우리는 기술 지원 Zehavit Frenkel와 산드라 Tolchinsky 감사드립니다. 이 작품은 관련 연구는 이스라엘 과학 재단 (1229년에서 1207년까지)과 독일 - 이스라엘 프로젝트 협력 (DIP - DFG)에서 기금에 의해 지원됩니다.

다음 프로토콜은 총 glycoproteins이나 관심의 특정 당단백질의 설탕 체인 분석위한 것입니다. 프로 시저는 기본적으로 프로토콜을 통해 언급한 몇 가지 변경 사항과 함께 두 경우 모두에 대해 동일합니다. <ol><li> N - 연결 glycans의 대사 라벨링을 위해 각 샘플에 대해 90mm 접시에 밤새 자란 포유 동물 세포의 subconfluent 문화를 사용하는 한 요구 (샘플 서로 다른 시간 지점이나 트리 트먼트를 나타내는 수 있습니다.) 이 프로토콜은 NIH 3T3 세포에 최적화되어 있습니다. </li><li> 10% dialyzed FCS와 5-15분 4 MM 나트륨 pyruvate와 함께 제공된 신선한 사전 예열 (37 ° C) 포도당없는 매체, 5 ML에서 부화하여 포도당에 대한 세포를 굶어. </li><li> 사전 예열 1 ML과 기아 매체를 교체 (37 ° C) 포도당 무료 400 μCi가 포함된 매체 [2 - 3 H] (낮은 65 농도 μCi / ML은 총 glycoproteins의 라벨에 사용됩니다) mannose - 라벨, 1 시간 동안 정상적인 조직 문화 조건에서 세포를 품어. </li><li> 각 샘플의 라벨 미디어를 제거하고, 신중하게 4 PBS 2 ML을 추가 ° 추적에 해당하는 샘플을 필요로하는 동안 맥박과 얼음 (이 샘플 펄스라고도합니다) 그들을 장소에 해당하는 샘플을 C, 2 ML 3 번 씻어서 미리 예열 (37 ° C) 정상 완료 배지, 그리고 37 CO 2 배양기에 배치 ° C 원하는 추적 기간 동안 미리 예열 정규 매체의 5 ML과 함께. </li><li> 얼음처럼 차가운 PBS 2 ML과 펄스 샘플 (이전 얼음에 위치) 3 번 린스. 세포는 다음 셀 스크레이퍼를 사용하여 두 ML PBS에서 요리를 긁어 냈어요, 그리고 2 ML Eppendorf 튜브에 배치됩니다. </li><li> 16000Xg (60-10 초)에있는 세포 단기 스핀, 표면에 뜨는를 버리고 -80에서 세포 펠릿 ° C.를 동결 </li><li> 단계 5 체이스 시간의 끝에 추적 샘플에도 6 수행합니다. </li><li> 냉동실에서 세포를 제거하고 버퍼 300 μl를 추가하여 그들을 lyse은 잠시을 vortexing하고 부화하여 버퍼 B와 함께 얼음에 20 분 얼음 20 분 잠복기, 또는 총 glycoproteins 분석의 경우, sonication 다음 (4 회, 10 초, 최대 진폭), 다음 5 분에 대한 샘플을 끓여. </li><li> 4 ° C. 20 분 16000Xg에서 lysates을 원심 분리기 새로운 Eppendorf 튜브에 뜨는을 전송하여 펠렛을 삭제. </li><li> 총 glycoproteins를 분석하면, 분자 여과 및 deglycosylation (단계 17)로 진행합니다. H2a의 당단백질의 immunoprecipitation 여기 시연에 대한 (우리의 예를 들어 안티 H2a 항체에 (Repligen) 단백질 A - 아가로 오스 비즈 1시 1분 정지하고 원하는 당단백질를위한 토끼 polyclonal 방지 H2a 항체 3 μl / 샘플 20l/sample을 추가 ), 9 단계에서 뜨는 있습니다. </li><li> 지속적으로 속도가 느린 회전에 의해 혼합, 4 ° C에서 4-16시간에 대한 샘플을 품어. </li><li> 30 초 동안 16000Xg에서 비즈를 스핀 다운, 그리고 신중하게 뜨는 사용하여 진공을 제거합니다. </li><li> 500 μl 버퍼 D를 추가하고 vortexing하여 구슬을 씻어. 12 단계에서와 같이 회전하여 표면에 뜨는를 제거합니다. 세차 3 회 반복합니다. </li><li> 비드 펠렛에 10μl denaturing 버퍼 (코 엔도 - H 키트와 함께 제공되는) 추가하고 5 분 (총 단백질을 분석하는 경우, deglycosylation가 Microcon 필터 단계 17을 수행합니다)에 대한 샘플을 끓여. </li><li> (30 초 동안 16000Xg) 비즈를 스핀 다운, 새로운 Eppendorf 튜브에 뜨는를 전송합니다. 다음 엔도 H 효소의 0.5μl는 반응 버퍼 (도 코 엔도 H 키트와 함께 제공) 10 μl와 함께 각각의 샘플에 추가되며, 샘플은 3 시간 동안 ° C 37 incubated 수 있습니다. </li><li> 단백질에서 릴리스된 glycans을 분리하려면 샘플은 다음 3 분 14000Xg에 centrifuged, 컷 - 오프 30kDa와 탈이온수 5 번 희석 및 분자 필터 (Microcon Ultracel YM30)의 상단에 위치합니다. 탈이온수 및 샘플 반복 원심 분리의 50μl을 적용합니다. 이 워시 아웃은 흐름을 통해 유지, 2 번 더 반복합니다. </li><li> 당신이 총 glycoproteins을 분석하는 경우 Microcon 필터에 lysates의 뜨는을 (9 단계에서) 적용됩니다. 3 분위한 14000Xg에서 반복 원심 분리하여 3 번 버퍼 E, 100 μl로 추출 씻으십시오. 10X 엔도 H 반응 버퍼 3 μl와 Microcon retentate에 엔도 H 효소 1.5 μl를 추가하고, 37 3 시간 동안 품어 ° C. 공개 glycans는 단계 16로 3 반복 centrifugations의 탈이온수와 eluted 있습니다. </li><li> 원하는 경우, 엔도 H 방지 glycoproteins를 포함하는 단계를 16 17 retentates은 다음 37, 버퍼 C 15 μl에 N - glycosidase F 조의 200mU와 incubated 아르 ° C를 16 H.위한 탈이온수과 용출은 단계 16로 이루어집니다. </li><li> Speed​​Vac 농축기에서 엔도 H 반응 흐름을 통해이 (단계 16 17)가 들어있는 튜브를 배치그리고 완전히 샘플을 건조 (이것은 45까지 할 수있는 ° C는이 과정을 가속). </li><li> HPLC에 대한 샘플을 준비하려면, HPLC 용매 (물, 60:40, 1 %의 인산 acetonitrile) 12 μl의 건조 알약을 resuspend. </li><li> 상수 용매의 흐름 (1 ML / 분)와 압력 (1000 2000 PSI 사이의 특정 값)으로 HPLC 장치 (Spherisorb 열 연결되어 있음) 조정 및 튜브 매 1 분 변경 분획 수집기를 놓으십시오. </li><li> HPLC 장치에 샘플을로드하고 동시에 분획 수집기를 시작합니다. </li><li> 각 샘플에서 실행하고 표준 올리 고당 혼합물의 실행에서 1 ML 48 분수를 수집합니다. </li><li> 각 분획에서 섬광 약병 500 μl를 전송하고, 물 miscible 섬광 유체 3 ML과 내용을 섞는다. </li><li> 튜브를로드하고 신틸레이션 계수기에 참조하십시오. </li><li> 노출당 비용 (CPM) 판독이 분수 번호 기능으로 꾸몄다 있습니다. </li><li> 최대 노출당 비용 (CPM) 내의 값은 다음과 같이 특정 glycan 종의 대표 : 분수를 18-21도 M8, M9에 분수 36-39에 M5, M6 분수 22-26로, 분수를 27-31로 M7, 분수 32-35에 해당하는 분수 G2M9에 40-42로 G1M9과 분수 43-45. </li><li> 각 피크 내에서 분수에 대한 노출당 비용 (CPM) 값의 합계는 특정 glycan 종의 절대 금액을 반영합니다. 각 glycan 종의 절대 금액이 포함된 mannose 잔류물의 숫자로 나누어 자세한 mannose 잔류물을 포함하는 종 더 레이블, 다음과 같이 계산되는 각 glycan 종의 &quot;상대적 어금니 금액&quot;을 획득했다는 사실에 대해 보상하기 위해서는 . 이 값은 다음 각 특정 glycan 종에 대해 &quot;전체의 %를 &#39;얻기 위해 얻은 모든 glycan 수종의 상대 어금니 금액의 합계로 나눈 것입니다. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td style="text-align:center;"> 체이스 (H) </td><td style="text-align:center;"> 0 </td><td style="text-align:center;"> 4 </td></tr><tr><td> 엔도 H (CPM)과 함께 출시 </td><td> 90,000 </td><td> 16,800 </td></tr><tr><td> N - glycosidase F (CPM)와 B 출시 </td><td> 20,400 </td><td> 3900 </td></tr><tr><td> retentate (CPM) C에서 Glycoproteins </td><td> 371700 </td><td> 127695 </td></tr><tr><td> retentate (CPM) D에 Dolichol - oligosaccharides </td><td> 4350 </td><td> 540 </td></tr><tr><td> retentate에 Dolichol - oligosaccharides (%) E </td><td> 1.4 ± 0.7 </td><td> 0.2 ± 0.2 </td></tr></tbody></table> 표 1. deglycosidases과 당단백질 샘플에 dolichol - oligosaccharides의 존재의 N - 연결 설탕 체인 릴리스의 분석. 우리는 NIH 3T3 세포에서 lysate로 펄스 체이스 절차를 적용. Microcon 여과 후, 표시된 N - 연결 oligosaccharides는 펄스 라벨 (높은 mannose 타입) 후 복잡한 유형 (잠돌군 Zz - 처리 glycans)에 해당하는 것입니다 추격전이 기간이 지나면 N - glycosidase F 조로 추가 치료와 엔도 H 주로 출시되었습니다 엔도 H 저항 oligosaccharides. 이것은 정량 분석​​ dolichol - oligosaccharides가 초기 retentate에서 라벨의 사소한 분율 차지하는 사실을 확인했습니다. 참고 : <ol class="lalpha"><li> NIH 3T3 세포는 펄스는 [2-3 H]와 라벨이 붙지만 mannose하고 완전한 매체로 추격. Microcon YM30을 통해 세포 용해 및 여과 후, 높은 mannose oligosaccharides N - 연결은 엔도 H.와 부화하여 retentates에서 출시되었습니다 </li><li> (A)에서 Microcon의 retentates에서 엔도 H - 모성 자료는 다음 N - glycosidase F 조와 incubated 및 신틸레이션 계수기로 측정 oligosaccharides를 발표했다. </li><li> 메탄올 : 전구체 glycolipids를 제거하는 물 10시 10분 3초하고, 1N NaOH의 solubilized 및 섬광 카운터에서 계산 unextracted 소재 Microcon의 retentates는 (a) 엔도 H 처리하기 전에, 클로로포름과 4 번 추출되었다 같이 취득. </li><li> Dolichol - oligosaccharides은 (C)로 1에서 설명하고 섬광 카운터에서 계산에서 추출에서 정화했다. </li><li> retentate 총 노출당 비용 (CPM)의 dolichol - oligosaccharides (D) 비율 3 실험의 평균 (C + D). </li></ol> 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 치료 세포에서 proteasomal 억제에 총 NIH 3T3 glycoproteins의 펄스 체이스 분석 1 시간 후와 펄스 라벨. [2-3 H] 우리는 glucosylated과 예상 프로파일을 획득엽 성의 전구 물질은 (Glc 두 남자 9 GlcNAc 2 (G2M9)와 G1M9) 남아 있지만, M9에있는 라벨 및 M8 종의 대부분은, 후자는 모든 포도당의 트리밍 한 mannose 잔류물 (그림 1)의 결과를 모셨습니다. 아무도 무료로 mannose 또는 기타 작은 엽 성의 전구 물질은 정화의 철저에 증명, 발견되지 않았습니다. 다소 긴 8h 체이스 다음이 M7 - 6와 M5의 작은 금액 트리밍 더 광범위한했지만, 주요 수종은 M9와 M8 (그림 1 B)로 계속했다. 추적이 proteasomal 억제제 (30 μm의 MG - 132)의 존재로 이루어졌다면, 다음과 같은 손질 종의 사소한 축적 (그림 1 C)은 오직가 발생했습니다. <img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. ERAD 기판의 설탕 체인의 정량 분석 총 glycoproteins에 비해. (A) 그림 1에있는 것과 유사한 실험에서, 각 올리 고당 종 상대 어금니 금액은 mannose 콘텐츠를 기반으로 계산했다. 우리는 각 glycan 종족에 대한 얻은 CPM 값을 변환, 모든 종류의 현재의 상대 어금니 금액의 총 합계를 기준으로 각 종족의 %가 후 두 실험의 평균 추적 시간의 함수로 꾸몄다되었습니다. (B)과 유사 을 (A) ERAD 기판 ASGPR H2a에서 공개 glycans를 제외하고 분석 나서 앞에서 4h 추적에 대한 proteasomal 억제제 MG - 132의 존재 또는 부재에 4h까지에 대한 펄스 상표와 체이스가. (C) 값 에서 MG - 132의 (A)와 (B) ASGPR H2a 및 당단백질 수영장에 대한 비교됩니다. 응급실에서 프로세스를 트리밍 N - 연결 설탕 체인 (D) 제도. 이들에 대한 M9 - 8에 비해 ERAD를 타겟으로하는 단백질 (R) 그 잠돌군 Zz와 근교로 종료합니다. 연결된 M6 - 5로 이어질 설탕 트리밍 처리 결과는 ERAD 프로세스 mannose 남은 5-6 mannose 잔류물과 종족을 항복하기 위해 N - glycans의 트리밍과 관련된 것으로 나타났습니다.

<ol>
	<li>Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+polyprenol-bound+saccharides+as+intermediates+in+glycoprotein+synthesis+in+liver.">The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).</li><li>Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+(ER)+mannosidase+I+is+compartmentalized+and+required+for+N-glycan+trimming+to+Man5-6GlcNAc2+in+glycoprotein+ER-associated+degradation.">Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).</li><li>Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum-associated+degradation+of+mammalian+glycoproteins+involves+sugar+chain+trimming+to+Man6-5GlcNAc2.">Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).</li><li>Hosokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+endoplasmic+reticulum+(ER)+degradation+of+misfolded+Null+Hong+Kong+alpha1-antitrypsin+by+human+ER+mannosidase+I.">Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I.</a> J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).</li><li>Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+misfolded+endoplasmic+reticulum+glycoproteins+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+determined+by+a+specific+oligosaccharide+structure.">Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).</li><li>Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+versus+secreted+forms+of+human+asialoglycoprotein+receptor+subunits.+Role+of+a+juxtamembrane+pentapeptide.">Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide.</a> J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).</li></ol>

HPLC 분리 살 세포의 glycans의 펄스 체이스 분석 당단백질의 생활 전반에 걸쳐 올리 고당 구조 변경의 역학을 연구하는 방법을 제공합니다. 이러한 변경은 ER의 접이식, 품질 관리 및 인신 매매 시스템 2-5에 대한 신호를 생산에 관여하는 성장 증거가있다. 방법뿐만 아니라 관심의 특정 당단백질뿐만 아니라 우리가 대조 특정 ERAD 기판의 운명과 세포 당단백질 수영장의 비교이 문서에 설명된 ?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>600E Multisolvent delivery System controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>WAT062710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck Bioscience</td>
<td>1.0003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC503024 or 4208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5301 000.016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dialyzed Foetal Calf Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>04-011-1A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Modi&#xFB01;ed Eagle's Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Invitrogen Cell Culture</td>
<td>41965039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Modi&#xFB01;ed Eagle's Medium - glucose free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D5030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D1408</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA disodium salt (Titriplex Iii)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>1084180250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>p0703S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foetal Calf Serum (FCS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>04-001-1A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Frac-100 fraction collector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham Biosciences</td>
<td>18-1000-77</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>510720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer Life Sciences</td>
<td>NET570A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>474790</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-glycosidase F (1000 units/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11365177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-octylglucoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>O3757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NIH 3T3 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
<td>CRL-1658</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Opti-Flour</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer Life Sciences</td>
<td>6013199</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>79607</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P2714</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein A-Sepharose beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Repligen</td>
<td>IPA300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium deoxycholate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>30970</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-RAD</td>
<td>161-0301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium phosphate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>342483</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium pyruvate solution (100mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spherisorb NH2 Column, 5 &mu;m, 4.6 x 250 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>PSS831115</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BDH</td>
<td>306324N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sonics and Materials, Inc.</td>
<td>690-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NIH 3T3 stably expressing H2a 6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate, 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M3148</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

pulse-chase analysis of n-linked sugar chains from glycoproteins in mammalian cells

Glc의 첨부 파일<sub&gt; 3</sub&gt; 맨<sub&gt; 9</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub응급실에서 초기 polypeptides에 올리 고당&gt; 전구체는 분비 단백질에 대한 일반적인 수정입니다. 이 수정은 여러 생물 학적 과정에 연루되었지만, 그 기능의 추가 측면 당단백질 품질 제어 및 인신 매매에 대한 신호의 생산에의 역할 최근 증거로, 신흥 있습니다. 따라서, N - glycans 연결 및 처리에 관한 현상을 집중적으로 조사되고있다. 최근 proteomic 분석을 위해 개발되었습니다 방법은 크게 당단백질 N - glycans 연결의 특성을 향상했습니다. 그럼에도 불구하고, 그들은 관련 설탕 체인 처리의 역학에 대한 통찰력을 제공하지 않습니다. 이를 위해, 라벨링 및 펄스 - 체이스 분석 프로토콜은 일반적으로 복잡하며 매우 낮은 수율을주는 데 사용됩니다. 우리는 여기서 metabolically 표시된 N - 연결 oligosaccharides의 분리 및 분석을위한 간단한 방법을 설명합니다. 프로토콜은 [2 세포의 라벨을 기반으로 -<sup&gt; 3</sup&gt; H 관심 중 하나를 구체적으로 immunoprecipitated 단백질이나 분자 여과 (Amicon) 다음 엔도 H와 N - glycosidase F와 순차 요법에 의해 일반 당단백질 수영장에서] mannose, denaturing 용해와 oligosaccharides의 효소 놓습니다. 이 방법에서는 고립 oligosaccharides은 단일 monosaccharide의 해상도와 함께, 그들로 구성된 monosaccharide 단위의 숫자에 따라 다양한 glycan 구조 사이의 차별을 허용 HPLC 분석에 대한 입력으로 제공하고 있습니다. 이 방법을 사용하여 우리는 정상적인 조건에서 펄스 ​​체이스 후 proteasome 억제에 따라 총 세포 glycoproteins 높은 mannose N - 연결 올리 고당 프로파일을 공부할 수 있었다. 이 프로파일은 immunoprecipitated ER - 관련 저하 (ERAD) 기판에서 얻은 것과 비교했다. 우리의 결과는 대부분의 NIH 3T3 세포 glycoproteins은 비교적 안정되는 그들 oligosaccharides의 대부분이 인간의 손질하는 것이 좋습니다<sub&gt; 9-8</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt;. 반면, 불안 정한 ERAD 기판은 인간을 손질 아르<sub&gt; 6-5</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub이 종 베어링&gt;을 glycoproteins은 proteasomal 저하의 억제에 축적.

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Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

우리는 포유 동물 세포에서 생합성 후 glycoproteins의 초기 생활을 통해 N - 연결 glycans의 변조 분석을위한 방법을 설명합니다. 이것은 metabolically 표시 glycans, glycoproteins와 HPLC에 의해 시험에서 효소 릴리스의 펄스 체이스 분석에 의해 이루어진다.

포유 동물 세포에 Glycoproteins의 N - 연결 설탕 체인 펄스 체이스 분석

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

pulse-chase-analysis-n-linked-sugar-chains-from-glycoproteins

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K 조회수.  Tel Aviv University. 우리는 포유 동물 세포에서 생합성 후 glycoproteins의 초기 생활을 통해 N - 연결 glycans의 변조 분석을위한 방법을 설명합니다. 이것은 metabolically 표시 glycans, glycoproteins와 HPLC에 의해 시험에서 효소 릴리스의 펄스 체이스 분석에 의해 이루어진다.