عدد الكسر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قيم الاجتماع التحضيري للمؤتمر خلال ذروة تمثل أنواع محددة غليكان على النحو التالي : 18-21 الكسور تتوافق مع M5 ، M6 لكسور 22-26 ، 27-31 لM7 الكسور ، الكسور إلى M8 32-35 ، 36-39 لكسور M9 ، 40-42 الكسور والكسور لG1M9 43-45 لG2M9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموع القيم CPM عن كسور في كل ذروة يعكس القيمة المطلقة من الأنواع غليكان محددة. من أجل التعويض عن حقيقة أن أكثر الأنواع التي تحتوي على مخلفات مانوز اكتساب مزيد من التسمية ، &quot;مبلغ المولي النسبي&quot; من كل الأنواع غليكان تحسب على النحو التالي : المبلغ المطلق من كل الأنواع غليكان هو مقسوما على عدد من البقايا مانوز أنه يحتوي . ثم يتم تقسيم هذه القيمة على مجموع المبالغ المولي النسبي من جميع الأنواع التي تم الحصول عليها غليكان للحصول على &quot;النسبة المئوية من مجموع&quot; لكل الأنواع غليكان محددة. </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td style="text-align:center;"> مطاردة (ح) </td><td style="text-align:center;"> 0 </td><td style="text-align:center;"> 4 </td></tr><tr><td> أصدرت مع H إندو (CPM) و </td><td> 90000 </td><td> 16800 </td></tr><tr><td> أصدرت مع N - F غليكوزيداز (CPM) ب </td><td> 20400 </td><td> 3900 </td></tr><tr><td> جليكوبروتينات في retentate (CPM) ج </td><td> 371700 </td><td> 127695 </td></tr><tr><td> Dolichol - oligosaccharides في retentate (CPM) د </td><td> 4350 </td><td> 540 </td></tr><tr><td> Dolichol - oligosaccharides في retentate (٪) ه </td><td> 1.4 ± 0.7 </td><td> 0.2 ± 0.2 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الافراج عن تحليل سلاسل السكر N - ترتبط deglycosidases وبحضور dolichol - oligosaccharides في عينات بروتين سكري. طبقنا الإجراء نبض مطاردة لlysate من خلايا NIH 3T3. بعد الترشيح Microcon ، أفرج عن المسمى N - oligosaccharides مرتبطة بشكل رئيسي مع H إندو بعد وضع العلامات نبض (نوع مانوز عالية) ومع مزيد من العلاج مع N - F غليكوزيداز بعد فترة المطاردة ، التي من شأنها أن تتوافق مع نوع معقد (غولجي المجهزة glycans) إندو oligosaccharides H مقاومة. هذا التحليل الكمي قرر أن dolichol - oligosaccharides ، تمثل جزءا لا يكاد يذكر من التسمية في retentate الأولي. ملاحظات : <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكانت الخلايا NIH 3T3 المسمى مع نبض [2-3 H] مانوز وطاردت مع متوسط ​​كاملة. بعد تحلل الخلايا والترشيح من خلال Microcon YM30 ، أفرج عن ارتفاع مانوز N - مرتبطة oligosaccharides من retentates بواسطة حضانة مع حاء إندو </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد حضنت ثم إندو H - مقاومة المواد في retentates Microcon من (أ) مع N - F غليكوزيداز oligosaccharides وأفرج عنه في عداد قياس التلألؤ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> retentates Microcon تم الحصول عليها في الفقرة (أ) قبل العلاج H إندو ، تم استخراج 4 مرات بالكلوروفورم : الميثانول : الماء لإزالة 10:10:03 glycolipids السلائف والمواد unextracted solubilized في 1N هيدروكسيد الصوديوم وعدها في عداد التلألؤ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتنقيته من Dolichol - oligosaccharides مقتطفات من صفها بأنها (ج) في (1) وتحسب في عداد التلألؤ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمعدل 3 في المئة من التجارب لdolichol - oligosaccharides (د) من المجموع في الاجتماع التحضيري للمؤتمر retentate (ج + د). </li></ol> ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. نبض مطاردة تحليل جليكوبروتينات مجموع NIH 3T3 في الخلايا غير المعالجة ، وبناء على تثبيط proteasomal 1H بعد وضع العلامات مع نبض [2-3 H] حصلنا على ملف تعريف المتوقع مع بعض glucosylatedالسلائف المتبقية (2 GLC مان 9 GlcNAc 2 (G2M9) وG1M9) ، ولكن معظم التسمية موجودة في M9 والأنواع M8 ، وهذا الأخير هو نتيجة لخفض السكر في كل واحد بقايا مانوز (الشكل 1 أ). تم الكشف عن أية مجانا السلائف مانوز الصغيرة أو غيرها ، مما يدل على شمولية عملية تنقية. بعد مطاردة طويلة بدلا 8h كان هناك المزيد من التشذيب واسعة النطاق إلى 6 - M7 وكمية صغيرة من M5 ، ولكن الأنواع الرئيسية لا تزال M9 وM8 (الشكل 1 ب). فإن كان قد تم مطاردة في وجود المانع proteasomal (30 ميكرومتر MG - 132) ، لم يكن هناك سوى تراكم بسيط من هذه الأنواع نفسها قلص (الشكل 1 جيم). <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. التحليل الكمي لسلاسل السكر من اراد ان الركيزة مقارنة جليكوبروتينات الإجمالي. (أ) في تجربة مشابهة لتلك الموجودة في الشكل 1 ، وحسبت المبالغ المولي النسبي لكل الأنواع oligosaccharide على أساس المحتوى مانوز. كان علينا تحويل القيم التي تم الحصول عليها عن كل حرف في الدقيقة الأنواع غليكان ، ثم تآمر في المئة من كل الأنواع النسبي لمجموع المبالغ الإجمالية المولي النسبي لجميع الحاضرين الأنواع بوصفها وظيفة من الوقت مطاردة لمدة متوسطها تجربتين (B) مماثلة (أ) إلا أن المفرج عنهم من glycans H2A الركيزة ASGPR اراد حللت بعد وضع العلامات النبض ومطاردة لمدة تصل إلى 4H ، في وجود أو عدم وجود المانع proteasomal MG - 132 (C) لمطاردة القيم 4H في الوجود من MG - 132 من (أ) و (B) لتتم مقارنة H2A ASGPR وتجمع بروتين سكري (D) ومخطط لسلسلة N - السكر مرتبط التشذيب العمليات في لائحة. عمليات التشذيب السكر التي تؤدي إلى 5 - M6 ترتبط البروتينات (R) التي تستهدف اراد مقارنة M9 - 8 على تلك التي للخروج إلى غولجي وخارجها. وتشير النتائج إلى أن يرتبط بعملية اراد مع مانوز تقليم N - glycans لانتاج الأنواع 5-6 مع بقايا مانوز المتبقية.

<ol>
	<li>Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+polyprenol-bound+saccharides+as+intermediates+in+glycoprotein+synthesis+in+liver.">The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).</li><li>Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+(ER)+mannosidase+I+is+compartmentalized+and+required+for+N-glycan+trimming+to+Man5-6GlcNAc2+in+glycoprotein+ER-associated+degradation.">Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).</li><li>Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum-associated+degradation+of+mammalian+glycoproteins+involves+sugar+chain+trimming+to+Man6-5GlcNAc2.">Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).</li><li>Hosokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+endoplasmic+reticulum+(ER)+degradation+of+misfolded+Null+Hong+Kong+alpha1-antitrypsin+by+human+ER+mannosidase+I.">Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I.</a> J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).</li><li>Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+misfolded+endoplasmic+reticulum+glycoproteins+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+determined+by+a+specific+oligosaccharide+structure.">Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).</li><li>Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+versus+secreted+forms+of+human+asialoglycoprotein+receptor+subunits.+Role+of+a+juxtamembrane+pentapeptide.">Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide.</a> J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).</li></ol>

تحليل نبض مطاردة glycans في الخلايا الحية مع الفصل HPLC يوفر طريقة لدراسة ديناميات التعديلات الهيكلية oligosaccharide طوال حياة بروتين سكري. هناك أدلة متزايدة على أن يتم تضمين هذه التعديلات في إنتاج الإشارات للطي ER ، ومراقبة الجودة ونظم الاتجار 2-5. ويمكن تطبيق الأسلوب ليس ف...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>600E Multisolvent delivery System controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>WAT062710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck Bioscience</td>
<td>1.0003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC503024 or 4208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5301 000.016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dialyzed Foetal Calf Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>04-011-1A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Modi&#xFB01;ed Eagle's Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Invitrogen Cell Culture</td>
<td>41965039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Modi&#xFB01;ed Eagle's Medium - glucose free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D5030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D1408</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA disodium salt (Titriplex Iii)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>1084180250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>p0703S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foetal Calf Serum (FCS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>04-001-1A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Frac-100 fraction collector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham Biosciences</td>
<td>18-1000-77</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>510720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer Life Sciences</td>
<td>NET570A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>474790</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-glycosidase F (1000 units/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11365177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-octylglucoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>O3757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NIH 3T3 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
<td>CRL-1658</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Opti-Flour</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer Life Sciences</td>
<td>6013199</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>79607</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P2714</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein A-Sepharose beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Repligen</td>
<td>IPA300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium deoxycholate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>30970</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-RAD</td>
<td>161-0301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium phosphate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>342483</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium pyruvate solution (100mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spherisorb NH2 Column, 5 &mu;m, 4.6 x 250 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>PSS831115</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BDH</td>
<td>306324N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sonics and Materials, Inc.</td>
<td>690-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NIH 3T3 stably expressing H2a 6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate, 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M3148</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

pulse-chase analysis of n-linked sugar chains from glycoproteins in mammalian cells

تعلق GLC<sub&gt; 3</sub&gt; مان<sub&gt; 9</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt; السلائف oligosaccharide البروتينية لالوليدة في لائحة مشتركة هو تعديل للبروتينات إفرازية. على الرغم من أن هذا التعديل كان متورطا في العديد من العمليات البيولوجية ، وجوانب إضافية من وظيفتها والناشئة ، مع الأدلة الأخيرة لدورها في إنتاج الإشارات لمراقبة جودة بروتين سكري والاتجار بها. وبالتالي ، يجري الظواهر المتصلة N - مرتبطة glycans وتجهيزها التحقيق بشكل مكثف. وقد تحسنت الأساليب التي تم تطويرها مؤخرا لتحليل البروتين إلى حد كبير من توصيف glycans N - يرتبط بروتين سكري. ومع ذلك ، فإنها لا توفر نظرة ثاقبة على ديناميات السكر معالجة سلسلة المعنية. لهذا ، تستخدم الملصقات وبروتوكولات تحليل نبض المطاردة التي عادة ما تكون معقدة وتعطي غلة منخفضة جدا. نحن هنا وصف طريقة بسيطة لعزل وتحليل عملية الأيض oligosaccharides N - يرتبط المسمى. ويستند البروتوكول المتعلق بوضع العلامات على الخلايا مع [2 --<sup&gt; 3</sup&gt; H] مانوز ، والافراج عن تغيير طبيعة تحلل الأنزيمي من oligosaccharides من البروتين إما immunoprecipitated تحديدا في المصالح أو من تجمع بروتين سكري العامة ، من خلال العلاجات متتابعة مع إندو H و N - F غليكوزيداز ، تليها الترشيح الجزيئي (Amicon). في هذا الأسلوب oligosaccharides معزولة كمدخل لتحليل HPLC ، والتي تسمح بالتمييز بين الهياكل غليكان المختلفة وفقا لعدد من وحدات أحادي السكاريد تتألف منهم ، مع قرار من أحادي السكاريد واحد. باستخدام هذه الطريقة تمكنا من دراسة عالية مانوز N - ربط التشكيلات oligosaccharide من مجموع جليكوبروتينات الخلية بعد نبض مطاردة في ظروف طبيعية وتحت تثبيط proteasome. وتمت مقارنة هذه الأوضاع لتلك التي حصلنا عليها من immunoprecipitated ER المرتبطة الركيزة (اراد) تدهورها. نتائجنا تشير الى ان معظم NIH 3T3 جليكوبروتينات الخلوية مستقرة نسبيا ، والتي قلصت معظم oligosaccharides لمان<sub&gt; 9-8</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt;. في المقابل ، يتم قطع اراد ان ركائز مستقرة للانسان<sub&gt; 6-5</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt; جليكوبروتينات وتحمل هذه الأنواع تتراكم على تثبيط تدهور proteasomal.

Watch this Scientific Journal Video about Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells at JoVE.com

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

نحن تصف طريقة لتحليل تحوير N - مرتبطة glycans خلال السنوات الاولى من حياة جليكوبروتينات بعد الحيوي في خلايا الثدييات. ويتحقق ذلك من خلال نبض مطاردة تحليل عملية الأيض glycans المسمى ، وإطلاق سراح من الأنزيمية جليكوبروتينات والفحص بواسطة HPLC.

نبض مطاردة تحليل سلاسل السكر N - الموصولة من جليكوبروتينات في خلايا الثدييات

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

pulse-chase-analysis-n-linked-sugar-chains-from-glycoproteins

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K Views.  Tel Aviv University. نحن تصف طريقة لتحليل تحوير N - مرتبطة glycans خلال السنوات الاولى من حياة جليكوبروتينات بعد الحيوي في خلايا الثدييات. ويتحقق ذلك من خلال نبض مطاردة تحليل عملية الأيض glycans المسمى ، وإطلاق سراح من الأنزيمية جليكوبروتينات والفحص بواسطة HPLC.

Video: Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

في تقطير التحت خلوية الموقع من خلايا الثدييات وغير ملتصقة منتسب -

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

تحليل مزدوج الجديلة إصلاح الحمض النووي (DSB) فاصل في خلايا الثدييات

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

esiRNA بعثة لفحص رني في خلايا الثدييات

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

تحليل حركية مرنا الصادرات النووية في خلايا الثدييات التي Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure. H1 is essential for mammalian development1 and regulates specific gene expression in vivo2-4. Among the highly conserved histone proteins, the family of H1 linker histones is the most heterogeneous group. There are 11 H1 subtypes in mammals that are differentially regulated during development and in different cell types. These H1 subtypes include 5 somatic H1s (H1a-e), the replacement H10, 4 germ cell specific H1 subtypes, and H1x5. The presence of multiple H1 subtypes that differ in DNA binding affinity and chromatin compaction ability6-9 provides an additional level of modulation of chromatin function. Thus, quantitative expression analysis of individual H1 subtypes, both of mRNA and proteins, is necessary for better understanding of the regulation of higher order chromatin structure and function.
Here we describe a set of assays designed for analyzing the expression levels of individual H1 subtypes (Figure 1). mRNA expression of various H1 variant genes is measured by a set of highly sensitive and quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) assays, which are faster, more accurate and require much less samples compared with the alternative approach of Northern blot analysis. Unlike most other cellular mRNA messages, mRNAs for most histone genes, including the majority of H1 genes, lack a long polyA tail, but contain a stem-loop structure at the 3' untranslated region (UTR)10. Therefore, cDNAs are prepared from total RNA by reverse transcription using random primers instead of oligo-dT primers. Realtime PCR assays with primers specific to each H1 subtypes (Table 1) are performed to obtain highly quantitative measurement of mRNA levels of individual H1 subtypes. Expression of housekeeping genes are analyzed as controls for normalization. 
The relative abundance of proteins of each H1 subtype and core histones is obtained through reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis of total histones extracted from mammalian cells11-13. The HPLC method and elution conditions described here give optimum separations of mouse H1 subtypes. By quantifying the HPLC profile, we calculate the relative proportion of individual H1 subtypes within H1 family, as well as determine the H1 to nucleosome ratio in the cells.

We describe a set of assays to analyze expression levels of H1 linker histones. mRNA of individual H1 genes are quantitatively measured by random primer based reverse transcription followed by real-time PCR, whereas protein quantification of H1 histones is achieved by HPLC analysis.

تحليل التعبير عن الأنواع الفرعية رابط-هيستون الثدييات

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

تصور mRNAs والشبكة الإندوبلازمية في خلايا الثدييات المترجمة

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

قياس مستويات هيم في تخليق خلايا الثدييات

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...