1. צמיחה של ח Capsulatum <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ארון biosafety לעבודה עם הפטרייה על ידי ניקוי הממשלה עם אקונומיקה 10% ואחריו קרינה UV 20 דקות. ח capsulatum בשלב שמרים biosafety דורש רמה (מנהלת הליגה) נוהלי השנייה, בעוד טופס עובש דורש BSLIII. השתמש בטופס שמרים את השלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא להכין צינור חרוטי 15 מ&quot;ל עם 5 מ&quot;ל של PBS. קציר מושבה של ח capsulatum (זן HC ATCC G217B) מתוך צלחת אגר דם BHI [גלוקוז 10 גר &#39;/ ליטר, 0.1 ציסטאין g / L, פניצילין, סטרפטומיצין 1% וכבשים כדוריות דם אדומות 50 מ&quot;ל / L (קולורדו סרום ושות&#39;, קולורדו, ארה&quot;ב) ] מעובד על 37 מעלות צלזיוס או לקחת aliquot ממלאי שמרים קפוא ב -80 ° C ולהוסיף אותו PBS. וורטקס התאים במרץ צנטריפוגות עבור XG 1100 עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את supernatant מבלי להפריע גלולה ולהוסיף 10ml של PBS טריים. חזור על תהליך זה שלוש פעמים. להשעות את התאים של 5 מ&quot;ל PBS ואת תשלומי העברה צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשבש את התאים מצטברים, להעביר את ההשעיה תא שמרים דרך G1 26 / 2 מחט u לשיר מזרק 10 מ&quot;ל 5 פעמים ארון biosafety (באמצעות הגנה על הפנים). כדי לבודד שמרים קטנה, בגודל אחיד, צנטריפוגה התאים XG ב 55 דקות 1 בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להסיר את מ&quot;ל העליון 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ההשעיה התא בקבוק erlenmeyer סטרילית המכילה 100 מ&quot;ל של מדיום F12 HAM (GIBCO) בתוספת גלוקוז 16G / L, 1g / L חומצה גלוטמית, 8.4mg / L ציסטין, 6g / L חומצה גלוטמית ואז לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות באינקובטור עם רעד 150rpm. </li></ol> 2. Hybridoma צמיחה טיהור של נוגדנים חד שבטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את hybridomas שנבחרו בינוני DMEM המכילה 10% נסיוב עגל עוברית, NCTC 10%, 1% שאינם חיוניים חומצות אמינו של 1% פניצילין, סטרפטומיצין. לגדל את התאים בבקבוק תא התרבות (בקטון דיקנסון) במשך 5-7 ימים ב 37 מעלות CO 5 / 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז בצנטריפוגה בינוני XG ב 1100 עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר לאסוף את כל supernatant מבלי לשבש את כדורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא לטהר את supernatant חינם התא בעזרת חלבון שרף / G על ידי FPLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריכוז MAB אז יכול להיות מחושב על ידי לכידת ELISA (1) שימוש בפקד אלוטיפ IgG כסטנדרט (איור 1B). </li></ol> 3. הכנה Histoplasma Capsulatum Inoculum <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו 48 שעות capsulatum Histoplasma (זן HC ATCC G217B) שמרים שלב תרבות גדל בינוני F-12 HAM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים XG ב 1100 ל 10 דקות. בטל supernatant ולהוסיף PBS טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על ההליך 3.2 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את ההשעיה תא שמרים 5 פעמים באמצעות מחט 26G1 / 2 באמצעות מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את ההשעיה על XG 55 דקות עד 1 אשכולות גלולה תא שיורית. מעבירים את supernatant המכיל את ההשעיה תא בודד לצינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת ההשעיה תא בודד באמצעות hematocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הריכוז התא על מנת להשיג 1.25 x 10 7 שמרים (הישרדות) או 5.0 x 10 6 (CFU, ציטוקינים היסטולוגיה) ב suspention של μL 50 &lt;(איור 2). </li></ol> 4. מינהל intraperitoneal של מבז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרים את העכבר בזנבו לבין בעורפו של הצוואר (איור 3A). לשתק את העכבר על ידי בעורפו שלה קרוב theears ככל האפשר (לוודא לקחת את העור מספיק כך העכבר cannotturn ראשו לנשוך את האדם לטיפול בה; איור 3B ו - 3C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצב את withthe זנב האצבע הקטנה לחצה בעדינות על כף היד (איור 3D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוגית באזור ההזרקה עם אתנול 70% לפני ששמים את המחט כדי לשאוב לחפש דם לפני הזרקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 26G1 / 2 piercethe העור abdominalmuscles להזריק את הפתרון הכולל 500μg מב (PBS, נוגדן אלוטיפ מלאה או מב להיבדק, בדילול מלא 1 מ&quot;ל PBS) לתוך שמאל thelower או נמוך ברבע הבטן ימינה (חלל intraperitoneal), עם החיה בראש את הפוזיציה, מקפיד להימנע andother הסרעפת לאיברים הפנימיים (איור 3E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו לזמן קצר לפני הנסיגה needleto להקטין את הסיכוי של דליפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו לפחות שעתיים לפני שתמשיך לשלב הבא. </li></ol> 5. עכבר הרדמה וזיהומים Intranasal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ההרדמה באמצעות קטמין ו xylazine על 100 מ&quot;ג / ק&quot;ג ו - 10 מ&quot;ג / ק&quot;ג, בהתאמה. בצע הממשל intraperitoneal של PBS, נוגדן אלוטיפ שליטה, או נוגדן ניסיוני כמתואר בפרוטוקול כתוב הנלווים. חכה שעתיים לאחר ההזרקה MAB לפני הרדמה העכבר שתמשיך הזיהום intranasal. הכן קטמין הרדמה באמצעות ו xylazine על 100 מ&quot;ג / ק&quot;ג ו - 10 מ&quot;ג / ק&quot;ג, בהתאמה (7).<html> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתקופה 2h ההמתנה, להכין את inoculum capsulum Histoplasma כמתואר בפרוטוקול כתוב הנלווים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לפי itens 5.1 עד 5.5. טו קמצוץ החיות עם פינצטה כדי לוודא העדר רפלקס ולוודא כי ההרדמה עבד. Anaesthetization לאחר בעדינות להשעות את העכבר על השיניים הקדמיות שלה ניילון או חוט כותנה. שימוש 2 עומד טור לקשור את החוטים על מנת להשעות את החיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט לנהל כ -50 inoculum μl לתוך n האם באמצעות micropipette בעוד מקרוב אחר קצב הנשימה של העכבר. אפשר העכבר כדי לנוח בתפקיד זה במשך 2-5 דקות לאחר ההדבקה intranasal כדי להקל על בתצהיר של השמרים לתוך הריאות של החיה (איור 3F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עכבר נדבק בווירוס, לשמור על העכבר בסביבה, פיקוח חם (בטמפרטורה שבין 25 ל 37 מעלות צלזיוס), בזהירות ניצול מנורת חום במידת הצורך, עד שהוא מתאושש מן ההרדמה. כאשר מתעורר עכבר, להחזיר אותו לכלוב נקי עם גישה כרצונך מודעה מזון ומים. כלובים מוחזרים למתקן החיה שלנו כל הזמן בחדר חיית נקי (BLSI). </li></ol> 6. הישרדות מחקרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת בעלי חיים נגועים מעושה נגוע קלינית tachypnea, עייפות, obtundation, וירידה במשקל. החיות צריך להיבדק פעמיים ביום על ידי אנשי המעבדה יומי על ידי מטפלות בבעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם histoplasmosis Murine, עד קרוב לסוף חייו, יש בדרך כלל כל סימני הזיהום למעט עלייה קלה בקצב הנשימה. עם מחלה מתקדמת, אשר קורה בדרך כלל 10-11 ימים, עכברים הופכים tachypneic משמעותית ויש להם פעילות מצומצמת. בדרך כלל הם להפוך במהירות הגוססת ואת לפוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים במצוקה צריך להיות מורדמים כראוי עם CO 2 בתא ייעודי, חיות המנוח צריכה להיות מנה יומית. </li></ol> 7. מחקרים CFU, היסטולוגיה ו ציטוקינים ללימודים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 15 מבחנות חרוטי מ&quot;ל עם 10 מ&quot;ל PBS עבור כל איבר להיות שנאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים בעלי חיים 7 ו - 14 ימים לאחר ההדבקה עם inuculum sublethal (5.0 x 10 6) כפי שהוצג קודם ולהסיר את הריאות, הטחול והכבד מיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חתיכת איבר להיבדק ולבצע את הקיבעון של לילה פורמלין. סעיפים תיבחן תחת מיקרוסקופ להערכה פתולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מבחנות חרוטי מ&quot;ל עם 5 מ&quot;ל PBS ועליו 70 strainers תא מיקרומטר עבור כל איבר להיות הומוגני. מרוכך כל החלק הנותר של איברים בנפרד לתוך צינורות 50 מ&quot;ל באמצעות מזרק סטרילי בוכנות 5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, סדרתי לדלל homogenates איבר (1:100, 1:1000 ו - 1:5000) ו 100μL צלחת של דילול על כל BHI דם צלחות אגר (2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מעכב פרוטאז טבליות אל homogenates בהתאם להוראות של ייצור (רוש, גרמניה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך עד 14 ימים CFUs למנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה homogenates איבר ב 4000xg במשך 10 דקות ולהסיר supernatants איברים, whish ישמש המשמשים את מבחני ציטוקין שבוצעה על ידי שיטות סטנדרטיות על פי היצרן. </li></ol> 8. נוגדנים חד שבטיים כנגד ה &#39;הגנה Capsulatum תלוי ספציפיות נוגדן ו אלוטיפ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MAB אלוטיפ הוא קריטי להגנה מפני ח capsulatum, כמו העכברים שטופלו IgG1 או IgG2a מבז כדי Hsp60 יש להישרדות ממושכת באופן משמעותי לעומת שליטה עכברים שקיבלו מאב IgG2b כדי Hsp60 או או פקד אלוטיפ MAB או PBS (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן, בעכברים שקיבלו מבז מגן, היתה ירידה משמעותית במספר CFU ריאתי הטחול ביום 7 וירידה של 2 ו -2.5 יחידות יומן של מספרים השמרים לריאות בכל יום 14 (איור 5). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: גידול של ח capsulatum ו hybridomas. (א) HAM נוזלי הכנה F-12 תרבות מהמושבה יחיד המתקבל ח capsulatum גדל על BHI דם צלחות אגר. (ב) Hybridoma צמיחה בתרבות צלוחיות תא וטיהור MAB על ידי חלבון A / G באמצעות שרף cromatography זיקה. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2: ח&#39; capsulatum הכנה inoculum לזיהום intranasal. תא ההשעיה המתקבל לאחר ח שיבוש אגרגטים capsulatum על ידי מזרק צנטריפוגה היא על ידי ספירת המנויים ב hemocytometer. ריכוז נייד מותאם 1.25 x 10 7 (ניסויים הישרדות) או 5 x 10 6 (CFUs, ציטוקינים היסטולוגיה) ב μL 50 &lt;. upload/2532/2532fig3.jpg &quot;alt =&quot; איור 3 &quot;/&gt; איור 3: טיפול עכבר במהלך מב הממשל. (א) העכבר הוא הרים בזנבו (B ו-C) משותקת על ידי החזקת בעורפו של הצוואר שלו קרוב theears. (ד) הזנב מוחזק בין האצבע בכף מעט. (ה) הפתרון MAB מוזרק באמצעות מחט 26G1 / 2. (ו) ח capsulatum inoculum מנוהל על ידי intranasally בעדינות pipetting ההשעיה לתוך התא n האם. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4: מבז כדי Hsp60 יכול לשנות את בפתוגנזה של histoplasmosis. זריקות ip עם 500 מיקרוגרם של IgG1, או IgG2a מבז 2 שעות לפני קיום זיהום ממושך באופן משמעותי (p &lt;בהשוואה לקבוצת הביקורת, 0.05), אך IgG2b מב. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5: קביעות CFU בריאות ב 7 ו - 14 ימים לאחר אתגר intranasal sublethal עם 5x10 6 שמרים HC-IP של עכברים שטופלו מבז שנבחרו Hsp60 או מאב לא רלוונטי הראו ירידה בנטל פטרייתי עבור IgG1 ו IgG2a מבז טיפול בבעלי חיים. פסים שחורים מייצגים CFUs ביום 7 וברים לבן 14 ימים לאחר הפגיעה (* p &lt;0.001 ב 7 ימים ** p &lt;0.001 ב 14 הימים שלאחר ההדבקה).

<ol>
	<li>Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+based+ELISAs+for+cryptococcal+polysaccharide.">Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide.</a> J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).</li><li>Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+heat+shock+protein+60+alter+the+pathogenesis+of+Histoplasma+capsulatum.+Infect+Immun+77.">Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77.</a> , 1357-1367 (2009).</li><li>Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+function+and+molecular+mapping+of+M+antigen+in+yeast+phase+of+Histoplasma+capsulatum.">Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum.</a> PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).</li><li>Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+antibodies+and+endemic+dimorphic+fungi.">Protective antibodies and endemic dimorphic fungi.</a> Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).</li><li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. e. e. p. e., &amp;amp, G. S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum.">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li><li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S., , ., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum.">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li><li>Smith, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+laboratory+animals+to+some+injectable+anaesthetics.">Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics.</a> Lab Anim. 27, 30-39 (1993).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול המוצג כאן מוכיח כי MAB של אל ח capsulatum יכול לשנות את מהלך histoplasmosis Murine ניסיוני. מבז אל פני השטח אנטיגנים התא של פתוגנים יכול לשנות את הדינמיקה מורכבים המתרחשים במהלך משחק הגומלין בין המארחת לבין הפתוגן. מחקר זה קובע כי מבז לתווך הגנה במודל Murine של histoplasmosis קטלנ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם חומר </th><th> חברה </th></tr><tr><td> ארון בטיחות ביולוגית (BSL2) </td><td></td></tr><tr><td> 15 צינורות חרוטי מ&quot;ל </td><td> פלקון, BD </td></tr><tr><td> HAM-F-12 בינוני </td><td> Gibco </td></tr><tr><td> 37 ° C שייקר </td><td></td></tr><tr><td> מערבולת </td><td></td></tr><tr><td> 50 צינורות חרוטי מ&quot;ל </td><td> פלקון, BD </td></tr><tr><td> 26G1 / 2 מחט </td><td> BD </td></tr><tr><td> 10 מ&quot;ל מזרק </td><td> BD </td></tr><tr><td> 250 מ&quot;ל צלוחיות </td><td></td></tr><tr><td> FPLC (כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר) מערכת </td><td> GE Helthcare </td></tr><tr><td> ELISA הקורא </td><td> BioTek </td></tr><tr><td> הרדמה (קטמין ו Xylazine) </td><td></td></tr><tr><td> טור עומד </td><td></td></tr><tr><td> חוט ניילון </td><td></td></tr><tr><td> מחממים מנורה </td><td></td></tr><tr><td> תא strainers 70μm </td><td> פלקון, BD </td></tr><tr><td> BHI צלחות אגר </td><td> Gibco </td></tr></tbody></table>

passive administration of monoclonal antibodies against h. capsulatum and others fungal pathogens

מטרת השימוש של מתודולוגיה זו היא 1) כדי לקדם את היכולת שלנו להגן על אנשים עם נוגדנים או חיסון למניעת או לטיפול histoplasmosis נגרמת על ידי פטרייה capsulatum Histoplasma ו 2) לבחון את התפקיד של גורמים ארסיות כיעד לטיפול. כדי ליצור מבז, עכברים הם שחוסנו, תגובות החיסון מוערכים באמצעות בשלב מוצק ELISA המערכת שפותחה במעבדה שלנו, את העכברים הטובים ביותר המגיב נבחרים הבידוד של splenocytes היתוך עם תאים hybridoma. C57BL עכברים / 6 נעשה שימוש נרחב ללמוד H. בפתוגנזה capsulatum ולספק את המודל הטוב ביותר להשגת הנתונים הדרושים. על מנת להעריך את התפקיד של מבז זיהום, עכברים הם intraperitoneally מנוהל גם עם מב ח ל capsulatum או אלוטיפ בהתאמה מלאה מב ו נגוע אז או תוך ורידי (iv), intraperitoneal (IP), או intranasal (ב) מסלולים. בספרות המדעית, היעילות של מבז עבור זיהומים פטרייתיים בעכברים מסתמך על תמותה כנקודת סיום, בשיתוף עם formin יחידות המושבה (CFU) הערכות בנקודות זמן קודמות. (זמן מותו) מחקרים הישרדות נחוצים כמו שהם מייצגים בצורה הטובה ביותר מחלות אנושיות. לכן, יעילותה של התערבות שלנו לא מספקת תוקם ללא עקומות ההישרדות. הדבר נכון גם להקמת היעילות של חיסון או בדיקה של מוטנטים עבור ארסיות. עם histoplasmosis, העכברים לעתים קרובות ללכת מלהיות אנרגטית מת על כמה שעות. הקיבולת של התערבות כגון ניהול של MAB עשוי בתחילה להגן מפני מחלות בעלי חיים, אך המחלה יכולה להישנות אשר לא ימומש בקיצור ניסויים CFU. בנוסף הישרדות מבחני עומס פטרייתי, אנו בוחנים את תגובות דלקתיות לזיהום (היסטולוגיה, גיוס הסלולר, תגובות ציטוקינים). עבור ההישרדות / שעה כדי ניסויים מוות, עכברים נגועים ומנוטרים לפחות פעמיים ביום סימנים של תחלואה. על מנת להעריך את הנטל פטרייתי, histopathology, ותגובות ציטוקינים, בעכברים מורדמים בזמנים שונים לאחר ההדבקה. ניסויים בבעלי חיים מבוצעות על פי ההנחיות של המכון ללימודי החיות של אלברט איינשטיין לרפואה.

Watch this Scientific Journal Video about Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens at JoVE.com

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

C57BL עכברים / 6 שימשו ללמוד בפתוגנזה HC ולספק את המודל הטוב ביותר. אנחנו בוחנים את היתרונות הפוטנציאליים של חסינות הלחות נגד פטריות זה שנוצר מבז מספר [כדי H2B היסטון ואת הלם חום 60kDa חלבון] כי בדקנו את יעילות ההגנה שלהם לאחר מתן intraperitoneal.

מינהל פסיבי של נוגדנים חד שבטיים נגד ח capsulatum ואחרים פתוגנים פטרייתיים

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

passive-administration-monoclonal-antibodies-against-h-capsulatum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

11.8K Views.  Albert Einstein College of Medicine. C57BL עכברים / 6 שימשו ללמוד בפתוגנזה HC ולספק את המודל הטוב ביותר. אנחנו בוחנים את היתרונות הפוטנציאליים של חסינות הלחות נגד פטריות זה שנוצר מבז מספר [כדי H2B היסטון ואת הלם חום 60kDa חלבון] כי בדקנו את יעילות ההגנה שלהם לאחר מתן intraperitoneal.

Video: Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

שינוי Biolistic של פלורסנט Tagged Gene לOpportunistic פטרייתיים פתוגן<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

דור של רקומביננטי אדם IgG נוגדנים חד שבטיים מתאים הממוינים B הונצחו

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

הדור של Murine חד-שבטיים נוגדנים על ידי Hybridoma טכנולוגיה

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

דור של נוגדנים חד-שבטיים כנגד מוצרים טבעיים

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is requisite to phagocytosis and killing, the assay is an alternative method to&#160;opsono-phagocytic killing assays. An advantage of the opsono-adherence&#160;assay is the option of using inactivated pathogens and mammalian cell lines, which allows standardization across multiple experiments. The use of an inactivated pathogen in the assay also facilitates work with biosafety level 3 infectious agents and other virulent pathogens. In our work, the opsono-adherence assay was used to assess the functional ability of antibodies, from sera of animals immunized with an anthrax capsule-based vaccine, to induce adherence of fixed Bacillus anthracis to a mouse macrophage cell line, RAW 264.7. Automated fluorescence microscopy was used to capture images of bacilli adhering to macrophages. Increased adherence was correlated with the presence of anti-capsule antibodies in the serum. Non-human primates that exhibited high serum anti-capsule antibody concentrations were protected from anthrax challenge. Thus, the opsono-adherence assay can be used to elucidate the biological functions of antigen specific antibodies in sera, to evaluate the efficacy of vaccine candidates and other therapeutics, and to serve as a possible correlate of immunity.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is an alternative method to the opsono-phagocytic killing assay to evaluate the opsonic functions of antibodies in vaccine development.

Opsono-דבקות Assay כדי להעריך נוגדנים תפקודיים בפיתוח חיסונים נגד אנתרקיס Bacillus ופתוגנים אנקפסולציה אחרים

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...