1. El crecimiento de H. Capsulatum <ol><li> Prepare un gabinete de bioseguridad para el trabajo con el hongo por la limpieza de la caja con lejía al 10% seguido por la radiación UV 20 min. H. capsulatum en la fase de levadura requiere de bioseguridad de nivel (BSL) prácticas II, mientras que la forma del molde requiere BSLIII. Utilizar el formulario de la levadura en los siguientes pasos. </li><li> A continuación preparar un tubo cónico de 15 ml con 5 ml de PBS. Cosecha de una colonia de H. capsulatum (cepa ATCC G217B Hc) de una placa de agar sangre BHI [glucosa de 10 g / L, cisteína 0,1 g / L, penicilina-estreptomicina al 1% y las ovejas glóbulos rojos 50 ml / L (Colorado Serum Co., Colorado, EE.UU.) ] cultivadas a 37 ° C o tomar una alícuota de las existencias de levadura congelado a -80 ° C y añadir a la PBS. Vortex las células vigorosamente y se centrifuga durante 1100 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar el precipitado y agregar 10 ml de PBS. Repita este procedimiento tres veces. Suspender las células en 5 ml de PBS y traslado a un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Para interrumpir células agregadas, pasar la suspensión de células de levadura a través de un G1 26 / 2 agujas u cantar una jeringa de 10 ml 5 veces en un gabinete de bioseguridad (uso de protección facial). Para aislar levaduras pequeñas, de tamaño uniforme, centrifugar las células a 55 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente y luego retirar la parte superior de 1 ml. </li><li > Añadir la suspensión celular a un matraz Erlenmeyer estéril que contiene 100 ml de medio HAM F12 (GIBCO) suplementado con 16 g / L de glucosa, 1 g / L de ácido glutámico, cistina 8.4mg / L, 6 g / L de ácido glutámico y luego crecer a las células a 37 ° C durante 48 horas en una incubadora con agitación 150 rpm. </li></ol> 2. Hibridoma de crecimiento y purificación de anticuerpos monoclonales <ol><li> La transferencia de los hibridomas seleccionados a medio DMEM con 10% de suero fetal bovino, 10% NCTC, el 1% no aminoácidos esenciales y 1% de penicilina-estreptomicina. Crecer las células en un frasco de cultivo celular (Becton Dickenson) durante 5-7 días a 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Centrifugar el medio a 1100 xg durante 10 min a temperatura ambiente y recoger todas las sobrenadante sin perturbar las pastillas. </li><li> A continuación, purificar el sobrenadante libre de células con una proteína de una resina / G por FPLC. </li><li> La concentración de AcM se puede calcular mediante un ELISA de captura (1) con un control de isotipo IgG de serie (fig. 1B). </li></ol> 3. Histoplasma capsulatum Preparación del inóculo <ol><li> Tome un 48 h Histoplasma capsulatum (cepa ATCC Hc G217B) cultivo en fase de levadura cultivada en HAM F-12 medianas. </li><li> Centrifugar las células a 1100 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante y añadir PBS. </li><li> Repita el procedimiento 3.2 3 veces. </li><li> Pase la suspensión de células de levadura 5 veces a través de una aguja 26G1 / 2 con una jeringa. </li><li> Centrifugar la suspensión a 55 g durante 1 min a grupos pellet de células residuales. Transferir el sobrenadante que contiene la única suspensión de células a un tubo nuevo. </li><li> Enumerar la única suspensión de células con un hematocitómetro. </li><li> Ajustar la concentración de células a fin de alcanzar 1,25 x 10 7 levadura (supervivencia) o 5,0 x 10 6 (CFU, citoquinas y la histología) en una suspención de &lt;50 l (Figura 2). </li></ol> 4. La administración intraperitoneal de los anticuerpos monoclonales <ol><li> Levante el ratón por la cola y la piel del cuello (Fig. 3A). Inmovilizar el ratón por la piel de su cuello, cerca de theears como sea posible (asegúrese de tomar suficiente piel para que el ratón cannotturn su cabeza para morder la persona encargada de ella, la figura 3B y 3C). </li><li> Estabilizar el dedo conel colita presiona suavemente contra la palma de la mano (Figura 3D). </li><li> Limpie el área de la inyección con etanol al 70% antes de colocar la aguja y aspirar a buscar la sangre antes de la inyección. </li><li> Utilice el 26G1 / 2 a piercethe piel y abdominalmuscles para inyectar la solución que contiene 500μg MAB (PBS, control de isotipo de anticuerpos o el MAB de la prueba, diluido en 1 ml de PBS) en la izquierda thelower o en el cuadrante inferior derecho del abdomen (la cavidad intraperitoneal), con el animal en la posición cabeza abajo, teniendo cuidado de evitar los órganos andother membrana interna (Figura 3E). </li><li> Espere un momento antes de retirar el needleto reducir la probabilidad de fuga. </li><li> Espere un mínimo de dos horas antes de proceder al siguiente paso. </li></ol> 5. Anestesia del ratón y las infecciones intranasales <ol><li> Prepare la anestesia con ketamina y xilazina a 100 mg / kg y 10 mg / kg, respectivamente. Realizar la administración intraperitoneal de PBS, control de isotipo de anticuerpos, o un anticuerpo experimental como se describe en el protocolo escrito que lo acompaña. Espere dos horas después de la inyección antes de anestesiar el AcM de ratón y de proceder a la infección intranasal. Prepare la anestesia con ketamina y xilazina con dosis de 100 mg / kg y 10 mg / Kg, respectivamente (7).<html> </li><li> Durante el período de 2 horas de espera, preparar el inóculo capsulum Histoplasma como se describe en el protocolo escrito que lo acompaña. </li><li> Proceder de acuerdo a la itens 5,1 a 5,5. Toe pellizco a los animales con una pinza y para verificar la ausencia de reflejos y confirman que la anestesia trabajado. Después de anestesiarlo, suspender suavemente el ratón por sus dientes frente a un nylon o hilo de algodón. Use 2 soportes de columna para atar las cuerdas con el fin de suspender los animales. </li><li> Poco a poco la administración de aproximadamente 50 l de inóculo en un orificio nasal utilizando una micropipeta, mientras que la tasa de cerca del ratón respiración. Deje que el ratón para descansar en esta posición durante 2-5 minutos después de la infección intranasal para facilitar la deposición de las levaduras en los pulmones de los animales (Figura 3F). </li><li> Después de que el ratón ha sido infectado, mantener el ratón en un ambiente controlado y cálido (temperatura entre 25 y 37 ° C), con cuidado utilizando una lámpara de calor si es necesario, hasta que se recupere de la anestesia. Cuando se despierta el ratón, volver a una jaula limpia con acceso ad libitum al alimento y agua. Las jaulas son devueltos a nuestras instalaciones y animales mantenidos en un cuarto animal limpio (BLSI). </li></ol> 6. Los estudios de supervivencia <ol><li> Evaluar los animales infectados y se burlan de infectados clínicamente para la taquipnea, letargia, embotamiento y pérdida de peso. Los animales se debe comprobar dos veces al día por los miembros del laboratorio y todos los días por los cuidadores de animales. </li><li> Con histoplasmosis murino, hasta cerca del final de la vida, generalmente no hay signos evidentes de la infección, excepto un leve aumento en la tasa de respiración. Con enfermedad avanzada, lo que suele ocurrir 10 a 11 días, los ratones se taquipnea y significativamente disminuidos de actividad. Típicamente se convierten rápidamente en moribundo y expirar. </li><li> Lamentando los animales deben ser sacrificados adecuadamente con CO 2 en una cámara dedicada, animales muertos deben ser enumerados todos los días. </li></ol> 7. Estudios UFC, Histología y citoquinas Estudios <ol><li> Prepare 15 ml tubos cónicos de 10 ml con PBS para cada órgano para ser recogidos. </li><li> La eutanasia a los animales 7 y 14 días después de la infección con un inuculum subletal (5,0 x 10 6) como se ha demostrado y extirpar el pulmón, el bazo y el hígado de inmediato. </li><li> Extraer un pedazo de órgano para ser evaluados y realizar la fijación en formol durante la noche. Las secciones se examinan bajo el microscopio para su evaluación patológica. </li><li> Prepare 50 ml tubos cónicos con 5 ml de PBS encabezó con 70 filtros de células micras para cada órgano para ser homogeneizada. Macerar cada porción restante de los órganos por separado en el uso de tubos de 50 ml estéril émbolos de la jeringa de 5 ml. </li><li> A continuación, en serie diluida homogeneizados de órganos (1:100, 1:1000 y 1:5000) y 100μL placa de cada dilución en placas de agar BHI-sangre (2). </li><li> Añadir tabletas inhibidor de la proteasa a los homogeneizados de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Roche, Alemania). </li><li> Incubar las placas a 37 ° C durante un máximo de 14 días y UFC enumerar. </li><li> Centrifugar los homogeneizados de órganos en 4000xg durante 10 minutos y retirar sobrenadantes de órganos, Whish se utilizará en uso en los ensayos de citoquinas a cabo por métodos estándar de acuerdo con el fabricante. </li></ol> 8. Protección de anticuerpo monoclonal contra el H. Capsulatum depende de la especificidad del anticuerpo y del isotipo <ol><li> MAb isotipo es fundamental en la protección contra H. capsulatum, como los ratones tratados con mAb IgG1 o IgG2a de Hsp60 tienen una supervivencia significativamente más prolongada en comparación con el control de los ratones que recibieron un mAb IgG2b de Hsp60 o ya sea un control de isotipo mAb o PBS (Figura 4). </li><li> Además, en los ratones que recibieron los mAbs de protección, se produjo una reducción significativa en el número de UFC pulmonar y del bazo en el día 7 y se reduce de 2 y 2,5 unidades de registro de los números de levaduras en los pulmones a los 14 días (Figura 5). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Crecimiento de la H. capsulatum y hibridomas. (A) HAM F-12 líquido cultura preparación de una sola colonia obtenida de H. capsulatum crecido en placas de agar sangre BHI. (B) el crecimiento del hibridoma en frascos de cultivo celular y purificación de proteínas por el mAb una resina / G a través de cromatografía de afinidad. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: H. capsulatum preparación del inóculo para la infección por vía intranasal. Suspensión celular obtenida después de H. trastornos agregados capsulatum con una jeringa y la centrifugación se enumera contando en un hemocitómetro. Concentración celular se ajusta a 1,25 x 10 7 (experimentos de supervivencia) o 5 x 10 6 (UFC, citoquinas y la histología) en &lt;50 mL. upload/2532/2532fig3.jpg &quot;alt =&quot; Figura 3 &quot;/&gt; Figura 3: manejo del ratón durante la administración de MAB. (A) El ratón es recogido por la cola y (B y C) inmovilizada mediante la celebración de la nuca de su cuello lo más cerca posible theears. (D) La cola se lleva a cabo entre el dedo meñique y la palma. (E) La solución AcM se inyecta con una aguja 26G1 / 2. (F) El H. capsulatum inóculo se administra por vía intranasal pipeteando suavemente la suspensión celular en un orificio nasal. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: anticuerpos monoclonales para Hsp60 puede alterar la patogénesis de la histoplasmosis. inyecciones ip con 500 mg de IgG1, IgG2a Acm o 2 h antes de la supervivencia de la infección prolonga significativamente (p &lt;0,05, en comparación con los controles), pero un IgG2b mAb. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: UFC determinaciones en los pulmones a los 7 y 14 días después de un desafío intranasal subletales con 5x10 6 levaduras Hc de los ratones tratados ip con mAbs seleccionados para Hsp60 o AcMo irrelevante mostraron una reducción en la carga de hongos de IgG1 e IgG2a Acm los animales tratados. Barras de color negro representan UFC en el día 7 y barras blancas 14 días post-infección (* p &lt;0,001 en 7 días y ** p &lt;0,001 a los 14 días post infección).

<ol>
	<li>Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+based+ELISAs+for+cryptococcal+polysaccharide.">Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide.</a> J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).</li><li>Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+heat+shock+protein+60+alter+the+pathogenesis+of+Histoplasma+capsulatum.+Infect+Immun+77.">Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77.</a> , 1357-1367 (2009).</li><li>Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+function+and+molecular+mapping+of+M+antigen+in+yeast+phase+of+Histoplasma+capsulatum.">Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum.</a> PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).</li><li>Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+antibodies+and+endemic+dimorphic+fungi.">Protective antibodies and endemic dimorphic fungi.</a> Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).</li><li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. e. e. p. e., &amp;amp, G. S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum.">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li><li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S., , ., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum.">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li><li>Smith, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+laboratory+animals+to+some+injectable+anaesthetics.">Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics.</a> Lab Anim. 27, 30-39 (1993).</li></ol>

El protocolo presentado aquí demuestra que el mAb a H. capsulatum puede modificar el curso de la histoplasmosis experimental murino. Anticuerpos monoclonales contra los antígenos de superficie celular de los patógenos puede modificar la compleja dinámica que se producen durante la interacción entre un huésped y un agente patógeno. Este estudio establece que la protección de los mAbs mediar en un modelo murino de la histoplasmosis letal cuando se inyecta por vía intraperitoneal, y sugiere las proteínas...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del material </th><th> Empresa </th></tr><tr><td> Cabina de seguridad biológica (BSL2) </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubos cónicos </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> HAM F-12 medianas </td><td> Gibco </td></tr><tr><td> 37 ° C agitador </td><td></td></tr><tr><td> Vórtice </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml tubos cónicos </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> 26G1 / 2 agujas </td><td> BD </td></tr><tr><td> 10 ml jeringa </td><td> BD </td></tr><tr><td> Frascos de 250 ml </td><td></td></tr><tr><td> FPLC (cromatografía líquida rápida de proteínas) del sistema </td><td> GE Helthcare </td></tr><tr><td> Lector de ELISA </td><td> BioTek </td></tr><tr><td> Anestesia (ketamina y xilazina) </td><td></td></tr><tr><td> Columna se encuentra </td><td></td></tr><tr><td> Cuerdas de nylon </td><td></td></tr><tr><td> Lámpara de calor </td><td></td></tr><tr><td> Filtros de 70μm celular </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> Placas de agar BHI </td><td> Gibco </td></tr></tbody></table>

passive administration of monoclonal antibodies against h. capsulatum and others fungal pathogens

El propósito de la utilización de esta metodología es: 1) para avanzar en nuestra capacidad para proteger a las personas con anticuerpos o vacunas para la prevención o el tratamiento de la histoplasmosis causadas por el hongo Histoplasma capsulatum y 2) para examinar el papel de factores de virulencia como blanco para la terapia. Para generar mAbs, los ratones son inmunizados, la respuesta inmune se evaluó a través de una fase sólida del sistema ELISA desarrollado en nuestro laboratorio, y la mejor respuesta ratones se seleccionan para el aislamiento de esplenocitos para la fusión con células de hibridoma. Ratones C57BL / 6 se han utilizado ampliamente para estudiar H. patogénesis capsulatum y el mejor modelo para la obtención de los datos requeridos. Con el fin de evaluar el papel de los mAbs de la infección, los ratones se administraron por vía intraperitoneal, ya sea con mAb a H. capsulatum o isotipo control pareado mAb y luego infectados por cualquiera vía intravenosa (iv), por vía intraperitoneal (ip) o intranasal (in) rutas. En la literatura científica, la eficacia de mAbs de las infecciones por hongos en ratones se basa en la mortalidad como punto final, junto con metformina unidades de colonias (UFC) evaluaciones en momentos anteriores. La supervivencia (tiempo hasta la muerte) son necesarios estudios a medida que mejor representan las enfermedades humanas. Por lo tanto, la eficacia de nuestra intervención no adecuada sería establecer sin curvas de supervivencia. Esto también es válido para establecer la eficacia de la vacuna o prueba de los mutantes de la virulencia. Con histoplasmosis, los ratones a menudo pasan de ser enérgico a los muertos durante varias horas. La capacidad de una intervención como la administración de un mAb inicialmente puede proteger a un animal de la enfermedad, pero la enfermedad recaída puede que no se llevaría a cabo en el corto experimentos UFC. Además de la supervivencia y los ensayos de carga de hongos, se analiza la respuesta inflamatoria a la infección (histología, el reclutamiento celular, las respuestas de citocinas). Para la supervivencia / hora para los experimentos de muerte, los ratones están infectados y controlados por lo menos dos veces al día para detectar signos de morbilidad. Para evaluar la carga de hongos, la histopatología, y las respuestas de citocinas, los ratones son sacrificados en las varias horas después de la infección. Los experimentos con animales se llevan a cabo de acuerdo con las directrices del Instituto de Estudios Animal de la Facultad de Medicina Albert Einstein.

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Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Ratones C57BL / 6 se han utilizado para estudiar la patogénesis Hc y el mejor modelo. Estamos explorando los beneficios potenciales de la inmunidad humoral contra este hongo y generó varias Acm [de la histona H2B y 60kDa proteína de choque térmico] que la prueba de su eficacia protectora tras la administración intraperitoneal.

Administración pasiva de anticuerpos monoclonales contra H. capsulatum Y otros hongos patógenos

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

11.8K vistas.  Albert Einstein College of Medicine. Ratones C57BL / 6 se han utilizado para estudiar la patogénesis Hc y el mejor modelo. Estamos explorando los beneficios potenciales de la inmunidad humoral contra este hongo y generó varias Acm [de la histona H2B y 60kDa proteína de choque térmico] que la prueba de su eficacia protectora tras la administración intraperitoneal.

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Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Investigación

Inmunología e Infección

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

La evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

Transformación biolística de un fluorescente Tagged gen en el oportunista por hongos patógenos<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Generación de recombinante humano IgG anticuerpos monoclonales a partir de células inmortalizadas B Ordenada

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

Generación de anticuerpos monoclonales murino por el hibridoma Tecnología

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

Generación de variantes de Escape de neutralizar anticuerpos Monoclonal del Virus de la Influenza

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Generación de anticuerpos monoclonales humanos discriminativo de células B antígeno específicas raras circulan en sangre

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Generación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonofagocítico asesinato ensayo para evaluar las respuestas inmunológicas contra patógenos bacterianos

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is requisite to phagocytosis and killing, the assay is an alternative method to&#160;opsono-phagocytic killing assays. An advantage of the opsono-adherence&#160;assay is the option of using inactivated pathogens and mammalian cell lines, which allows standardization across multiple experiments. The use of an inactivated pathogen in the assay also facilitates work with biosafety level 3 infectious agents and other virulent pathogens. In our work, the opsono-adherence assay was used to assess the functional ability of antibodies, from sera of animals immunized with an anthrax capsule-based vaccine, to induce adherence of fixed Bacillus anthracis to a mouse macrophage cell line, RAW 264.7. Automated fluorescence microscopy was used to capture images of bacilli adhering to macrophages. Increased adherence was correlated with the presence of anti-capsule antibodies in the serum. Non-human primates that exhibited high serum anti-capsule antibody concentrations were protected from anthrax challenge. Thus, the opsono-adherence assay can be used to elucidate the biological functions of antigen specific antibodies in sera, to evaluate the efficacy of vaccine candidates and other therapeutics, and to serve as a possible correlate of immunity.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is an alternative method to the opsono-phagocytic killing assay to evaluate the opsonic functions of antibodies in vaccine development.

Ensayo de adhesión a Opsono para evaluar anticuerpos funcionales en el desarrollo de vacunas contra la antrasis bacillus y otros patógenos encapsulados

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...