אנו מודים זהבית פרנקל סנדרה Tolchinsky לקבלת סיוע טכני. מחקר הקשורים לעבודה זו נתמכת על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע (1229-1207) ואת גרמניה פרויקט שיתוף פעולה ישראלי (DIP-DFG).

הפרוטוקול הבא מיועד לניתוח של שרשראות סוכר של גליקופרוטאינים או סך של גליקופרוטאין ספציפי של עניין. הליך זה בעצם אותו דבר עבור שניהם מקרים עם שינויים מעטים כאמור בכל פרוטוקול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תיוג המטבולית של N-linked glycans אחד צריך להשתמש תרבות subconfluent של בתאי יונקים בוגרים לילה בצלחת 90 ​​מ&quot;מ עבור כל דגימה (דגימות עשוי לייצג נקודות זמן שונות או טיפולים). פרוטוקול זה הוא אופטימיזציה עבור תאים NIH 3T3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרעיב את התאים גלוקוז על ידי הדגירה ב 5 מ&quot;ל של מדיום מראש התחמם (37 ° C) גלוקוז ללא המוכן טרי, מסופק עם 10% dialyzed FCS ו 4 נתרן mM pyruvate במשך 5-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום רעב עם 1 מ&quot;ל של טרום התחמם (37 ° C) גלוקוז ללא בינוני המכיל 400 μCi של [2-3 H] שכותרתו מנוז (ריכוז נמוך יותר של 65 μCi / ml משמש עבור תיוג של גליקופרוטאינים סה&quot;כ), ו דגירה התאים בתרבית בתנאים נורמליים ברקמות במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום תיוג מכל מדגם, ובזהירות מוסיפים 2 מ&quot;ל PBS ב 4 ° C עד דגימות המתאים הדופק ומניחים אותם על הקרח (דגימות אלה מכונים פולסים), בעוד דוגמאות המתאים המרדף צריך להיות שטופים 3 פעמים עם 2 מ&quot;ל של טרום התחמם (37 ° C) תרבות נורמליים בינוני מלא, ולאחר מכן להציב CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5 מ&quot;ל של מדיום מראש חימם קבוע לתקופות לרדוף הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את דגימות הדופק (ממוקם בעבר על הקרח) 3 פעמים עם 2 מ&quot;ל של קר כקרח PBS. התאים מגורד אז את המנה ב 2 מ&quot;ל PBS באמצעות מגרד תא, מכניסים צינור 2 Eppendorf מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצר ספין התאים ב 16000Xg (6-10 שניות), לבטל את supernatant ולהקפיא התא גלולה ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע שלבים 5 ו 6 גם דגימות לרדוף בסוף הזמן לרדוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים מהמקפיא lyse אותם על ידי תוספת של 300 μl של חיץ, vortexing בקצרה דוגרים במשך 20 דקות על הקרח, או במקרה של ניתוח גליקופרוטאינים הכולל, על ידי הדגירה 20 דקות על הקרח עם חיץ B, ואחריו sonication (4 פעמים, 10 שניות, מקסימום אמפליטודה), ואז להרתיח את דגימות 5min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysates ב 16000Xg במשך 20 דקות ב 4 ° C. מעבירים את supernatant לצינור חדש Eppendorf וזורקים את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ניתוח גליקופרוטאינים הכולל, המשך סינון deglycosylation מולקולרית (שלב 17). עבור immunoprecipitation של גליקופרוטאין H2a הפגינו כאן, להוסיף 20l/sample של חלבון (Repligen) A-agarose חרוזים 01:01 ההשעיה ו 3 μl / מדגם של נוגדן ארנבת polyclonal שלנו H2a אנטי עבור גליקופרוטאין הרצויה (נוגדן שלנו נגד H2a למשל ), כדי supernatant משלב 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות עבור 4-16 שעות 4 ° C, ללא הרף ערבוב על ידי סיבוב איטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה חרוזים ב 16000Xg למשך 30 שניות, ובזהירות להסיר את האבק באמצעות supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את החרוזים, על ידי הוספת 500 חיץ D μl ו vortexing. ספין כמו בשלב 12 ולהסיר את supernatant. חזור על לשטוף 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ denaturing 10μl (מסופק עם Endo-H חוד בערכה) ועד גלולה חרוז לרתיחה דגימות במשך 5 דקות (כאשר חלבונים סך מנותחים, deglycosylation מבוצע על המסנן Microcon, שלב 17). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה חרוזים (16000Xg למשך 30 שניות), ולהעביר את supernatant לתוך צינור Eppendorf חדש. ואז 0.5μl של האנזים H אנדו מתווספים מדגם זה יחד עם 10 μl של למאגר תגובה (מסופק גם עם אנדו חוד H קיט), וכן דגימות מודגרת על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפריד את glycans שוחרר מן החלבונים, המדגם הוא מדולל עם מים 5 פעמים deionized והניח על גבי מסנן מולקולרית (Microcon Ultracel YM30), עם 30kDa חתוכים, centrifuged אז 3 דקות ב 14000Xg. החל 50μl מים deionized ו צנטריפוגה חוזרת של הדגימות. כשלון זה חוזר על עצמו פעמים 2 יותר, תוך שמירה על זרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתה מנתח גליקופרוטאינים הכולל, להחיל את supernatant של lysates (משלב 9) כדי לסנן את Microcon. שטפו את תמצית עם 100 μl של חיץ E, 3 פעמים על ידי צנטריפוגה חזר על 14000Xg דקות 3. הוסף 3 μl של חיץ 10X התגובה H אנדו 1.5 μl של האנזים אנדו H ל retentate Microcon ו דגירה במשך 3 שעות ב 37 ° C. Glycans שפורסמו הם eluted עם מים deionized על ידי 3 centrifugations חוזרות ונשנות, כמו בשלב 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, retentates מן השלבים 16 ו 17, המכיל אנדו H עמידים גליקופרוטאינים מודגרת אז μl 15 של חיץ C עם 200mU של N-F glycosidase, על 37 מעלות צלזיוס למשך 16 ח Elution עם מים deionized מתבצעת כמו בשלב 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור המכיל את התגובה H אנדו flow-through (שלבים 16 ו -17) ב concentrator SpeedVac, ויבש דגימות לחלוטין (זה יכול להיעשות עד 45 ° C כדי להאיץ את התהליך הזה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את דגימות עבור HPLC, resuspend את כדורי יבש 12 μl של הממס HPLC (אצטוניטריל: מים, 60:40, חומצה זרחתית 1%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאמת מכשיר HPLC (מחובר בטור Spherisorb) אל זרם בלתי פוסק של הממס (1 mL / min) והלחץ (ערך מסוים בין 1000 ו - 2000 psi), ואת המקום אספן חלק לשנות צינור בכל דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הדגימות לתוך המכשיר HPLC ולהתחיל את אספן חלק בו זמנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף השברים של 48 מ&quot;ל 1 מ לרוץ כל המדגם מהריצה של תערובת oligosaccharide סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 500 μl של שבריר לכל בקבוקון הנצנץ, ומערבבים את תכולת עם 3 מ&quot;ל של נוזל מים בליל הנצנץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צלוחיות לקרוא מונה הנצנץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Readout לדקה הוא זמם כפונקציה של מספר שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכים לדקה בתוך לשיא מייצגים מינים glycan ספציפיים כדלקמן: שברים 18-21 מתאימות M5, M6 ל 22-26 שברים, שברים 27-31 כדי M7, שברים 32-35 כדי M8, שברים 36-39 כדי M9, שברים 40-42 כדי G1M9 ושברים 43-45 כדי G2M9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סכום הערכים עותקים לדקה עבור שברים בתוך שיא כל משקפת את הסכום המוחלט של מין glycan ספציפיים. כדי לפצות על העובדה כי מינים המכיל שאריות מנוז יותר לרכוש התווית יותר, &quot;טוחנת כמות יחסית&quot; של כל מין glycan מחושב כדלקמן: הסכום המוחלט של כל מין glycan מחולק במספר שאריות מנוז שהוא מכיל . ערך זה מחולק אז בסכום של הסכומים טוחנת היחסי של כל המינים glycan להשיג כדי להשיג את &quot;אחוזים מסך&quot; לכל מיני glycan ספציפיים. </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td style="text-align:center;"> צ&#39;ייס (ח) </td><td style="text-align:center;"> 0 </td><td style="text-align:center;"> 4 </td></tr><tr><td> יצא עם אנדו H (CPM) </td><td> 90000 </td><td> 16800 </td></tr><tr><td> יצא עם N-glycosidase (CPM) F ב </td><td> 20400 </td><td> 3900 </td></tr><tr><td> גליקופרוטאינים ב retentate (CPM) ג </td><td> 371700 </td><td> 127695 </td></tr><tr><td> Dolichol-אוליגוסכרידים ב retentate (CPM) ד </td><td> 4350 </td><td> 540 </td></tr><tr><td> Dolichol-אוליגוסכרידים ב retentate (%) דואר </td><td> 1.4 ± 0.7 </td><td> 0.2 ± 0.2 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. ניתוח שחרורו של N-linked שרשראות סוכר עם deglycosidases ואת נוכחותם של dolichol-אוליגוסכרידים בדגימות גליקופרוטאין. אנו להחיל את ההליך הדופק כדי לרדוף lysate מתאי NIH 3T3. לאחר סינון Microcon, שכותרתו N-linked אוליגוסכרידים שוחררו בעיקר אחרי הדופק תיוג (סוג מנוז גבוהה) עם טיפול נוסף עם F N-glycosidase לאחר תקופה מרדף, אשר יתאים לסוג מורכבות (Golgi עיבוד glycans) עם אנדו H, אנדו H אוליגוסכרידים עמידים. זה ניתוח כמותי נקבע כי dolichol-אוליגוסכרידים, היוו חלק משמעותי של התווית retentate הראשונית. הערות: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים NIH 3T3 היו הדופק שתויגו עם [2-3 H] מנוז ורדפו להשלים עם בינוניות. לאחר תמוגה התא סינון דרך Microcon YM30, גבוה מנוז N-linked אוליגוסכרידים שוחררו retentates ידי הדגירה עם אנדו ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנדו H עמידות החומר retentates Microcon מ (א) הודגר אז עם F N-glycosidase ושוחרר אוליגוסכרידים נמדד מונה הנצנץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Retentates Microcon שהושגו כמו (א) לפני טיפול H אנדו, חולצו 4 פעמים עם כלורופורם: מתנול: מים 10:10:03 להסיר glycolipids מבשר, ואת החומר unextracted solubilized ב NaOH 1N ו נספר מונה הנצנץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dolichol-אוליגוסכרידים היו מטוהרים מן קטעים (ג) כפי שמתואר 1 ו נספר מונה הנצנץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע של 3 ניסויים אחוז dolichol-אוליגוסכרידים (ד) עותקים לדקה סך retentate (ג + ד). </li></ol> נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. Pulse-מרדף ניתוח הכולל גליקופרוטאינים NIH 3T3 בתאים שלא טופלו ועל עיכוב proteasomal לאחר 1h הדופק עם תיוג. [2-3-H] השגנו פרופיל צפוי עם כמה glucosylatedמבשרי הנותר (Glc 2 Man 9 GlcNAc 2 (G2M9) ו G1M9), אבל רוב התווית נוכח M9 ו M8 מינים, כיוון שזה תוצאה של זמירה של גלוקוז כל אחד שאריות מנוז (איור 1). מבשרי לא קטן מנוז חינם או אחרים התגלו, המעידים על יסודיות של טיהור. בעקבות ארוכה למדי 8h מרדף היה נרחב יותר זמירה כדי M7-6 ו כמות קטנה של M5, אבל המינים העיקריים המשיך להיות M8 M9 ו (איור 1 ב &#39;). אם המרדף בוצע בנוכחות מעכב proteasomal (30 מיקרומטר MG-132), היה רק ​​הצטברות קלה של מינים אלה גזוז אותו (איור 1 ג&#39;). <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. ניתוח כמותי של שרשראות סוכר המצע ERAD לעומת סך גליקופרוטאינים. (א) ניסוי דומה לזה בתרשים 1, טוחנת כמויות היחסי של כל המינים oligosaccharide חושבו בהתבסס על תוכן מנוז. אנו המיר את הערכים המתקבלים לדקה לכל מיני glycan, אחוז אחד המינים ביחס לסכום הכולל של הסכומים טוחנת היחסי של כל המינים היה נוכח זממו אז כפונקציה של הזמן לרדוף בממוצע של שני ניסויים. (ב) דומים ל (A) אלא glycans שוחרר מן המצע ERAD ASGPR H2a נותחו לאחר תיוג הדופק ולרדוף עד 4H, בנוכחות או העדר מעכב proteasomal MG-132. (ג) ערכים עבור 4H לרדוף בנוכחות של MG-132 מבית (א) ו - (ב) מושווים עבור ASGPR H2a ובריכת גליקופרוטאין. (ד &#39;) תוכנית של רשת N-linked סוכר זמירה תהליכי המיון. סוכר זמירה תהליכים שיובילו M6-5 קשור חלבונים (R) הממוקדות ERAD לעומת M9-8 על אלה יציאה Golgi ומעבר. תוצאות המחקר מראות כי התהליך ERAD קשורה מנוז זמירה של N-glycans להניב מינים עם 5-6 שאריות מנוז הנותרים.

<ol>
	<li>Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+polyprenol-bound+saccharides+as+intermediates+in+glycoprotein+synthesis+in+liver.">The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).</li><li>Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+(ER)+mannosidase+I+is+compartmentalized+and+required+for+N-glycan+trimming+to+Man5-6GlcNAc2+in+glycoprotein+ER-associated+degradation.">Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).</li><li>Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum-associated+degradation+of+mammalian+glycoproteins+involves+sugar+chain+trimming+to+Man6-5GlcNAc2.">Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).</li><li>Hosokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+endoplasmic+reticulum+(ER)+degradation+of+misfolded+Null+Hong+Kong+alpha1-antitrypsin+by+human+ER+mannosidase+I.">Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I.</a> J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).</li><li>Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+misfolded+endoplasmic+reticulum+glycoproteins+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+determined+by+a+specific+oligosaccharide+structure.">Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).</li><li>Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+versus+secreted+forms+of+human+asialoglycoprotein+receptor+subunits.+Role+of+a+juxtamembrane+pentapeptide.">Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide.</a> J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).</li></ol>

ניתוח הדופק מרדף של glycans בתאים חיים עם הפרדה HPLC מספק שיטה ללמוד את הדינמיקה של שינויים מבניים oligosaccharide לאורך החיים של גליקופרוטאין. יש ראיות הולכות ומצטברות כי שינויים כאלה הם מעורבים בייצור אותות לקיפול ER, בקרת איכות ומערכות 2-5 סחר. השיטה יכול להיות מיושם לא רק ?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>600E Multisolvent delivery System controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>WAT062710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck Bioscience</td>
<td>1.0003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC503024 or 4208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5301 000.016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dialyzed Foetal Calf Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>04-011-1A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Modi&#xFB01;ed Eagle's Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Invitrogen Cell Culture</td>
<td>41965039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Modi&#xFB01;ed Eagle's Medium - glucose free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D5030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D1408</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA disodium salt (Titriplex Iii)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>1084180250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>p0703S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foetal Calf Serum (FCS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>04-001-1A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Frac-100 fraction collector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham Biosciences</td>
<td>18-1000-77</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>510720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer Life Sciences</td>
<td>NET570A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>474790</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-glycosidase F (1000 units/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11365177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-octylglucoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>O3757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NIH 3T3 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
<td>CRL-1658</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Opti-Flour</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer Life Sciences</td>
<td>6013199</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>79607</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P2714</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein A-Sepharose beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Repligen</td>
<td>IPA300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium deoxycholate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>30970</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-RAD</td>
<td>161-0301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium phosphate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>342483</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium pyruvate solution (100mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spherisorb NH2 Column, 5 &mu;m, 4.6 x 250 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>PSS831115</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BDH</td>
<td>306324N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sonics and Materials, Inc.</td>
<td>690-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NIH 3T3 stably expressing H2a 6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate, 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M3148</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

pulse-chase analysis of n-linked sugar chains from glycoproteins in mammalian cells

קובץ מצורף של Glc<sub&gt; 3</sub&gt; Man<sub&gt; 9</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt; מבשר oligosaccharide כדי פוליפפטידים המתהווה בחדר המיון הוא שינוי משותף חלבונים הפרשה. למרות שינוי זה היה מעורב במספר תהליכים ביולוגיים, היבטים נוספים של תפקודו הם מתעוררים, עם הראיות האחרונות תפקידה בייצור של אותות בקרת איכות גליקופרוטאין וסחר. לכן, תופעות הקשורות N-linked glycans ועיבוד שלהם נחקרים באינטנסיביות. שיטות שפותחו לאחרונה לניתוח proteomic השתפרו מאוד את האפיון של N-linked glycans גליקופרוטאין. עם זאת, הם אינם מספקים תובנה הדינמיקה של עיבוד סוכר שרשרת המעורבים. לשם כך, תיוג הדופק לרדוף פרוטוקולים ניתוח משמשים מורכבים בדרך כלל לתת תשואות נמוכות מאוד. אנו מתארים כאן שיטה פשוטה הבידוד וניתוח מטבולית N-linked אוליגוסכרידים שכותרתו. פרוטוקול מבוסס על תיוג של תאים עם [2 -<sup&gt; 3</sup&gt; H] תמוגה מנוז, denaturing ולשחרר האנזימטית של אוליגוסכרידים מתוך חלבון או באופן ספציפי immunoprecipitated עניין או ממאגר גליקופרוטאין כללי ידי טיפולים רציפים עם אנדו H ו-N-F glycosidase, ואחריו סינון מולקולרי (Amicon). בשיטה זו מבודדים אוליגוסכרידים לשמש כקלט עבור HPLC ניתוח, המאפשר אפליה בין מבנים glycan שונים על פי מספר יחידות monosaccharide המרכיבים אותם, עם רזולוציה של monosaccharide יחיד. באמצעות שיטה זו היינו מסוגלים ללמוד גבוה מנוז N-linked פרופילים oligosaccharide של גליקופרוטאינים תא הכולל מרדף אחרי הדופק בתנאים נורמליים תחת דיכוי הפרוטאזום. פרופילים אלו הושוו לאלו שהתקבלו המצע השפלה immunoprecipitated ER-הקשורים (ERAD). התוצאות שלנו מראים כי רוב גליקופרוטאינים NIH 3T3 הסלולר הם יציבים יחסית, וכי רוב אוליגוסכרידים שלהם נקצצו Man<sub&gt; 9-8</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt;. לעומת זאת, מצעים ERAD יציבים הם גזומים לגבר<sub&gt; 6-5</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt; ו גליקופרוטאינים נושאות מינים אלה מצטברים על עיכוב של השפלה proteasomal.

Watch this Scientific Journal Video about Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells at JoVE.com

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

אנו מתארים שיטה לניתוח שינוי של N-linked glycans דרך חיים המוקדם של גליקופרוטאינים לאחר ביוסינתזה שלהם בתאי יונקים. זו מושגת על ידי ניתוח הדופק מרדף של glycans שכותרתו מטבולית, לשחרר האנזימטית של גליקופרוטאינים ובחינה על ידי HPLC.

Pulse-מרדף ניתוח של N-linked שרשראות סוכר מ גליקופרוטאינים בתאי יונקים

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

pulse-chase-analysis-n-linked-sugar-chains-from-glycoproteins

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K Views.  Tel Aviv University. אנו מתארים שיטה לניתוח שינוי של N-linked glycans דרך חיים המוקדם של גליקופרוטאינים לאחר ביוסינתזה שלהם בתאי יונקים. זו מושגת על ידי ניתוח הדופק מרדף של glycans שכותרתו מטבולית, לשחרר האנזימטית של גליקופרוטאינים ובחינה על ידי HPLC.

Video: Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

ב ההיפוך חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים חסיד שאינן חסיד

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

המשימה esiRNA עבור הקרנת RNAi בתאי יונקים

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure. H1 is essential for mammalian development1 and regulates specific gene expression in vivo2-4. Among the highly conserved histone proteins, the family of H1 linker histones is the most heterogeneous group. There are 11 H1 subtypes in mammals that are differentially regulated during development and in different cell types. These H1 subtypes include 5 somatic H1s (H1a-e), the replacement H10, 4 germ cell specific H1 subtypes, and H1x5. The presence of multiple H1 subtypes that differ in DNA binding affinity and chromatin compaction ability6-9 provides an additional level of modulation of chromatin function. Thus, quantitative expression analysis of individual H1 subtypes, both of mRNA and proteins, is necessary for better understanding of the regulation of higher order chromatin structure and function.
Here we describe a set of assays designed for analyzing the expression levels of individual H1 subtypes (Figure 1). mRNA expression of various H1 variant genes is measured by a set of highly sensitive and quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) assays, which are faster, more accurate and require much less samples compared with the alternative approach of Northern blot analysis. Unlike most other cellular mRNA messages, mRNAs for most histone genes, including the majority of H1 genes, lack a long polyA tail, but contain a stem-loop structure at the 3' untranslated region (UTR)10. Therefore, cDNAs are prepared from total RNA by reverse transcription using random primers instead of oligo-dT primers. Realtime PCR assays with primers specific to each H1 subtypes (Table 1) are performed to obtain highly quantitative measurement of mRNA levels of individual H1 subtypes. Expression of housekeeping genes are analyzed as controls for normalization. 
The relative abundance of proteins of each H1 subtype and core histones is obtained through reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis of total histones extracted from mammalian cells11-13. The HPLC method and elution conditions described here give optimum separations of mouse H1 subtypes. By quantifying the HPLC profile, we calculate the relative proportion of individual H1 subtypes within H1 family, as well as determine the H1 to nucleosome ratio in the cells.

We describe a set of assays to analyze expression levels of H1 linker histones. mRNA of individual H1 genes are quantitatively measured by random primer based reverse transcription followed by real-time PCR, whereas protein quantification of H1 histones is achieved by HPLC analysis.

הביטוי ניתוח Linker-היסטון תת סוגים יונקים

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...