1。 H.の成長Capsulatum <ol><li> 20分の紫外線照射で10％の漂白剤でキャビネットをクリーニングして菌を使用のためのバイオセーフティキャビネットを準備します。H.金型のフォームがBSLIIIを必要としながら酵母の段階でcapsulatumは 、 バイオセーフティレベル（BSL）IIの実践が必要です。次の手順で、酵母のフォームを使用してください。 </li><li>次にPBS 5 mlで15 mlコニカルチューブを準備する。 H.のコロニーを収穫BHI血液寒天プレートからcapsulatum（株Hcは ATCC G217B）[グルコース10g / Lの、システイン0.1g / Lの、ペニシリン-ストレプトマイシン1％、ヒツジ赤血球を50ml / L（コロラド血清（株）、コロラド州、米国） ] 37℃で培養または-80℃で凍結した酵母株からアリコートを取り、PBSに追加します。激しくボルテックス細胞を、室温で10分間1100 × gで間遠心します。慎重にペレットが剥がれないように上清を除去し、新鮮なPBS 10mlのを追加します。この手順を3回繰り返します。 50 mLコニカルチューブにPBSとトランスファーの5mLの中に細胞を懸濁する。 </li><li>凝集細胞を破壊するために、26 G1 / 2針を介して酵母の細胞懸濁液を渡すuはバイオセーフティキャビネット（顔の保護を使って）に10mLのシリンジを5回歌う。小さい、均一サイズの酵母を分離するには、室温で1分間を55 × gで細胞を遠心分離し、上位1 mlを削除します。 </li><li > 、16グラム/ Lグルコースを添加したHAM F12培地（GIBCO）を100 mlを含む滅菌三角フラスコに細胞懸濁液を追加して1グラム/ Lグルタミン酸、8.4mg / Lシスチン、6グラム/ Lグルタミン酸、その後37℃で細胞を育てる揺れ150rpmでインキュベーターで48時間° C。 </li></ol> 2。モノクローナル抗体のハイブリドーマの増殖と精製<ol><li> 10％ウシ胎児血清、10％のNCTC、1％非必須アミノ酸、1％ペニシリン - ストレプトマイシンを含むDMEM培地に選択したハイブリドーマを転送する。 37℃で5-7日間細胞培養フラスコ（ベクトンディッキンソン）で細胞を成長させる℃/ 5％CO 2。 </li><li>その後、室温で10分間、1100 × gで培地を遠心し、ペレットを中断することなく、すべての上清を集める。 </li><li>次に、FPLCによってプロテインA / G樹脂を用いて無細胞上清を精製する。 </li><li>モノクローナル抗体の濃度は、標準としてのIgGアイソタイプコントロール（図1B）を使用してキャプチャELISA（1）によって計算することができます。 </li></ol> （3） ヒストプラスマカプスラーツムの 接種の準備 <ol><li> HAM F - 12培地で増殖させた48時間ヒストプラスマカプスラーツム （株Hcは ATCC G217B）酵母の相の文化を取る。 </li><li> 10分1100 xgで細胞を遠心分離します。上清を捨て、新しいPBSを加える。 </li><li> 3.2の手順を3回繰り返します。 </li><li>注射器を使用して26G1 / 2針を通して酵母の細胞懸濁液を5回渡す。 </li><li>ペレット残留細胞のクラスターへ1分、55 × gで懸濁液を遠心分離します。新しいチューブに単一の細胞懸濁液を含む上清を移す。 </li><li>血球計数器を用いて、単一の細胞懸濁液を列挙する。 </li><li> &lt;50μL（図2）のサスペンションで1.25 × 10 7酵母（生存）または5.0 × 10 6（CFU、サイトカイン及び組織学を）達成するために、細胞濃度を調整します。 </li></ol> 4。モノクローナル抗体の腹腔内投与<ol><li>尾と首の首筋（図3A）でマウスを拾う。できるだけtheears（;図3Bと3Cマウスはそれを扱う人を噛まないようにその頭をcannotturnように、十分な皮膚を取ることを確認してください）​​に近いとして、その首の首筋でマウスを固定化する。 </li><li>そっと手のひら（図3D）押し付けテールwiththe小指を安定させる。 </li><li>注入前に血液を探すために吸引する綿棒針を置く前に70％エタノールで注入領域と。 </li><li>で、thelowerの左または右下腹部（腹腔内腔）に500μgを（PBS、アイソタイプコントロール抗体またはモノクローナル抗体1mLのPBSで希釈し、テストする）を含む抗体溶液を注入するために皮膚とabdominalmusclesをpiercetheする26G1 / 2を使用ダイヤフラムandother内臓（図3E）をしないように注意しながら下の位置に頭の中で動物、。 </li><li> needletoが漏れの可能性を減らす撤退する前にしばらく待って。 </li><li>次のステップに進む前に二時間以上待つ。 </li></ol> 5。マウスの麻酔と鼻腔内感染症<ol><li>は100 mg / kg及び10 mg / kgを、それぞれでケタミンとキシラジンを使用して麻酔を準備します。腹腔内のPBSを投与、アイソタイプコントロール抗体、またはそれに関するプロトコルで説明されているように実験的な抗体を実行します。マウスを麻酔し、鼻腔感染症に進む前に、モノクローナル抗体の注射後2時間待機する。 それぞれ100 mg / kgおよび10 mg / kgを、（7）で、ケタミンとキシラジンを使用して麻酔を準備します。<html> </li><li> 2H待機期間中は、添付の書かれたプロトコルで説明されているヒストプラスマcapsulumの接種を準備する。 </li><li> itens 5.1から5.5にしたがって進んでください。ピンセットで動物を挟まないようTOEと反射がないことを確認し、麻酔が働いていることを確認する。anaesthetization後、軽くナイロンや綿の文字列にその前歯でマウスを中断。動物を中断するために文字列を結びつけるために2列のスタンドを使用してください。 </li><li>密接にマウスの呼吸数をモニターしながら徐々にマイクロピペットを用いてナーレに約50μl接種を管理する。マウスは、動物の肺（図3F）に酵母の沈着を促進するために、鼻腔内感染後2〜5分間のためにこの姿勢で休息することができます。 </li><li>マウスが感染された後、必要に応じて、麻酔から回復するまで慎重に、ヒートランプを利用し、監視し、暖かい環境（25〜37℃間の温度）でマウスを維持する。ときにマウスの目を覚まし、食物と水に随意アクセス権を持つクリーンなケージに戻します。 ケージは私たちの動物施設に戻されるときれいな動物室（BLSI）に保管されている。 </li></ol> 6。生存学<ol><li>頻呼吸、嗜眠、鈍麻、および体重減少のために臨床的に感染したとモック感染動物を評価する。動物は、実験室のメンバーと動物の世話で毎日が毎日二度チェックする必要があります。 </li><li>マウスヒストプラスマ症で、人生の終わり近くになるまで、呼吸数の軽度の増加以外の感染の明らかな兆候は、通常ありません。 通常10〜11日から起こる先進的な疾患で、マウスは著しくtachypneicになり、活動減退している。通常、彼らは急速に瀕死状態になると期限切れになります。 </li><li>苦しめられた動物は、専用のチャンバー内のCO 2を適切に安楽死されるべきである、死亡動物は毎日列挙すべきである。 </li></ol> 7。 CFU学、組織学およびサイトカインの研究<ol><li>収集する各臓器に対して10mLのPBSで15 mlコニカルチューブを準備します。 </li><li>前述のように亜致死inuculum（5.0 × 10 6）を持つ動物7と感染後14日を安楽死させるとすぐに肺、脾臓と肝臓を取り除く。 </li><li>評価される臓器の一部を削除し、ホルマリンで一晩固定を行います。セクションは、病理学的評価のための顕微鏡で検査されます。 </li><li> 5mLのPBSで50 mlコニカルチューブを準備するには、均質化するために各臓器に対して70μmのセルストレーナーをトッピング。滅菌5mLのシリンジのプランジャを使用して50 mLチューブに別々の臓器の残りの各部分を痩せ衰えさせる。 </li><li>次に、シリアルBHI血液寒天プレート（2）で臓器のホモジネート（1:100、1:1000と1:5000）と各希釈のプレートで100μLに希釈します。 </li><li>製造者の指示（Roche社、ドイツ）にしたがってホモジネートするプロテアーゼ阻害剤の錠剤を追加。 </li><li> ° C 14日間および列挙外装フィルムの上まで、37でプレートをインキュベートする。 </li><li> 10分間4000xgで臓器のホモジネートを遠心し、臓器の上清を除去、シューッという音は、メーカーによると、標準的な方法によって実行されるサイトカインのアッセイで使用で使用されます。 </li></ol> 8。 H.に対するモノクローナル抗体の保護Capsulatumは、抗体の特異性およびアイソタイプに依存しています<ol><li>モノクローナル抗体アイソタイプは、H.に対する保護において重要であるcapsulatumは 、HSP60にIgG1またはIgG2aのモノクローナル抗体を投与したマウスとしてHSP60またはいずれかのアイソタイプ対照mAbまたはPBS（図4）にIgG2bモノクローナル抗体を投与したマウスをコントロールと比較して有意に生存期間の延長を持っている。 </li><li>さらに、保護mAbを投与したマウスでは、7日目で肺と脾臓のCFUの数の大幅な削減があったと14日目（図5）で肺に酵母の数字の2と2.5対数単位の減少。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：H.の成長capsulatumとハイブリドーマ。 H.から得られた単一コロニーから（A）液体HAM F - 12培養の準備capsulatumは BHI血液寒天プレート上で増殖。 （B）蛋白質による細胞培養フラスコとモノクローナル抗体の精製のハイブリドーマの成長親和性のcromatographyを使用して、/ Gの樹脂。 <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：H.鼻腔内感染のcapsulatumの接種材料の準備。 H.後に得られた細胞懸濁液注射器や遠心分離によりcapsulatum凝集体の破壊を、血球計でカウントすることによって列挙されます。細胞濃度は&lt;50μLの1.25 × 10 7（生存実験）または5 × 10 6（外装フィルム、サイトカインや組織）に調整されます。 upload/2532/2532fig3.jpg&quot;ALT =&quot;図3&quot;/&gt; 図3：モノクローナル抗体投与時のマウスの扱い。 （A）マウスは、尾部によって取得され、（BとC）theearsに近いとして、その首の首筋を保持することによって固定化されている。 （D）テールは、小指と手のひらの間に開催されます。 （E）抗体のソリューションは、26G1 / 2針を用いて注入されます。 （F）H. capsulatum接種を穏やかにナーレに細胞懸濁液をピペッティングにより鼻腔内に投与される。 <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig4.jpg" alt="図4" /> 図4：HSP60へのモノクローナル抗体はヒストプラズマ症の病因を変更することができます。 IgG1の500μgの、またはIgG2aモノクローナル抗体2時間前に感染症大幅に生存期間の延長に（P &lt;0.05、対照と比較して）、しかしIgG2bモノクローナル抗体でIP注射。 <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig5.jpg" alt="図5" /> 図5：7〜14日目の肺のCFUの決定HSP60または無関係な抗体に選択されたモノクローナル抗体でIPを投与したマウスの5 × 10 6 Hcが酵母による致死鼻腔内チャレンジ後には、IgG1およびIgG2aのための真菌負担の減少は、処理された動物のモノクローナル抗体を示した。黒いバーは、7日目と白のバーでの外装フィルムの上から14日後に感染（* 7日間でp &lt;0.001及び** P &lt;0.001の14日後の感染で）を表す。

<ol>
	<li>Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+based+ELISAs+for+cryptococcal+polysaccharide.">Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide.</a> J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).</li><li>Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+heat+shock+protein+60+alter+the+pathogenesis+of+Histoplasma+capsulatum.+Infect+Immun+77.">Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77.</a> , 1357-1367 (2009).</li><li>Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+function+and+molecular+mapping+of+M+antigen+in+yeast+phase+of+Histoplasma+capsulatum.">Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum.</a> PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).</li><li>Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+antibodies+and+endemic+dimorphic+fungi.">Protective antibodies and endemic dimorphic fungi.</a> Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).</li><li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. e. e. p. e., &amp;amp, G. S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum.">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li><li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S., , ., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum.">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li><li>Smith, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+laboratory+animals+to+some+injectable+anaesthetics.">Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics.</a> Lab Anim. 27, 30-39 (1993).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで紹介するプロトコールは、モノクローナル抗体がH.するということを示していますcapsulatumは、実験マウスヒストプラズマ症のコースを変更することができます。病原体の細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体は、宿主と病原体の相互作用中に発生する複雑なダイナミクスを変更することができます。本研究では、腹腔内注射したときmAbが致死ヒストプラズマ症のマウ?...

<table border="1"><tbody><tr><th>マテリアルの名前</th><th>会社</th></tr><tr><td>生物学的安全キャビネット（BSL2） </td><td></td></tr><tr><td> 15 mLコニカルチューブ</td><td>ファルコン、BD </td></tr><tr><td> HAM F - 12培地</td><td>ギブコ</td></tr><tr><td> 37℃シェーカー</td><td></td></tr><tr><td>渦</td><td></td></tr><tr><td> 50 mLコニカルチューブ</td><td>ファルコン、BD </td></tr><tr><td> 26G1 / 2針</td><td> BD </td></tr><tr><td> 10 mLの注射器</td><td> BD </td></tr><tr><td> 250mLのフラスコ</td><td></td></tr><tr><td> FPLC（ 高速タンパク質液体クロマトグラフィー ）システム</td><td> GE Helthcare </td></tr><tr><td> ELISAリーダー</td><td> BioTekの</td></tr><tr><td>麻酔（ケタミンおよびキシラジン） </td><td></td></tr><tr><td>カラムスタンド</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンストリング</td><td></td></tr><tr><td>熱ランプ</td><td></td></tr><tr><td> 70μmセルストレーナー</td><td>ファルコン、BD </td></tr><tr><td> BHI寒天プレート</td><td>ギブコ</td></tr></tbody></table>

passive administration of monoclonal antibodies against h. capsulatum and others fungal pathogens

この方法論の利用目的は、抗体または真菌ヒストプラスマカプスラーツム 、2）治療の標的として、病原性因子の役割を検討することによって引き起こされるヒストプラズマ症を予防または治療用ワクチンを持つ個人を保護するために私たちの能力を前進させる）1です。モノクローナル抗体を生成するには、マウスを免疫し、免疫応答は、私たちの研究室で開発された固相ELISAシステムを用いて評価され、最高の応答者のマウスハイブリドーマ細胞との融合の脾細胞の単離のために選択されています。 C57BL / 6マウスは広範囲にH.を研究するために使用されているcapsulatum病因と必要なデータを取得するための最良のモデルを提供しています。感染症におけるモノクローナル抗体の役割を評価するためには、マウス腹腔内には、H.するモノクローナル抗体のいずれかで投与されていますcapsulatumまたはアイソタイプは、静脈内（IV）、腹腔内（ip）、または鼻腔内（の）路線で対照mAbを一致して感染する。科学文献では、マウスの真菌感染症に対するモノクローナル抗体の有効性は、以前の時点でコロニーのforminユニット（CFU）の評価と組み合わせて、エンドポイントとして死亡率に依存しています。彼らは最高の人間の病気を表すように生存（死亡までの時間）の研究が必要である。したがって、我々の介入の有効性は十分に生存曲線なしで確立されませんでした。これは、ワクチンや病原性変異体のテストの有効性を確立する場合も同様です。ヒストプラスマ症で、マウスは、しばしば数時間以上の死者への精力的であることから行く。そのような抗体の投与等の介入の容量は最初に病気から動物を保護することがありますが、病気が短いCFUの実験で再発を実現できないということができる。生存と真菌負担アッセイに加えて、我々は感染症（組織、細胞の採用、サイトカイン応答）に炎症反応を調べる。生存/死の実験に時間のために、マウスは罹患率の兆候を少なくとも1日2回感染して監視されます。真菌の負担、組織病理学、およびサイトカイン応答を評価するために、マウスは感染後の様々な時点で安楽死されています。動物実験は医学のアルバートアインシュタイン大学の動物学研究所のガイドラインにしたがって実行されます。

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Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

C57BL / 6マウスがHcの病因を研究し、最適なモデルを提供するために使用されています。我々は、この菌に対する体液性免疫の潜在的な利点を模索し、[ヒストンH2Bと熱ショック蛋白質の60kDaへ]いくつかのモノクローナル抗体を生成している我々は腹腔内投与後、その予防効果を試験すること。

に対するモノクローナル抗体の受動的な管理 H. capsulatumとその他の真菌病原体

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

passive-administration-monoclonal-antibodies-against-h-capsulatum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

11.8K ビュー.  Albert Einstein College of Medicine. C57BL / 6マウスがHcの病因を研究し、最適なモデルを提供するために使用されています。我々は、この菌に対する体液性免疫の潜在的な利点を模索し、[ヒストンH2Bと熱ショック蛋白質の60kDaへ]いくつかのモノクローナル抗体を生成している我々は腹腔内投与後、その予防効果を試験すること。

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Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

細胞内細菌性病原体を持つゼブラフィッシュ胚の感染

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

免疫・感染学

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

日和見菌病原体への蛍光タグ付き遺伝子のバイオリスティック変容<em&gt;クリプトコックス·ネオフォルマンス</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

不死化ソートB細胞からの組換えヒトIgGモノクローナル抗体の作製

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

ハイブリドーマ技術によってマウスモノクローナル抗体の作製

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

エスケープ中和抗体でインフルエンザ ウイルスの亜種の世代

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

天然物に対するモノクローナル抗体の作製

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

病原性細菌に対する免疫学的応答を評価するための Opsonophagocytic 殺害アッセイ

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is requisite to phagocytosis and killing, the assay is an alternative method to&#160;opsono-phagocytic killing assays. An advantage of the opsono-adherence&#160;assay is the option of using inactivated pathogens and mammalian cell lines, which allows standardization across multiple experiments. The use of an inactivated pathogen in the assay also facilitates work with biosafety level 3 infectious agents and other virulent pathogens. In our work, the opsono-adherence assay was used to assess the functional ability of antibodies, from sera of animals immunized with an anthrax capsule-based vaccine, to induce adherence of fixed Bacillus anthracis to a mouse macrophage cell line, RAW 264.7. Automated fluorescence microscopy was used to capture images of bacilli adhering to macrophages. Increased adherence was correlated with the presence of anti-capsule antibodies in the serum. Non-human primates that exhibited high serum anti-capsule antibody concentrations were protected from anthrax challenge. Thus, the opsono-adherence assay can be used to elucidate the biological functions of antigen specific antibodies in sera, to evaluate the efficacy of vaccine candidates and other therapeutics, and to serve as a possible correlate of immunity.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is an alternative method to the opsono-phagocytic killing assay to evaluate the opsonic functions of antibodies in vaccine development.

細菌性アン トラシス および他のカプセル化病原体に対するワクチン開発における機能性抗体を評価するオソノ付着アッセイ

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...