1. نمو H. المغمدة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد مجلس الوزراء السلامة الحيوية للعمل مع الفطريات عن طريق تنظيف مجلس الوزراء مع التبييض 10 ٪ ، تليها 20 دقيقة للاشعة فوق البنفسجية. ه. المغمدة في المرحلة الخميرة يتطلب مستوى السلامة (BSL) الممارسات الثاني ، في حين شكل القالب يتطلب BSLIII. استخدام نموذج الخميرة في الخطوات التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المقبل أنبوب 15 مل المخروطية مع 5 مل من برنامج تلفزيوني. حصاد مستعمرة H. المغمدة (سلالة اتش سي آي تي سي سي G217B) من لوحة بهي آغار الدم [الجلوكوز 10 جم / لتر ، السيستين 0.1 غ / لتر ، البنسلين الستربتوميسين 1 ٪ والغنم خلايا الدم الحمراء 50 مل / لتر (كولورادو شركة المصل ، كولورادو ، الولايات المتحدة الأمريكية) ] المزروعة في 37 درجة مئوية أو اتخاذ قسامة من المخزون الخميرة المجمدة عند درجة -80 وإضافته إلى برنامج تلفزيوني. دوامة الخلايا بقوة والطرد المركزي ل1100 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة بعناية طاف دون الإخلال بيليه وإضافة 10ML من برنامج تلفزيوني جديد. كرر هذا الإجراء ثلاث مرات. تعليق الخلايا في 5mL من برنامج تلفزيوني وtranfer لأنبوب مخروطي 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعطيل الخلايا مجمعة ، تمرير تعليق خلية الخميرة من خلال G1 26 / 2 ش الغناء إبرة حقنة 10ML 5 مرات في خزانة السلامة البيولوجية (باستخدام حماية الوجه). لعزل صغيرة خميرة موحد الحجم ، الطرد المركزي الخلايا في 55 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم إزالة الجزء العلوي 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة تعليق إلى خلية دورق مخروطي العقيمة التي تحتوي على 100 مل من المتوسط ​​F12 HAM (GIBCO) تستكمل مع 16G / L الجلوكوز ، 1G / L حمض الجلوتاميك ، سيستين 8.4mg / L ، 6G / L حمض الجلوتاميك ثم تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في حاضنة مع 150rpm تهتز. </li></ol> 2. ورم هجين النمو وتنقية الاجسام المضادة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل hybridomas المحدد إلى المتوسطة DMEM تحتوي على 10 ٪ الجنين مصل العجل ، NCTC 10 ٪ ، 1 ٪ غير الضرورية الأحماض الأمينية ، و 1 ٪ البنسلين ، الستربتوميسين. تنمو الخلايا في خلية قارورة الثقافة (بيكتون ديكنسون) لمدة 5-7 أيام في 37 ° C CO / 5 ٪ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي ثم المتوسطة في 1100 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وجمع كل طاف دون تعطيل الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، تنقية طاف الخلية الحرة باستخدام بروتين والراتنج / G بواسطة FPLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن بعد ذلك تركيز خريطة موقع يحسب بواسطة ELISA القبض على (1) باستخدام عنصر تحكم isotype مفتش الحكومة وفقا لمعايير (1B الشكل). </li></ol> 3. قيحة النوسجة المغمدة التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ 48 ساعة النوسجة المغمدة المرحلة الخميرة (سلالة اتش سي آي تي سي سي G217B) ثقافة نمت في المتوسط ​​F - 12 HAM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 1100 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف وإضافة برنامج تلفزيوني جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الإجراء 3.2 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير تعليق خلية الخميرة 5 مرات من خلال إبرة 26G1 / 2 باستخدام حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الطرد المركزي في 55 XG ل1 دقيقة لكتل ​​بيليه الخلية المتبقية. نقل طاف يحتوي على تعليق خلية واحدة لأنبوب جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعداد تعليق خلية واحدة باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط تركيز الخلية من أجل تحقيق 1.25 × 10 7 الخميرة (البقاء) أو 5.0 × 10 6 (CFU ، السيتوكينات والأنسجة) في suspention ميكرولتر من 50 &lt;(الشكل 2). </li></ol> 4. داخل الصفاق الإدارة التابعة للMABS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الماوس بواسطة ذيله والقفا من الرقبة (الشكل 3A). لشل حركة الماوس من القفا من عنقه في أقرب وقت ممكن إلى theears (تأكد من تناول الجلد بما فيه الكفاية بحيث الماوس cannotturn رئيسها لدغة الشخص التعامل مع الامر ، والشكل 3B 3C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استقرار إصبع withthe الذيل قليلا الضغط بلطف على كف اليد (الشكل 3D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المسحة منطقة حقن الإيثانول مع 70 ٪ قبل وضع الإبرة ، ونضح الدم للبحث عن طريق الحقن قبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 26G1 / 2 إلى piercethe الجلد وabdominalmuscles لحقن محلول يحتوي على خريطة موقع 500μg (PBS ، isotype الضد أو السيطرة على خريطة موقع لفحصها ، مخففة في برنامج تلفزيوني مل 1) إلى اليسار أو أقل thelower رباعي الحق في البطن (تجويف داخل الصفاق) ، مع الحيوان في رأسه لأسفل الموقف ، مع الحرص على تفادي أجهزة andother غشاء الداخلي (الشكل 3E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار لفترة وجيزة قبل سحب needleto يقلل من احتمالات التسرب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار مدة لا تقل عن ساعتين قبل الشروع في الخطوة التالية. </li></ol> 5. التخدير الماوس والتهابات الأنف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد باستخدام التخدير والكيتامين زيلازين عند 100 ملغ / كلغ و 10 ملغ / كلغ على التوالي. أداء الإدارة داخل الصفاق من برنامج تلفزيوني ، isotype الضد السيطرة ، أو الضد التجريبية كما هو موضح في البروتوكول المرافق مكتوب. انتظر ساعتين بعد الحقن خريطة موقع قبل التخدير الماوس والمضي قدما في العدوى داخل الأنف. إعداد الكيتامين باستخدام التخدير وزيلازين عند 100 ملغ / كلغ و 10 ملغ / كلغ على التوالي (7).<html> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال فترة الانتظار 2H ، وإعداد اللقاح capsulum النوسجة كما هو موضح في البروتوكول المرافق مكتوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسير وفقا لitens 5،1-5،5. إصبع قرصة الحيوانات مع منتاش والتحقق من عدم وجود منعكس وتؤكد أن عمل التخدير ، وبعد تخدير أو تعليق بلطف الماوس بواسطة أسنانها الأمامية إلى سلسلة من النايلون أو القطن. استخدام يقف العمود 2 لربط خيوط من أجل وقف هذه الحيوانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدارة ببطء نحو 50 ميكرولتر قيحة إلى n هل باستخدام micropipette بينما تراقب عن كثب معدل الماوس ، التنفس. السماح للماوس للراحة في هذا المنصب لمدة 2-5 دقيقة بعد الإصابة الأنف لتسهيل ترسب الخميرة في الرئتين الحيوان (الشكل 3F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إصابة الفأر ، والحفاظ على الماوس في البيئة ، ورصد دافئة (درجة الحرارة بين 25 و 37 درجة مئوية) ، وذلك باستخدام بعناية مصباح الحرارة إذا لزم الأمر ، حتى يتعافى من التخدير. عندما يستيقظ الفأر ، إعادته إلى قفص نظيفة بالمال وبالشهرة أيضا مع وصول الفريق الى الغذاء والماء. هي عادت إلى أقفاص الحيوانات لدينا منشأة ويحتفظ بها في غرفة نظيفة الحيوانية (BLSI). </li></ol> 6. بقاء الدراسات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم الحيوانات المصابة بالعدوى وهمية ، سريريا لتسرع النفس والخمول ، وobtundation ، وفقدان الوزن. يجب فحص الحيوانات مرتين يوميا على أيدي أفراد المختبر واليومية من قبل أولياء الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المنسجات مع الفئران ، وحتى على مقربة من نهاية الحياة ، وعادة ما تكون هناك أية علامات للعدوى أخرى من حدوث زيادة معتدلة في معدل التنفس. مع متقدمة من المرض ، والذي يحدث عادة 10-11 يوما ، والفئران بشكل كبير وأصبح tachypneic قد يتناقص النشاط. عادة ما يصبحون بسرعة وتنتهي المحتضرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن يتم التخلص الحيوانات بالأسى على نحو مناسب مع CO 2 في غرفة مخصصة ، ينبغي أن تعداد الحيوانات المتوفون اليومية. </li></ol> 7. CFU الدراسات ، وعلم الأنسجة السيتوكينات الدراسات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أنابيب مخروطية 15 مل مع برنامج تلفزيوني 10ML عن كل جهاز يتم تحصيلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الحيوانات 7 و 14 أيام بعد الإصابة مع inuculum شبه مميتة (5.0 × 10 6) كما هو موضح سابقا وإزالة الرئة والطحال والكبد على الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قطعة من الجهاز ليتم تقييمها وإجراء التثبيت في الفورمالين بين عشية وضحاها. وسيتم فحص الأجزاء تحت المجهر لتقييم المرضية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتصدرت أنابيب مخروطية تجهيز 50 مل مع برنامج تلفزيوني 5mL مع 70 خلية مصافى ميكرومتر لكل جهاز لتكون متجانسة. أضعف كل جزء المتبقي من الأجهزة بشكل منفصل في أنابيب سعة 50 مل باستخدام المحاقن المعقمة الغطاسون 5mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، مخفف تسلسليا الخليط الجهاز (1:100 ، 1:1000 و1:5000) ، وطبق كل 100μL التخفيف على لوحات أجار بهي الدم (2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة أقراص مثبط البروتياز إلى الخليط وفقا لتعليمات لصنع (روش ، ألمانيا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 14 يوما ، وCFUs تعداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في الجهاز الخليط في 4000xg لمدة 10 دقيقة وإزالة supernatants الجهاز ، سوف تستخدم في حفيف المستخدمة في المقايسات خلوى التي يؤديها وفقا للطرق القياسية الشركة المصنعة. </li></ol> 8. وحيدة النسيلة حماية جسم ضد H. المغمدة يعتمد على خصوصية جسم وIsotype <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MAB isotype أمر حاسم في حماية ضد H. المغمدة ، والفئران التي عولجت مع IgG1 أو MABS IgG2a إلى البقاء لفترات طويلة قد Hsp60 ملحوظ بالمقارنة مع الفئران التي تحكم تلقي خريطة موقع لIgG2b Hsp60 أو بإحدى هاتين العقوبتين عنصر تحكم isotype خريطة موقع أو برنامج تلفزيوني (الشكل 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كذلك ، في الفئران التي تلقت MABS الواقية ، كان هناك انخفاض كبير في عدد CFU الرئوي والتهاب الطحال في يوم 7 ويقلل من وحدات (2) وسجل 2.5 من أعداد الخميرة في الرئتين في يوم 14 (الشكل 5). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 : نمو H. المغمدة وhybridomas. (A) HAM السائل إعداد F - 12 من ثقافة مستعمرة واحدة حصل عليها من H. المغمدة نمت على لوحات أجار بهي الدم. (ب) ورم هجين النمو في قوارير خلية ثقافة وخريطة موقع تنقية البروتين التي كتبها A / G cromatography راتنج تقارب به. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2 : H. المغمدة إعداد اللقاح للعدوى الأنف. تعليق خلية تم الحصول عليها بعد H. يتم تعداد المغمدة المجاميع التي تعطل المحاقن والطرد المركزي من خلال إحصاء في عدادة الكريات. يتم ضبط تركيز الخلية إلى 1.25 × 10 7 (تجارب البقاء) أو 5 × 10 6 (CFUs ، السيتوكينات والأنسجة) في ميكرولتر 50 &lt;. upload/2532/2532fig3.jpg &quot;بديل =&quot; الشكل 3 &quot;/&gt; الشكل 3 : التعامل مع الفأر خلال خريطة موقع الإدارة. (أ) يتم انتقاؤها من قبل الفأر الذيل و(B و C) وظائفها من خلال عقد القفا من عنقه ، وعلى مقربة من theears. (د) عقد الذيل بين الاصبع الصغير والنخيل. (E) والحل هو حقن خريطة موقع باستخدام إبرة 26G1 / 2. (F) وحاء ويدار بواسطة الأنف المغمدة قيحة pipetting بلطف تعليق الخلية الى n هل. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4 : MABS Hsp60 يمكن أن يغير إلى التسبب في المنسجات. IP الحقن مع 500 ميكروغرام من IgG1 ، أو IgG2a MABS 2 ح قبل لبقاء لفترة طويلة بشكل ملحوظ العدوى (ع &lt;0.05 ، مقارنة مع الضوابط) ، ولكن خريطة موقع IgG2b. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5 : قرارات CFU في الرئتين في 7 و 14 يوما بعد الطعن في الأنف دون المميت مع الخمائر HC 5x10 6 من الفئران تعامل مع IP MABS Hsp60 المحدد إلى غير ذي صلة أو خريطة موقع أظهرت انخفاض العبء عن IgG1 الفطرية وIgG2a MABS معاملة الحيوانات. أشرطة سوداء تمثل CFUs في يوم 7 و 14 يوما أشرطة بيضاء بعد العدوى (* P &lt;0.001 في 7 أيام و** ع &lt;0.001 في 14 إصابة آخر أيام).

<ol>
	<li>Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+based+ELISAs+for+cryptococcal+polysaccharide.">Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide.</a> J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).</li><li>Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+heat+shock+protein+60+alter+the+pathogenesis+of+Histoplasma+capsulatum.+Infect+Immun+77.">Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77.</a> , 1357-1367 (2009).</li><li>Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+function+and+molecular+mapping+of+M+antigen+in+yeast+phase+of+Histoplasma+capsulatum.">Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum.</a> PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).</li><li>Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+antibodies+and+endemic+dimorphic+fungi.">Protective antibodies and endemic dimorphic fungi.</a> Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).</li><li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. e. e. p. e., &amp;amp, G. S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum.">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li><li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S., , ., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum.">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li><li>Smith, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+laboratory+animals+to+some+injectable+anaesthetics.">Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics.</a> Lab Anim. 27, 30-39 (1993).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

بروتوكول المعروضة هنا يدل على أن خريطة موقع لحاء يمكن المغمدة تعديل مسار المنسجات الفئران المختبرية. يمكن MABS لمستضدات سطح الخلية من مسببات تعديل الديناميكيات المعقدة التي تحدث خلال التفاعل بين المضيف والممرض ملف. هذه الدراسة على أن حماية MABS التوسط في نموذ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم المادة </th><th> شركة </th></tr><tr><td> مجلس الوزراء البيولوجية السلامة (BSL2) </td><td></td></tr><tr><td> أنابيب مخروطية 15 مل </td><td> الصقر ، BD </td></tr><tr><td> HAM F - 12 المتوسط </td><td> Gibco </td></tr><tr><td> 37 درجة مئوية شاكر </td><td></td></tr><tr><td> دوامة </td><td></td></tr><tr><td> أنابيب مخروطية 50 مل </td><td> الصقر ، BD </td></tr><tr><td> 26G1 / 2 إبرة </td><td> دينار بحريني </td></tr><tr><td> 10 مل حقنة </td><td> دينار بحريني </td></tr><tr><td> 250 مل قوارير </td><td></td></tr><tr><td> FPLC (سريع اللوني السائل بروتين) نظام </td><td> GE Helthcare </td></tr><tr><td> ELISA القارئ </td><td> BioTek </td></tr><tr><td> التخدير (الكيتامين وزيلازين) </td><td></td></tr><tr><td> يقف العمود </td><td></td></tr><tr><td> سلسلة من النايلون </td><td></td></tr><tr><td> حرارة المصباح </td><td></td></tr><tr><td> مصافى الخلية 70μm </td><td> الصقر ، BD </td></tr><tr><td> لوحات بهي آغار </td><td> Gibco </td></tr></tbody></table>

passive administration of monoclonal antibodies against h. capsulatum and others fungal pathogens

الغرض من استخدام هذه المنهجية هو 1) لتعزيز قدرتنا على حماية الأفراد مع الأجسام المضادة أو لقاح لمنع أو علاج المنسجات التي يسببها فطر النوسجة المغمدة و 2) لدراسة دور العوامل الفوعة هدفا للعلاج. لتوليد MABS ، وتحصين الفئران ، وتقييم الاستجابات المناعية باستخدام نظام متين ELISA المرحلة المتقدمة في المختبر لدينا ، ويتم اختيار أفضل الفئران المستجيب لعزل splenocytes للاندماج مع خلايا ورم هجين. وقد C57BL / 6 الفئران المستخدمة على نطاق واسع لدراسة H. المغمدة المرضية وتقديم أفضل نموذج للحصول على البيانات المطلوبة. من أجل تقييم دور MABS في العدوى ، والفئران هي intraperitoneally تدار إما مع خريطة موقع لحاء المغمدة isotype المتطابقة أو خريطة موقع السيطرة وأصاب بعد ذلك إما عن طريق الوريد (IV) ، والطرق (في) داخل الصفاق (IP) ، أو الأنف. في الأدبيات العلمية ، وفعالية MABS للالتهابات فطرية في الفئران تعتمد على وفيات ونقطة نهاية ، بالاشتراك مع وحدات formin مستعمرة (CFU) المقررة في نقاط وقت سابق. البقاء على قيد الحياة (وقت الوفاة) دراسات ضرورية لأنها تمثل أفضل الأمراض التي تصيب البشر. وبالتالي ، فإن فعالية تدخلنا ليس كافيا أن تنشأ من دون منحنيات البقاء على قيد الحياة. هذا ينطبق أيضا على إقامة فعالية لقاح أو اختبار الفوعة عن المسوخ. مع المنسجات ، وغالبا ما تذهب من الفئران التي يجري نشطة لطريق مسدود بسبب عدة ساعات. قد قدرة تدخل مثل إدارة حماية من خريطة موقع مبدئيا على الحيوان من المرض ، ولكن يمكن انتكاس المرض الذي لن يتحقق في التجارب CFU قصيرة. بالإضافة إلى بقاء والمقايسات عبء الفطرية وندرس الاستجابات الالتهابية للعدوى (الأنسجة ، والتوظيف الخلوية ، والاستجابات خلوى). من أجل البقاء / زمن لتجارب الموت ، وإصابة الفئران ورصد ما لا يقل عن مرتين يوميا بحثا عن علامات لاعتلال. لتقييم عبء الفطرية والأنسجة ، والاستجابات خلوى ، يصرح باستخدامها الفئران في أوقات مختلفة بعد العدوى. وتجرى التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية لمعهد الدراسات الحيوانية في كلية ألبرت اينشتاين للطب.

Watch this Scientific Journal Video about Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens at JoVE.com

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

وقد استخدمت C57BL / 6 الفئران لدراسة HC المرضية وتقديم النموذج الأفضل. نحن استكشاف الفوائد المحتملة للمناعة ضد هذا الفطر الخلطية ولدت MABS عدة [لH2B هيستون والصدمة الحرارية من البروتين 60kDa] أننا لاختبار فعاليتها وقائية بعد تعاطيه في التجويف الجنبي.

الإدارة السلبي من الاجسام المضادة ضد H. المغمدة مسببات الأمراض الفطرية وآخرون

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

passive-administration-monoclonal-antibodies-against-h-capsulatum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

11.8K Views.  Albert Einstein College of Medicine. وقد استخدمت C57BL / 6 الفئران لدراسة HC المرضية وتقديم النموذج الأفضل. نحن استكشاف الفوائد المحتملة للمناعة ضد هذا الفطر الخلطية ولدت MABS عدة [لH2B هيستون والصدمة الحرارية من البروتين 60kDa] أننا لاختبار فعاليتها وقائية بعد تعاطيه في التجويف الجنبي.

Video: Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

إصابة الأجنة الزرد مع مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

تقييم نشاط مضاد للفطريات المعزولة من السنخية الضامة التي كتبها متحد البؤر المجهري

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

التحول Biolistic من نيون معلم جين إلى القناص الفطرية مسببات الأمراض<em&gt; المستخفية المورمة</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

الجيل المؤتلف الإنسان مفتش حيدة النسيلة من مخلد خلايا التصنيف B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

جيل من الفئران وحيدة النسيلة الأجسام المضادة بواسطة تقنية هجين

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

جيل متغيرات الهروب من تحييد الأجسام المضادة فيروس الإنفلونزا

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

جيل من التمييزية مونوكلونل البشرية من خلايا نادرة محددة مستضد ب المتداولة في الدم

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

جيل من الأجسام المضادة ضد المنتجات الطبيعية

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

أوبسونوفاجوسيتيك قتل المقايسة لتقييم الاستجابات المناعية ضد مسببات الأمراض البكتيرية

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is requisite to phagocytosis and killing, the assay is an alternative method to&#160;opsono-phagocytic killing assays. An advantage of the opsono-adherence&#160;assay is the option of using inactivated pathogens and mammalian cell lines, which allows standardization across multiple experiments. The use of an inactivated pathogen in the assay also facilitates work with biosafety level 3 infectious agents and other virulent pathogens. In our work, the opsono-adherence assay was used to assess the functional ability of antibodies, from sera of animals immunized with an anthrax capsule-based vaccine, to induce adherence of fixed Bacillus anthracis to a mouse macrophage cell line, RAW 264.7. Automated fluorescence microscopy was used to capture images of bacilli adhering to macrophages. Increased adherence was correlated with the presence of anti-capsule antibodies in the serum. Non-human primates that exhibited high serum anti-capsule antibody concentrations were protected from anthrax challenge. Thus, the opsono-adherence assay can be used to elucidate the biological functions of antigen specific antibodies in sera, to evaluate the efficacy of vaccine candidates and other therapeutics, and to serve as a possible correlate of immunity.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is an alternative method to the opsono-phagocytic killing assay to evaluate the opsonic functions of antibodies in vaccine development.

Opsono- الالتزام بـ اختبار لتقييم الأجسام المضادة الوظيفية في تطوير اللقاح ضد عصيات الجمرة الخبيثة وغيرها من مسببات الأمراض المغلفة

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...