1. Wachstum von H. Capsulatum <ol><li> Bereiten Sie eine Biosicherheitswerkbank für die Arbeit mit dem Pilz durch die Reinigung der Schrank mit 10% Bleichmittel durch 20 min UV-Bestrahlung gefolgt. H. capsulatum in der Hefe Phase erfordert Biosafety Level (BSL) II Praktiken, während die Form Form erfordert BSLIII. Verwenden Sie Hefe Form in den folgenden Schritten. </li><li> Nächste bereiten ein 15 ml konische Röhrchen mit 5 ml PBS. Ernte eine Kolonie von H. capsulatum (Stamm ATCC Hc G217B) aus einer BHI Blutagarplatte [Glucose 10 g / L, Cystein 0,1 g / L, Penicillin-Streptomycin 1% und rote Blutzellen von Schafen 50 ml / L (Colorado Serum Co., Colorado, USA) ] bei 37 ° C kultiviert oder einen aliquoten aus gefrorenen Hefe Lager bei -80 ° C und fügen Sie sie der PBS. Vortex die Zellen kräftig und Zentrifuge für 1100 xg für 10 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet und fügen 10 mL frisches PBS. Wiederholen Sie diese Prozedur dreimal. Die Zellen in 5 ml PBS und Transfer zu einem 50 mL konischen Rohr. </li><li> Zu stören aggregierten Zellen, vorbei an der Hefezelle Suspension durch eine 26 G1 / 2 Nadel u singen ein 10 mL Spritze 5 Mal in einer Biosicherheitswerkbank (mit Gesichtsschutz). Zur Isolierung kleine, gleichmäßig Größe Hefe, Zentrifuge die Zellen bei 55 xg für 1 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie dann die Besten 1 ml. </li><li > Fügen Sie die Zellsuspension auf eine sterile Erlenmeyerkolben mit 100 ml HAM F12-Medium (Gibco) mit 16g / l Glucose, 1 g / L Glutaminsäure, 8.4mg / L Cystin, 6g / L Glutaminsäure und dann wachsen die Zellen bei 37 ergänzt ° C für 48 h in einem Inkubator mit 150rpm geschüttelt. </li></ol> 2. Hybridoma Wachstum und Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern <ol><li> Übertragen Sie die ausgewählten Hybridome auf DMEM-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 10% NCTC, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren und 1% Penicillin-Streptomycin. Wachsen die Zellen in einer Zellkulturflasche (Becton Dickenson) für 5-7 Tage bei 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Dann Zentrifuge das Medium bei 1100 xg für 10 min bei Raumtemperatur und sammeln Sie alle Überstand ohne Störung des Pellets. </li><li> Anschließend reinigen die zellfreie Überstand mit einem Protein A / G Harz durch FPLC. </li><li> Der mAk-Konzentration kann dann durch einen ELISA (1) mit einem IgG Isotyp-Kontrolle als Standard (Abbildung 1B) berechnet werden. </li></ol> 3. Histoplasma capsulatum Inokulum Vorbereitung <ol><li> Nehmen Sie einen 48 h Histoplasma capsulatum (Stamm ATCC Hc G217B) Hefephase Kultur in HAM F-12-Medium. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1100 xg für 10 min. Überstand verwerfen und fügen Sie frisches PBS. </li><li> Wiederholen Sie die 3,2 Prozedur 3 mal. </li><li> Pass the Hefezellensuspension 5 mal durch eine 26G1 / 2 Nadel mit einer Spritze. </li><li> Die Suspension bei 55 xg für 1 min auf Pellet verbleibende Zellhaufen. Übertragen Sie den Überstand mit dem einzigen Zellsuspension in ein neues Röhrchen. </li><li> Auflisten der einzelnen Zell-Suspension mit einer Zählkammer. </li><li> Passen Sie die Zellkonzentration um 1,25 x 10 7 Hefe (Überleben) oder 5,0 x 10 6 (CFU, Zytokine und Histologie) in einer Aufschwemmung von &lt;50 ul (Abbildung 2) zu erreichen. </li></ol> 4. Intraperitoneale Verabreichung der MAbs <ol><li> Pick-up mit der Maus am Schwanz und Kragen (Abb. 3A). Immobilisierung der Maus durch das Genick des Halses so nah wie möglich theears (achten Sie darauf, nehmen Sie genügend Haut, so dass die Maus den Kopf cannotturn auf der Bearbeiter beißen; 3B und 3C). </li><li> Stabilisieren Sie den Schwanz withthe kleinen Finger leicht gegen die Handfläche (Abbildung 3D) gedrückt. </li><li> Swab die Injektion mit 70% Ethanol, bevor Sie die Nadel und absaugen, um das Blut vor der Injektion zu suchen. </li><li> Verwenden Sie die 26G1 / 2 auf Haut und abdominalmuscles piercethe der mAb-Lösung enthält 500μg (PBS, Isotypkontrollantikörper oder mAb zu prüfenden verdünnt in 1 mL PBS) in thelower linken oder unteren rechten Unterbauch (Bauchhöhle) zu injizieren, mit das Tier in den Kopf Position, kümmert sich um die Membran andother inneren Organe (Abbildung 3E) zu vermeiden. </li><li> Warten Sie kurz vor dem Rückzug der needleto reduzieren die Wahrscheinlichkeit von Leckagen. </li><li> Warten Sie mindestens zwei Stunden, bevor Sie den nächsten Schritt. </li></ol> 5. Maus Anästhesie und intranasale Infektionen <ol><li> Bereiten Sie die Betäubung mit Ketamin und Xylazin bei 100 mg / kg und 10 mg / kg. Führen intraperitoneale Verabreichung von PBS, Isotypkontrollantikörper oder experimentellen Antikörper wie in der beiliegenden schriftlichen Protokoll beschrieben. Warten Sie zwei Stunden nach der Injektion mAb vor betäuben die Maus und die Sie mit der intranasalen Infektion. Bereiten Anästhesie mit Ketamin und Xylazin bei 100 mg / kg und 10 mg / kg (7).<html> </li><li> Während der 2h Wartezeit, bereiten die Histoplasma capsulum Inokulum wie in den begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben. </li><li> Gehen Sie nach der itens 5,1 bis 5,5. Toe Prise die Tiere mit einer Pinzette und das Fehlen des Reflexes überprüfen und zu bestätigen, dass die Anästhesie gearbeitet. Nach Betäubung, sanft setzt die Maus durch seine Vorderzähne zu einer Nylon oder Baumwolle String. Verwenden Sie 2-Säule steht, um die Saiten binden, um die Tiere auszusetzen. </li><li> Langsam verwalten rund 50 ul Inokulum in eine nare mit einer Mikropipette, während eine sorgfältige Überwachung der Maus Atemfrequenz. Lassen Sie die Maus, um in dieser Position für 2-5 min nach intranasaler Infektion Rest der Abscheidung der Hefe in das Tier die Lunge (Abb. 3F) zu erleichtern. </li><li> Nach der Maus infiziert wurde, halten Sie die Maustaste in einem überwachten, warme Umgebung (Temperatur zwischen 25 und 37 ° C), sorgfältig unter Verwendung einer Wärmelampe, wenn nötig, bis er aus der Narkose erholt. Wenn die Maus erwacht, schicken Sie es an einem sauberen Käfig mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser. Die Käfige sind für unsere Tier-Anlage zurück und hielt in einem sauberen Tierraum (BLSI). </li></ol> 6. Survival-Studies <ol><li> Beurteilen infiziert und mock-infizierten Tieren klinisch Tachypnoe, Lethargie, Abgestumpftheit, und Gewichtsverlust. Die Tiere sollten zweimal täglich im Labor Mitglieder und täglich von Tierpflegern überprüft werden. </li><li> Mit der Maus Histoplasmose, bis nahe an das Ende des Lebens, gibt es normalerweise keine offensichtlichen Anzeichen der Infektion andere als ein leichter Anstieg in der Atemfrequenz. Mit fortgeschrittener Erkrankung, die in der Regel geschieht 10 bis 11 Tagen werden die Mäuse deutlich Tachypnoe und verminderte Aktivität. Typischerweise werden sie rasch zu moribund und verfallen. </li><li> Distressed Tiere entsprechend sollte mit CO 2 in einem eigenen Raum eingeschläfert werden sollte Verstorbene Tiere täglich aufgezählt werden. </li></ol> 7. CFU Studies, Histologie und Zytokine Studies <ol><li> Bereiten Sie 15 ml konische Röhrchen mit 10 ml PBS für jedes Organ zu erheben. </li><li> Euthanize Tieren 7 und 14 Tage nach der Infektion mit einem subletalen inuculum (5,0 x 10 6) wie zuvor dargestellt, und entfernen Sie die Lunge, Milz und Leber sofort. </li><li> Nehmen Sie ein Stück von der Orgel zu bewerten und führen Sie die Fixierung in Formalin über Nacht. Die Abschnitte werden unter dem Mikroskop auf pathologische Auswertung untersucht werden. </li><li> Bereiten Sie 50 ml konische Röhrchen mit 5 ml PBS belegt mit 70 um Zelle Siebe für jedes Organ, homogenisiert werden. Mazerat jeweils verbleibende Teil der Organe getrennt in den 50 ml Röhrchen mit sterilen 5 ml Spritze Kolben. </li><li> Als nächstes seriell verdünnten Orgel Homogenaten (1:100, 1:1000 und 1:5000) und die Platte 100 &amp;mgr; l jeder Verdünnung auf BHI-Blut-Agar-Platten (2). </li><li> Add Protease-Inhibitor Tabletten, die Homogenate nach den Herstellerangaben (Roche, Deutschland). </li><li> Die Platten bei 37 ° C für bis zu 14 Tage und aufzählen KBE. </li><li> Centrifuge die Orgel Homogenate 4000xg für 10 min und entfernen Orgel Überstände werden whish in Verwendung in der Zytokin-Assays durch Standardverfahren nach Angaben des Herstellers durchgeführt werden. </li></ol> 8. Monoklonale Antikörper zum Schutz vor H. Capsulatum ist abhängig von Antikörper Spezifität und Isotyp <ol><li> MAb Isotyp ist von entscheidender Bedeutung beim Schutz gegen H. capsulatum, als Mäuse mit IgG1 oder IgG2a mAb an Hsp60 behandelt wurden, signifikant verlängertes Überleben im Vergleich zu Mäusen Erhalt einer IgG2b mAb an Hsp60 oder entweder ein Isotyp-Kontroll-mAb oder PBS (Abbildung 4) zu kontrollieren. </li><li> Weitere, in Mäusen, die schützende mAbs erhielten, wurde eine signifikante Reduktion in der Anzahl der Lungen-und Milz-CFU am Tag 7 und sinkt von 2 und 2,5 log-Einheiten von Hefe-Nummern in der Lunge am Tag 14 (Abbildung 5). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Wachstum von H. capsulatum und Hybridome. (A) Liquid HAM F-12 Kultur-Präparation aus einer einzelnen Kolonie von H. erhalten capsulatum auf einer BHI-Agar-Platten kultiviert. (B) Hybridoma Wachstum in Zellkulturflaschen und mAb Reinigung durch Protein A / G Harz mit Affinität cromatography. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: H. capsulatum Inokulum Vorbereitung für die intranasale Infektion. Zellsuspension nach H. erhalten capsulatum Aggregate Störung mit einer Spritze und Zentrifugation wird durch Zählen in einer Zählkammer gezählt. Zellkonzentration ist eingestellt auf 1,25 x 10 7 (Überlebens-Experimente) oder 5 x 10 6 (CFU, Zytokine und Histologie) in &lt;50 ul. upload/2532/2532fig3.jpg &quot;alt =&quot; Bild 3 &quot;/&gt; Abbildung 3: Maus Handhabung während mAb Verwaltung. (A) Die Maus wird durch den Schwanz hob und (B und C), indem das Genick seines Halses zu theears nahe immobilisiert. (D) Der Schwanz ist zwischen dem kleinen Finger und Handfläche. (E) Die mAb-Lösung injiziert wird mit einem 26G1 / 2 Nadel. (F) Der H. capsulatum Inokulum wird intranasal durch vorsichtiges Pipettieren der Zellsuspension in eine nare verwaltet. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4: MAbs zu Hsp60 kann der Pathogenese der Histoplasmose ändern. ip Injektionen mit 500 ug IgG1, IgG2a oder mAbs 2 h vor der Infektion signifikant verlängerten Überlebenszeit (p &lt;0,05, im Vergleich zur Kontrollgruppe), sondern eine IgG2b mAb. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5: CFU-Bestimmungen in den Lungen bei 7 und 14 Tage nach einer subletalen intranasale Herausforderung mit 5x10 6 HC Hefen der behandelten Mäuse ip mit ausgewählten mAb an Hsp60 oder irrelevant mAb zeigte Reduzierung Pilz Belastung für IgG1 und IgG2a mAb behandelten Tieren. Schwarze Balken stellen KBE am Tag 7 und weißen Balken 14 Tage nach der Infektion (* p &lt;0,001 bei 7 Tagen und ** p &lt;0,001 bei 14 Tagen nach der Infektion).

<ol>
	<li>Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+based+ELISAs+for+cryptococcal+polysaccharide.">Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide.</a> J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).</li><li>Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+heat+shock+protein+60+alter+the+pathogenesis+of+Histoplasma+capsulatum.+Infect+Immun+77.">Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77.</a> , 1357-1367 (2009).</li><li>Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+function+and+molecular+mapping+of+M+antigen+in+yeast+phase+of+Histoplasma+capsulatum.">Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum.</a> PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).</li><li>Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+antibodies+and+endemic+dimorphic+fungi.">Protective antibodies and endemic dimorphic fungi.</a> Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).</li><li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. e. e. p. e., &amp;amp, G. S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum.">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li><li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S., , ., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum.">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li><li>Smith, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+laboratory+animals+to+some+injectable+anaesthetics.">Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics.</a> Lab Anim. 27, 30-39 (1993).</li></ol>

Das Protokoll hier vorgestellten zeigt, dass mAb an H. ist capsulatum ändern können Laufe der experimentellen murinen Histoplasmose. MAbs zu Zelloberflächenantigene von Krankheitserregern können die komplexe Dynamik, die während des Zusammenspiels zwischen einem Host und einem Erreger auftreten. Diese Studie stellt fest, dass mAbs Schutz in einem Mausmodell der tödlichen Histoplasmose vermitteln, wenn intraperitoneal, und es schlägt Kandidaten-Proteine ​​für die Entwicklung von Impfstoffen,...

<table border="1"><tbody><tr><th> Bezeichnung des Gutes </th><th> Firma </th></tr><tr><td> Biologische Sicherheitswerkbank (BSL2) </td><td></td></tr><tr><td> 15 mL konischen Rohren </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> HAM F-12-Medium </td><td> Gibco </td></tr><tr><td> 37 ° C Schüttler </td><td></td></tr><tr><td> Wirbel </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml konische Röhrchen </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> 26G1 / 2 Nadel </td><td> BD </td></tr><tr><td> 10 mL Spritze </td><td> BD </td></tr><tr><td> 250 ml Flaschen </td><td></td></tr><tr><td> FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography)-System </td><td> GE Helthcare </td></tr><tr><td> ELISA-Reader </td><td> BioTek </td></tr><tr><td> Anästhesie (Ketamin und Xylazin) </td><td></td></tr><tr><td> Spalte steht </td><td></td></tr><tr><td> Nylon-String </td><td></td></tr><tr><td> Wärmelampe </td><td></td></tr><tr><td> 70μm Zelle Siebe </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> BHI-Agar-Platten </td><td> Gibco </td></tr></tbody></table>

passive administration of monoclonal antibodies against h. capsulatum and others fungal pathogens

Der Zweck der Anwendung dieser Methodik ist 1) unsere Fähigkeit voraus, um Menschen mit Antikörper oder Impfstoff zur Vorbeugung oder Behandlung Histoplasmose durch den Pilz Histoplasma capsulatum und 2) die Rolle der Virulenzfaktoren als Ziel für eine Therapie zu untersuchen schützen. Zur Erzeugung von mAbs, Mäuse immunisiert sind, sind die Immunreaktionen anhand einer Festphasen-ELISA-System in unserem Labor entwickelt und die besten Responder-Mäuse sind für die Isolierung von Milzzellen für die Fusion mit Hybridomzellen ausgewählt. C57BL / 6 Mäuse wurden ausgiebig verwendet, um H.-Studie capsulatum Pathogenese und bieten das beste Modell für die Beschaffung der erforderlichen Daten. Um die Rolle der mAbs in Infektion zu beurteilen, werden Mäuse intraperitoneal entweder mit mAb an H. verabreicht capsulatum oder Isotyp Kontroll-mAb und dann infiziert entweder durch intravenöse (iv), intraperitoneal (ip) oder intranasal (in) Routen. In der wissenschaftlichen Literatur setzt Wirksamkeit von mAbs gegen Pilzinfektionen bei Mäusen auf die Mortalität als Endpunkt, in Verbindung mit Kolonie formin Einheiten (KBE) Einschätzungen zu früheren Zeitpunkten. Survival (Zeit bis zum Tod) Studien sind notwendig, da sie am besten repräsentieren menschliche Krankheiten. So würde die Wirksamkeit unserer Maßnahmen nicht ausreichend, ohne Überlebenskurven ermittelt werden. Dies gilt auch für die Errichtung Wirksamkeit des Impfstoffes oder Prüfung von Mutanten für die Virulenz wahr. Mit Histoplasmose, die Mäuse oft als energisch, um tote über mehrere Stunden gehen. Die Kapazität einer Intervention, wie die Verwaltung eines mAb kann anfänglich zu schützen ein Tier aus Krankheit, aber die Krankheit kann Rückfall, die nicht in kurzer CFU Experimente realisiert werden. Zusätzlich zu Überleben und Pilz-Belastung Assays, untersuchen wir die entzündliche Antwort auf eine Infektion (Histologie, zelluläre Rekrutierung, Zytokin-Antworten). Für das Überleben / Zeit bis zum Tod Experimente werden die Mäuse infiziert und beobachtet mindestens zweimal täglich auf Anzeichen von Morbidität. Um zu beurteilen, Pilz-Belastung, Histopathologie und Zytokinreaktionen werden die Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion eingeschläfert. Tierversuche sind nach den Richtlinien des Institute for Animal Studies der Albert Einstein College of Medicine durchgeführt.

Watch this Scientific Journal Video about Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens at JoVE.com

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

C57BL / 6 Mäuse wurden verwendet, um Hc Pathogenese zu studieren und bieten das beste Modell. Wir erforschen die potenziellen Vorteile der humoralen Immunität gegen diesen Pilz erzeugt und mehrere mAbs [zum Histon H2B und ein heat shock protein 60kDa], dass wir für ihre Schutzwirkung nach intraperitonealer Verabreichung getestet.

Passive Verwaltung von monoklonalen Antikörpern gegen H. capsulatum Ua Pilzpathogene

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

passive-administration-monoclonal-antibodies-against-h-capsulatum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

11.8K Aufrufe.  Albert Einstein College of Medicine. C57BL / 6 Mäuse wurden verwendet, um Hc Pathogenese zu studieren und bieten das beste Modell. Wir erforschen die potenziellen Vorteile der humoralen Immunität gegen diesen Pilz erzeugt und mehrere mAbs [zum Histon H2B und ein heat shock protein 60kDa], dass wir für ihre Schutzwirkung nach intraperitonealer Verabreichung getestet.

Serie: Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

Die Infektion von Zebrafisch-Embryos mit Intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

Biolistischen Transformation einer Leuchtstoff Tagged-Gens in den Opportunistic Pilzpathogenentwicklung<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridomtechnologie

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

Generation von Escape Varianten des Influenza-Virus Monoclonal Antikörper neutralisieren

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Generierung von monoklonalen Antikörpern gegen Naturprodukte

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic Tötung Assay Immunreaktionen gegen bakterielle Krankheitserreger zu bewerten

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is requisite to phagocytosis and killing, the assay is an alternative method to&#160;opsono-phagocytic killing assays. An advantage of the opsono-adherence&#160;assay is the option of using inactivated pathogens and mammalian cell lines, which allows standardization across multiple experiments. The use of an inactivated pathogen in the assay also facilitates work with biosafety level 3 infectious agents and other virulent pathogens. In our work, the opsono-adherence assay was used to assess the functional ability of antibodies, from sera of animals immunized with an anthrax capsule-based vaccine, to induce adherence of fixed Bacillus anthracis to a mouse macrophage cell line, RAW 264.7. Automated fluorescence microscopy was used to capture images of bacilli adhering to macrophages. Increased adherence was correlated with the presence of anti-capsule antibodies in the serum. Non-human primates that exhibited high serum anti-capsule antibody concentrations were protected from anthrax challenge. Thus, the opsono-adherence assay can be used to elucidate the biological functions of antigen specific antibodies in sera, to evaluate the efficacy of vaccine candidates and other therapeutics, and to serve as a possible correlate of immunity.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is an alternative method to the opsono-phagocytic killing assay to evaluate the opsonic functions of antibodies in vaccine development.

Opsono-Adherence Assay zur Bewertung funktioneller Antikörper in der Impfstoffentwicklung gegen Bacillus anthracis und andere verkapselte Pathogene

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...