Nous remercions Zehavit Frenkel et Sandra Tolchinsky d&#39;assistance technique. Les recherches liées à ce travail est soutenu par des subventions de la Fondation Sciences d&#39;Israël (1229-1207) et de la Coopération allemande Project-israélien (DIP-DFG).

Le protocole suivant est destiné à l&#39;analyse des chaînes de sucre des glycoprotéines totale ou d&#39;une glycoprotéine d&#39;intérêt spécifiques. La procédure est quasiment identique pour les deux cas, avec quelques modifications comme indiqué dans le protocole. <ol><li> Pour marquage métabolique des N-glycanes on a besoin d&#39;utiliser une culture de cellules de mammifères subconfluentes cultivées pendant une nuit dans un plat de 90 mm pour chaque échantillon (les échantillons peuvent représenter différents points de temps ou de traitements). Ce protocole est optimisé pour les cellules NIH 3T3. </li><li> Affamer les cellules pour le glucose par incubation dans 5 ml d&#39;fraîchement préparés préalablement chauffé (37 ° C) sans glucose moyen, fourni avec 10% de FCS dialysées et 4 mM pyruvate de sodium pendant 5-15 minutes. </li><li> Remplacez le support de famine avec 1 ml de pré-chauffée (37 ° C) sans glucose milieu contenant 400 pCi de [2 - 3 H] mannose-étiquetées (concentration plus faible de 65 pCi / ml est utilisé pour l&#39;étiquetage des glycoprotéines total), et incuber les cellules dans les conditions normales de culture tissulaire pendant 1 heure. </li><li> Retirez le support d&#39;étiquetage de chaque échantillon, et ajoutez avec précaution 2 ml de PBS à 4 ° C à l&#39;échantillons correspondant à impulsions et de les placer sur la glace (ces échantillons sont considérés comme des légumineuses), tandis que les échantillons correspondant à la chasse doivent être rincés trois fois avec 2 ml de la pré-chauffée (37 ° C) moyenne normale de culture complet, et ensuite placé dans un incubateur à CO 2 à 37 ° C avec 5 ml de pré-chauffé milieu régulier pour les périodes souhaitées chasse. </li><li> Rincer les échantillons d&#39;impulsion (précédemment mis sur la glace) 3 fois avec 2 ml de PBS glacé. Les cellules sont ensuite raclé le plat dans 2 ml de PBS en utilisant un grattoir à cellules, et placé dans un tube Eppendorf de 2 ml. </li><li> Short-spin les cellules à 16000Xg (6-10 sec), éliminer le surnageant et congeler les cellules à -80 ° C à granulés </li><li> Effectuez les étapes 5 et 6 également pour les échantillons courir à la fin de l&#39;époque chasse. </li><li> Retirer les cellules du congélateur et les lyser par addition de 300 ul de tampon A, vortex brièvement et incuber pendant 20 min sur la glace, ou dans le cas de l&#39;analyse des glycoprotéines total, par incubation de 20 min sur la glace avec le tampon B, suivie par sonication (4 fois, 10 sec, amplitude maximale), puis faire bouillir les échantillons pendant 5min. </li><li> Centrifuger les lysats à 16000Xg pendant 20 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube Eppendorf et jeter le culot. </li><li> Si l&#39;analyse des glycoprotéines totales, procéder à la filtration moléculaire et déglycosylation (étape 17). Pour immunoprécipitation de la glycoprotéine H2a démontré ici, ajouter des 20l/sample (Repligen) protéine A-agarose perles 01h01 suspension et 3 pi / échantillon de nos anticorps de lapin polyclonal anti H2a pour la glycoprotéine souhaitée (dans notre exemple d&#39;anticorps anti-H2a ), dans le surnageant de l&#39;étape 9. </li><li> Incuber les échantillons pendant 4-16 heures à 4 ° C, en permanence le mélange par rotation lente. </li><li> Isoler les perles au 16000Xg pendant 30 secondes, et retirez soigneusement l&#39;aspirateur surnageant à l&#39;aide. </li><li> Rincez les perles, en ajoutant 500 pi de tampon D et vortex. Spin comme dans l&#39;étape 12 et retirer le surnageant. Répétez les 3 lavez fois. </li><li> Ajouter 10 ul de tampon de dénaturation (fourni avec l&#39;ONE endo-H kit) pour le culot de perles et faire bouillir les échantillons pendant 5 min (lorsque les protéines totales sont analysées, la déglycosylation est effectuée sur le filtre Microcon, étape 17). </li><li> Isoler les perles (16000Xg pendant 30 secondes), et le transfert du surnageant dans un nouveau tube Eppendorf. Puis 0.5μl de l&#39;endo H enzyme sont ajoutés à chaque échantillon avec 10 ul du tampon de réaction (également fourni avec le kit ONE endo H), et les échantillons sont incubés à 37 ° C pendant 3 heures. </li><li> Pour séparer les glycanes libérés à partir des protéines, l&#39;échantillon est dilué 5 fois avec de l&#39;eau déminéralisée et placé sur le dessus d&#39;un filtre moléculaire (Microcon Ultracel YM30), avec une coupure 30 kDa, puis centrifugés à 14000Xg pendant 3 min. Appliquer 50 pl d&#39;eau déminéralisée et répétez la centrifugation des échantillons. Ce lavage est répété deux de plus, garder le flux continu. </li><li> Si vous analysez les glycoprotéines totale, appliquer le surnageant des lysats (de l&#39;étape 9) pour le filtre Microcon. Laver l&#39;extrait avec 100 pi de tampon E, 3 fois par centrifugation répétée à 14000Xg pendant 3 min. Ajouter 3 pi de tampon de réaction 10X endo H et 1,5 pl de l&#39;enzyme endo H au rétentat Microcon, et incuber pendant 3 heures à 37 ° C. Les glycanes libérés sont élués avec de l&#39;eau déminéralisée par 3 centrifugations répétées, comme dans l&#39;étape 16. </li><li> Si désiré, rétentats des étapes 16 et 17, contenant l&#39;endo H résistant glycoprotéines sont ensuite incubés avec 200mU de la N-glycosidase F dans 15 ul de tampon C à 37 ° C pendant 16 h. Élution avec de l&#39;eau déminéralisée se fait comme dans l&#39;étape 16. </li><li> Placer le tube contenant la réaction endo H accréditives (les étapes 16 et 17) dans un concentrateur SpeedVacEt sécher les échantillons complètement (cela peut être fait jusqu&#39;à 45 ° C pour accélérer ce processus). </li><li> Pour préparer les échantillons pour l&#39;HPLC, remettre en suspension les granulés secs dans 12 ul du solvant HPLC (acétonitrile: eau, 60:40, acide phosphorique à 1%). </li><li> Réglez l&#39;appareil CLHP (reliée à la colonne Spherisorb) au flux constant de solvant (1 ml / min) et de pression (une valeur particulière entre 1000 et 2000 psi), et placer un collecteur de fraction de changer un tube à chaque minute 1. </li><li> Charger les échantillons dans l&#39;appareil CLHP et démarrer le collecteur de fractions simultanément. </li><li> Recueillir 48 fractions de 1 ml de chaque échantillon et exécuté d&#39;une exécution d&#39;un mélange standard oligosaccharides. </li><li> Transférer 500 ul de chaque fraction dans un flacon à scintillation, et mélanger le contenu avec 3 ml de liquide scintillant miscible à l&#39;eau. </li><li> Charger les flacons et les lire dans un compteur à scintillation. </li><li> La lecture cpm est tracée en fonction du nombre de fractions. </li><li> Les valeurs cpm dans un pic de représenter une espèce spécifique glycane comme suit: 18 à 21 correspondent aux fractions M5, les fractions 22-26 à M6, les fractions 27-31 à M7, les fractions 32-35 à M8, les fractions 36-39 à M9, fractions 40-42 à 43-45 G1M9 et des fractions d&#39;G2M9. </li><li> La somme des valeurs cpm pour les fractions au sein de chaque pic reflète la quantité absolue d&#39;une espèce glycane spécifiques. Afin de compenser le fait que les espèces contenant plusieurs résidus mannose acquérir plus de l&#39;étiquette, le &quot;montant molaire relative» de chaque espèce glycane est calculé comme suit: la quantité absolue de chaque espèce glycane est divisé par le nombre de résidus mannose qu&#39;elle contient . Cette valeur est ensuite divisée par la somme des quantités relatives molaire de toutes les espèces glycane obtenu pour obtenir le &quot;pour cent du total&quot; pour chaque espèce glycane spécifiques. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td style="text-align:center;"> Chase (h) </td><td style="text-align:center;"> 0 </td><td style="text-align:center;"> 4 </td></tr><tr><td> Publié avec l&#39;endo H (cpm) une </td><td> 90000 </td><td> 16800 </td></tr><tr><td> Sortie avec la N-glycosidase F (cpm) b </td><td> 20400 </td><td> 3900 </td></tr><tr><td> Glycoprotéines dans le rétentat (cpm) c </td><td> 371700 </td><td> 127695 </td></tr><tr><td> Dolichol-oligosaccharides dans le rétentat (cpm) d </td><td> 4350 </td><td> 540 </td></tr><tr><td> Dolichol-oligosaccharides dans le rétentat (%) e </td><td> 1,4 ± 0,7 </td><td> 0,2 ± 0,2 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Analyse de la libération des chaînes de sucre N-lié à deglycosidases et de la présence de dolichol-oligosaccharides dans les échantillons de glycoprotéine. Nous avons appliqué la procédure de pulse-chase à un lysat de cellules NIH 3T3. Après filtration Microcon, étiquetés oligosaccharides N-liés ont été libérés principalement avec l&#39;endo H après impulsion de l&#39;étiquetage (type haute mannose) et avec d&#39;autres traitements avec la N-glycosidase F après une période de chasse, ce qui correspondrait à un type complexe (Golgi-traitées glycanes), endo H oligosaccharides résistants. Cette analyse quantitative a déterminé que dolichol-oligosaccharides, représentaient une fraction insignifiante de l&#39;étiquette dans le rétentat initiale. Notes: <ol class="lalpha"><li> Les cellules NIH 3T3 ont été étiquetés avec impulsions [2 - 3 H] mannose et pourchassé avec un milieu complet. Après la lyse des cellules et filtration à travers Microcon YM30, haute mannose oligosaccharides N-liés ont été libérés de rétentats par incubation avec l&#39;endo H. </li><li> Endo H matériau résistant au rétentats Microcon de (a) a ensuite été incubées avec la N-glycosidase F et publié oligosaccharides mesurée dans un compteur à scintillation. </li><li> Rétentats Microcon obtenu comme dans (a) avant l&#39;endo H traitement, ont été extraite 4 fois avec du chloroforme: méthanol: eau pour enlever 10:10:03 glycolipides précurseur, et le matériel non extraits solubilisés dans NaOH 1N et comptés dans un compteur à scintillation. </li><li> Dolichol-oligosaccharides sont purifiés à partir d&#39;extraits de (c) tel que décrit dans 1 et comptés dans un compteur à scintillation. </li><li> Moyenne de 3 expériences pour les pour cent de dolichol-oligosaccharides (d) du total des cpm en rétentat (c + d). </li></ol> Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Pulse-chase analyse des glycoprotéines NIH 3T3 totale dans les cellules non traitées et sur ​​l&#39;inhibition du protéasome Après 1h d&#39;impulsion-marquage avec. [2 - 3 H], nous avons obtenu un profil attendu avec une certaine glucosylésprécurseurs restants (2 Glc Man 9 GlcNAc 2 (G2M9) et G1M9), mais la plupart de l&#39;étiquette présente dans M9 et M8 espèces, ce dernier étant le résultat d&#39;une coupe de tous les résidus de glucose et d&#39;une mannose (Figure 1). Non sans mannose ou d&#39;autres précurseurs de petits ont été détectées, attestant de la rigueur de la purification. Après une assez longue course 8h il y avait plus vaste coupe à M7-6 et une petite quantité de M5, mais les principales espèces ont continué à être M9 et M8 (figure 1 B). Si la chasse a été fait en présence d&#39;un inhibiteur du protéasome (30 uM MG-132), il y avait seulement une accumulation mineure de ces mêmes espèces taillés (figure 1 C). <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. L&#39;analyse quantitative des chaînes de sucre d&#39;un substrat par rapport à ERAD glycoprotéines totales. (A) Dans une expérience similaire à celle de la figure 1, relative quantités molaires de chaque espèce d&#39;oligosaccharides ont été calculés en fonction du contenu du mannose. Nous avons converti les valeurs cpm obtenus pour chaque espèce glycane, le pour cent de chaque espèce par rapport à la somme totale des montants relatifs molaire de tous les espèces présentes a ensuite été tracée en fonction du temps Chase pour une moyenne de deux expériences (B). Similaires à (A) sauf que les glycanes libérés de l&#39;ERAD substrat ASGPR H2a ont été analysés après l&#39;impulsion de l&#39;étiquetage et chasser pour un maximum de 4h, en présence ou en absence de l&#39;inhibiteur du protéasome MG-132. (C) Les valeurs de 4h chasse dans la présence de MG-132 de (A) et (B) sont comparés pour ASGPR H2a et la piscine glycoprotéine. (D) Schéma de la chaîne de sucre N-liés coupe processus dans les SU. Sucre processus qui mènent à la coupe M6-5 liés à des protéines (R) qui sont ciblés pour ERAD par rapport à M9-8 sur ceux qui la sortie à l&#39;appareil de Golgi et au-delà. Les résultats indiquent que le processus ERAD est associée à la coupe du mannose N-glycanes pour produire des espèces avec 5-6 résidus mannose restantes.

<ol>
	<li>Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+polyprenol-bound+saccharides+as+intermediates+in+glycoprotein+synthesis+in+liver.">The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).</li><li>Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+(ER)+mannosidase+I+is+compartmentalized+and+required+for+N-glycan+trimming+to+Man5-6GlcNAc2+in+glycoprotein+ER-associated+degradation.">Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).</li><li>Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum-associated+degradation+of+mammalian+glycoproteins+involves+sugar+chain+trimming+to+Man6-5GlcNAc2.">Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).</li><li>Hosokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+endoplasmic+reticulum+(ER)+degradation+of+misfolded+Null+Hong+Kong+alpha1-antitrypsin+by+human+ER+mannosidase+I.">Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I.</a> J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).</li><li>Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+misfolded+endoplasmic+reticulum+glycoproteins+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+determined+by+a+specific+oligosaccharide+structure.">Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).</li><li>Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+versus+secreted+forms+of+human+asialoglycoprotein+receptor+subunits.+Role+of+a+juxtamembrane+pentapeptide.">Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide.</a> J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).</li></ol>

L&#39;analyse pulse-chase de glycanes dans des cellules vivantes avec une séparation par HPLC fournit une méthode pour étudier la dynamique de l&#39;oligosaccharide modifications structurelles à travers la vie d&#39;une glycoprotéine. Il ya plus de preuves que ces altérations sont impliquées dans la production des signaux pour le pliage ER, contrôle de la qualité et la traite des systèmes de 2-5. La méthode peut être appliquée non seulement pour une glycoprotéine d&#39;intérêt particuliers, ma...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>600E Multisolvent delivery System controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>WAT062710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck Bioscience</td>
<td>1.0003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC503024 or 4208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5301 000.016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dialyzed Foetal Calf Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>04-011-1A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Modi&#xFB01;ed Eagle's Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Invitrogen Cell Culture</td>
<td>41965039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Modi&#xFB01;ed Eagle's Medium - glucose free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D5030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D1408</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA disodium salt (Titriplex Iii)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>1084180250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>p0703S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foetal Calf Serum (FCS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>04-001-1A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Frac-100 fraction collector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham Biosciences</td>
<td>18-1000-77</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>510720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer Life Sciences</td>
<td>NET570A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>474790</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-glycosidase F (1000 units/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11365177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-octylglucoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>O3757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NIH 3T3 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
<td>CRL-1658</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Opti-Flour</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer Life Sciences</td>
<td>6013199</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>79607</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P2714</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein A-Sepharose beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Repligen</td>
<td>IPA300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium deoxycholate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>30970</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-RAD</td>
<td>161-0301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium phosphate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>342483</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium pyruvate solution (100mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spherisorb NH2 Column, 5 &mu;m, 4.6 x 250 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>PSS831115</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BDH</td>
<td>306324N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sonics and Materials, Inc.</td>
<td>690-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NIH 3T3 stably expressing H2a 6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate, 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M3148</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

pulse-chase analysis of n-linked sugar chains from glycoproteins in mammalian cells

Fixation du Glc<sub&gt; 3</sub&gt; Man<sub&gt; 9</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</subPrécurseur&gt; oligosaccharide polypeptides naissants à l&#39;urgence est une modification commune pour les protéines de sécrétion. Bien que cette modification a été impliqué dans plusieurs processus biologiques, d&#39;autres aspects de sa fonction sont émergents, avec des preuves récentes de son rôle dans la production de signaux de contrôle de qualité glycoprotéine et la traite. Ainsi, les phénomènes liés à N-glycanes et leur traitement sont intensivement étudiés. Les méthodes qui ont été récemment développés pour l&#39;analyse protéomique ont grandement amélioré la caractérisation de la glycoprotéine N-glycanes. Néanmoins, ils ne fournissent pas un aperçu de la dynamique de la chaîne de traitement de sucre impliqués. Pour cela, l&#39;étiquetage et des protocoles d&#39;analyse pulse-chase sont utilisés qui sont généralement complexes et donnent des rendements très faibles. Nous décrivons ici une méthode simple pour l&#39;isolement et l&#39;analyse des métaboliquement marquées oligosaccharides N-liés. Le protocole est basé sur l&#39;étiquetage des cellules avec [2 -<sup&gt; 3</sup&gt; H] mannose, la dénaturation et la lyse libération enzymatique d&#39;oligosaccharides à partir soit d&#39;une protéine spécifiquement immunoprécipitée d&#39;intérêt ou de la piscine glycoprotéine générale par des traitements séquentiels avec l&#39;endo H et N-glycosidase F, suivie d&#39;une filtration moléculaire (Amicon). Dans cette méthode, les oligosaccharides isolés servir d&#39;entrée pour l&#39;analyse HPLC, qui permet la discrimination entre les différentes structures glycanniques selon le nombre d&#39;unités monosaccharides les comprenant, avec une résolution d&#39;un monosaccharide unique. En utilisant cette méthode, nous avons pu étudier haute mannose N-liés profils oligosaccharides des glycoprotéines cellulaires total après pulse-chase dans des conditions normales et sous l&#39;inhibition du protéasome. Ces profils ont été comparés à ceux obtenus à partir d&#39;un immunoprécipité ER-associé de la dégradation (ERAD) substrat. Nos résultats suggèrent que la plupart des NIH 3T3 glycoprotéines cellulaires sont relativement stables et que la plupart de leurs oligosaccharides sont taillés à l&#39;Homme<sub&gt; 9-8</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt;. En revanche, les substrats ERAD instables sont taillés à l&#39;Homme<sub&gt; 6-5</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt; Et des glycoprotéines portant ces espèces s&#39;accumuler sur l&#39;inhibition de la dégradation par le protéasome.

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Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Nous décrivons une méthode pour l&#39;analyse de l&#39;altération des N-glycanes par le début de la vie des glycoprotéines après leur biosynthèse dans les cellules de mammifères. Ceci est réalisé par pulse-chase analyse des glycanes métaboliquement étiquetés, libération enzymatique des glycoprotéines et l&#39;examen par HPLC.

Pulse-chase Analyse des chaînes de sucre N-glycoprotéines liées à des cellules de mammifères

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

pulse-chase-analysis-n-linked-sugar-chains-from-glycoproteins

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Biology

15.1K vues.  Tel Aviv University. Nous décrivons une méthode pour l'analyse de l'altération des N-glycanes par le début de la vie des glycoprotéines après leur biosynthèse dans les cellules de mammifères. Ceci est réalisé par pulse-chase analyse des glycanes métaboliquement étiquetés, libération enzymatique des glycoprotéines et l'examen par HPLC.

Vidéo: Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

En fractionnement subcellulaire situ des adhérentes et non-adhérents des cellules de mammifères

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

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Biologie

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

L&#39;analyse de l&#39;ADN double-brin Break (ORD) de réparation dans les cellules de mammifères

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSION pour le dépistage de l&#39;ARNi dans les cellules de mammifères

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenèse et analyse fonctionnelle des canaux ioniques hétérologue exprimée dans les cellules de mammifères

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analyse de la cinétique ARNm exportation nucléaire dans les cellules de mammifères par micro-injection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure. H1 is essential for mammalian development1 and regulates specific gene expression in vivo2-4. Among the highly conserved histone proteins, the family of H1 linker histones is the most heterogeneous group. There are 11 H1 subtypes in mammals that are differentially regulated during development and in different cell types. These H1 subtypes include 5 somatic H1s (H1a-e), the replacement H10, 4 germ cell specific H1 subtypes, and H1x5. The presence of multiple H1 subtypes that differ in DNA binding affinity and chromatin compaction ability6-9 provides an additional level of modulation of chromatin function. Thus, quantitative expression analysis of individual H1 subtypes, both of mRNA and proteins, is necessary for better understanding of the regulation of higher order chromatin structure and function.
Here we describe a set of assays designed for analyzing the expression levels of individual H1 subtypes (Figure 1). mRNA expression of various H1 variant genes is measured by a set of highly sensitive and quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) assays, which are faster, more accurate and require much less samples compared with the alternative approach of Northern blot analysis. Unlike most other cellular mRNA messages, mRNAs for most histone genes, including the majority of H1 genes, lack a long polyA tail, but contain a stem-loop structure at the 3' untranslated region (UTR)10. Therefore, cDNAs are prepared from total RNA by reverse transcription using random primers instead of oligo-dT primers. Realtime PCR assays with primers specific to each H1 subtypes (Table 1) are performed to obtain highly quantitative measurement of mRNA levels of individual H1 subtypes. Expression of housekeeping genes are analyzed as controls for normalization. 
The relative abundance of proteins of each H1 subtype and core histones is obtained through reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis of total histones extracted from mammalian cells11-13. The HPLC method and elution conditions described here give optimum separations of mouse H1 subtypes. By quantifying the HPLC profile, we calculate the relative proportion of individual H1 subtypes within H1 family, as well as determine the H1 to nucleosome ratio in the cells.

We describe a set of assays to analyze expression levels of H1 linker histones. mRNA of individual H1 genes are quantitatively measured by random primer based reverse transcription followed by real-time PCR, whereas protein quantification of H1 histones is achieved by HPLC analysis.

Analyse de l&#39;expression de mammifères Linker-histones sous-types

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualisation des ARNm localisés dans le réticulum endoplasmique des cellules de mammifères

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Mesure des niveaux Heme synthèse dans des cellules de mammifères

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...