Wir bedanken uns herzlich die Mitglieder des Pal-Labor für die Unterstützung bei der Vorbereitung dieser Demonstration. Diese Studie wurde von PHS gewährt AI076684 und AI080615 von NIH / NIAID unterstützt.

1. Mikroinjektion von Nymphen Ixodes scapularis Ticks 1. Vorbereitung Nadeln <ol><li> Fertigen Sie mehrere Mikroinjektion Nadeln durch Erhitzen und Ziehen 1 mm Glaskapillaren (World Precision Instruments) in einem Glasmikropipette Abziehvorrichtung (Narishige). Entfernen Sie vorsichtig das fragile Kapillaren. </li><li> Shop gezogen Nadeln (mit der Spitze nach oben) auf Klebeband in einer Petrischale. </li></ol> 2. Vorbereitung B. burgdorferi <ol><li> Wachsen B. burgdorferi in BSK Kulturmedien 7 bis zu einer Konzentration von etwa 10 7 Zellen pro mL. Spirochäten sind unter einem Dunkelfeld-Mikroskop mit Hilfe einer Petroff-Hausser Zählkammer (Hausser wissenschaftlichen) gezählt. </li><li> Pellet B. burgdorferi durch Zentrifugation bei 3.000 xg für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Überstand entfernen und vollständig das Pellet in BSK Medien durch sanft durch eine 200 ul sterilem Mikrospitze bis zu einer Endkonzentration von 10 9 Zellen pro mL. Da die Zellen bei hoher Zelldichte resuspendiert und konnte verklumpen, der Zellsuspension sollte für die Mikroinjektion sofort verwendet werden. </li></ol> 3. Vorbereitung Zecken <ol><li> Legen Sie klare, doppelseitigen Klebeband auf einem Glasträger. </li><li> Working on a sticky mat, entfernen Sie vorsichtig Nymphen aus dem Behälter mit einer kleinen Bürste. </li><li> Legen Sie die erforderliche Anzahl von Zecken auf dem Klebeband, Bauchseite injiziert verfasst werden, in die gleiche Richtung. </li></ol> 4. Injizieren Zecken <ol><li> Legen Sie 5 ul der B. burgdorferi Kultur in die gezogen Kapillarnadel mit einem 20 ul Microloader Pipettenspitze (Eppendorf). Überprüfen Sie die Nadel für die eingeschlossene Luftblasen und laden Sie die Nadel mit Bakterienkultur, falls erforderlich. </li><li> Sehen Sie sich die Zecke unter dem Sezieren Binokular und konzentrieren sich auf die Zecke Afteröffnung Bereich. Sanft berühren die Spitze der Kapillare Nadel, um die Röhre, wo der Durchmesser ist etwas kleiner als die von der Zecke Afteröffnung bilden die Mikroinjektionsnadel brechen. Dieser Schritt ist wichtig, da jeder Versuch, Zecken mit einem nicht geeigneten Nadelspitze injizieren Ursachen Verletzung und möglichen Tod des injizierten ticken. </li><li> Legen Sie die immobilisierten Ticks unter dem Sezieren Binokular und konzentrieren sich auf die Afteröffnung, die durch zwei bewegliche Analplatten bedeckt ist. Mit feinen Pinzette vorsichtig anfassen und gelten sehr milden Druck auf jedem Gebiet in der Nähe Afteröffnung. Dies ermöglicht Trennung der Analplatten und Eröffnung der anal Pore, die den Darm verbindet. Schieben Sie die Spitze der Nadel leicht in die Afteröffnung durch die erzwungene Öffnung der Analplatten. Einführen der Nadel sollte auf ein Minimum reduziert werden, da das Glas Spitze der semitransparenten Enddarm, dass bis zum Rektum verbindet beschädigen könnten. Mit einem Mikroinjektor mit automatisierten Fußschalter (Eppendorf) ausgestattet, injizieren B. burgdorferi-Lösung mit folgenden Parametern: 1.000 Hektopascal (hPa) Einspritzdruck, 0,2 Sekunden Einspritzzeit und 8 hPa Kompensationsdruck. Jeder Tick erhält eine einmalige Injektion. </li><li> Nach Mikroinjektion, sollten die Zecken verhalten sich ähnlich wie die Voreinspritzung Zustand. Zum Beispiel sollte die Zecke in Reaktion auf Reize zu kriechen. </li><li> Wir erlauben in der Regel die Zecken zu 48 Stunden lang in einer Klimakammer bei 24 ° C eingestellt erholen mit 16 Stunden / 8 Stunden Licht / Dunkel Photoperiode Therapie und 95% Luftfeuchtigkeit. Wenn eine Kammer nicht verfügbar ist, könnte injiziert Zecken bei Raumtemperatur in feuchten Bedingungen innerhalb einer luftdichten Behälter, wie zum Beispiel eine regelmäßige Exsikkator Kammer gelagert werden. Falls erforderlich, könnten Erholungszeit der Zecken auch um ein paar Stunden verkürzt werden, bevor für die Fütterung an Mäuse verwendet. </li></ol> 2. B. burgdorferi Lokalisierung von Konfokale Immunfluoreszenz-Mikroskopie 1. Dissecting Zecken <ol><li> Legen Sie einen Tropfen Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf einen sauberen Glasobjektträger für die Präparation und eine weitere auf einer Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger (Sigma) für die Mikroskopie. Bereiten Sie eine andere Glasträger mit doppelseitigem Klebeband. </li><li> Entfernen Sie das Häkchen aus dem Behälter nehmen und auf doppelseitigen Klebeband mit einer kleinen Bürste. </li><li> Anzeigen und sich die Zecke in der Dissektionsmikroskop. Platzieren einer scharfen Rasierklinge auf die Zecke zwischen dem ersten und zweiten Beinpaare. Drücken Sie fest Schneiden Sie das Häkchen in zwei Stücke für den Zugang zu den Unterleib. Sofort tauchen den Bauch in einem Tropfen PBS. </li><li> Mit sehr feinen Pinzette greifen die dorsalen und ventralen Exoskelett rund um den Ort des Schnittes. Ziehen Sie die dorsalen Schild oben und weg von der Zecke Freilegung der bräunlich gefärbten Darm Divertikel. Achten Sie darauf, das Sezieren Ticks unter dem PBS zu jeder Zeit zu halten. </li><li> Die semi-transluzente Speicheldrüse bundles sind auf beiden Seiten des vorderen Bereich des Darms entfernt und kann an dieser Stelle entfernt werden, falls gewünscht. Halten Sie die verbleibenden Exoskelett statt mit einer Pinzette, ziehen Sie vorsichtig den Darm aus dem Bauch. </li><li> Reinigen Sie den Darm durch das Entfernen eventuell eingeschlossene Gewebe (zum Beispiel, Luftröhre). </li><li> Mit der Spitze der feinen Pinzette, schnelle Übertragung der Zecke gut in einem Tropfen PBS auf einem Poly-L-Lysin Objektträger aus Glas. Trennen Sie die gut in kleinere Stücke mit feinen Klingen oder leichtes Drücken mit der Spitze des feinen Pinzette. Vorsichtig absaugen überschüssigen PBS um den Bauch herum Gewebe. </li><li> Lassen Sie das gut Gewebe an der Luft bei Raumtemperatur trocknen. </li><li> Fix die Zecke gut durch Eintauchen in Aceton für 10 Minuten. An der Luft bei Raumtemperatur trocknen. Slides können Sie diesen Schritt für Monate bei -20 ° C gelagert in einem luftdichten Behälter. </li></ol> 2. Die Färbung <ol><li> Mit Seidenpapier, entfernen Sie die überschüssige Feuchtigkeit in das Gewebe und ziehen Sie einen Kreis um die getrockneten Tick gut durch einen Pap-pen oder hydrophoben Barriere Futter Gerät. Dies wird helfen, die Färbelösungen bei der anschließenden Inkubationsschritte behalten. </li><li> Decken Sie die Zecke gut mit einem oder ein paar Tropfen Blockierungspuffer (0,05% Tween-20, 5% Ziegenserum in PBS) für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Das Serum für die Sperrung hängt von der Quelle der Wirtstier für den Antikörper. Lassen Sie die Folie, um von diesem Punkt an zu trocknen. </li><li> Langsam absaugen Blockierungspuffer. Inkubieren Sie die gut mit den entsprechenden Primär-und / oder sekundären Antikörper-Lösungen. Wir verwenden (FITC) - markierten Anti-B burgdorferi-Antikörper (Kirkegaard &amp; Perry Laboratories) bei einer Verdünnung 1:100 in Blocking-Puffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Bedecken Sie den Container mit Alu-Folie, um Lichteinwirkung zu begrenzen. </li><li> Entfernen der Antikörper-Lösung durch leichtes Ansaugen. Inkubieren Sie die gut mit einem fluoreszierenden Farbstoff zu markieren Tick Geweben, wie z. B. 4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindole (DAPI) oder Propidiumiodid. Wir benutzen normalerweise 20 pg / mL Propidiumiodid (Sigma) in PBS für 5 min. bei Raumtemperatur. </li><li> 3 x waschen mit 0,05% Tween-20 in PBS. </li><li> Montieren Sie die Folie in Glyzerin, die einen Antifade Reagens wie Slowfade (Invitrogen) und vorsichtig mit einem Deckglas abdecken. Dias können in diesem Schritt für ein paar Monate bei 4 ° C in einem luftdichten Behälter aufbewahrt werden. Bild und lokalisieren B. burgdorferi unter einem konfokalen Mikroskop. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Position eines nymphal Tick für die Mikroinjektion und ein Bild darstellt B. burgdorferi-Lokalisierung in der Zecke Darm ist in Abbildung 1 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2544/2544fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Mikroinjektion und Lokalisierung von B. burgdorferi in der Zecke gut. (A) Ventrale Ansicht eines nymphal I. scapularis Tick für die Mikroinjektion positioniert. Anal Öffnung (Pfeilspitze) mit eingelegtem Mikroinjektionsnadel (Pfeil) ist unter Vergrößerung im Einschub gezeigt. Eine feine ForceP wird verwendet, um sanften Druck auf den Körper, die Trennung der Analplatten und Eröffnung des analen Pore für die Mikroinjektion erlaubt gelten. Die Nadel wird mit einer Lösung von Coomassie brilliant blue zur Verbesserung der Sichtbarkeit gefüllt. (B) Repräsentative Ergebnisse der konfokalen Immunfluoreszenz Abbildung von B. burgdorferi in Zecken gut. Frontzahnbereich einer gut Divertikel wird angezeigt. Gut Kerne und Spirochäten (Pfeil) mit Propidiumiodid (rot) oder FITC-konjugierten Anti-B gekennzeichnet burgdorferi (grün), jeweils. Bar = 20 um.

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	<li>Steere, A. C., Coburn, J., Glickstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+Lyme+disease.">The emergence of Lyme disease.</a> J Clin Invest. 113, 1093-1101 (2004).</li><li>Barthold, S. W., Diego, C., Philipp, M. T., Samuels, D. S., Radolf, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Borrelia, Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis. , 353-405 (2010).</li><li>Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OspC+facilitates+Borrelia+burgdorferi+invasion+of+Ixodes+scapularis+salivary+glands.">OspC facilitates Borrelia burgdorferi invasion of Ixodes scapularis salivary glands.</a> J Clin Invest. 113, 220-230 (2004).</li><li>Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+OspA/B+in+the+life+cycle+of+the+Lyme+disease+spirochete.">Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete.</a> J Exp Med. 199, 641-648 (2004).</li><li>Zhang, X., Yang, X., Kumar, M., Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BB0323+function+is+essential+for+Borrelia+burgdorferi+virulence+and+persistence+through+tick-rodent+transmission+cycle.">BB0323 function is essential for Borrelia burgdorferi virulence and persistence through tick-rodent transmission cycle.</a> J Infect Dis. 200, 1318-1330 (2009).</li><li>Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TROSPA,+an+Ixodes+scapularis+receptor+for+Borrelia+burgdorferi.">TROSPA, an Ixodes scapularis receptor for Borrelia burgdorferi.</a> Cell. 119, 457-468 (2004).</li><li>Barbour, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+Lyme+disease+spirochetes.">Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes.</a> Yale J Biol Med. 57, 521-525 (1984).</li><li>Narasimhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Ixodes+scapularis+anticoagulation+by+using+RNA+interference.">Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 1141-1146 (2004).</li><li>Narasimhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tick+antioxidant+facilitates+the+Lyme+disease+agent's+successful+migration+from+the+mammalian+host+to+the+arthropod+vector.">A tick antioxidant facilitates the Lyme disease agent's successful migration from the mammalian host to the arthropod vector.</a> Cell Host Microbe. 2, 7-18 (2007).</li><li>Broadwater, A. H., Sonenshine, D. E., Hynes, W. L., Ceraul, S., DeSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glass+capillary+tube+feeding:+a+method+for+infecting+nymphal+Ixodes+scapularis+(Acari:+Ixodidae)+with+the+Lyme+disease+spirochete+Borrelia+burgdorferi.">Glass capillary tube feeding: a method for infecting nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) with the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi.</a> J Med Entomol. 39, 285-292 (2002).</li><li>Policastro, P. F., Schwan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+infection+of+Ixodes+scapularis+larvae+(Acari:+Ixodidae)+by+immersion+in+low+passage+cultures+of+Borrelia+burgdorferi.">Experimental infection of Ixodes scapularis larvae (Acari: Ixodidae) by immersion in low passage cultures of Borrelia burgdorferi.</a> J Med Entomol. 40, 364-370 (2003).</li><li>Fuente, d. e. l. a., Kocan, J., M, K., Almazan, C., Blouin, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+for+the+study+and+genetic+manipulation+of+ticks.">RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks.</a> Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).</li></ol>

Hier zeigen wir eine Mikroinjektion-basiertes Verfahren zur schnellen und effizienten Infektion nymphal Ixodes-Zecken mit dem bakteriellen Erreger B. burgdorferi. Wir beschreiben auch eine konfokale Immunfluoreszenz Verfahren für den Nachweis von B. burgdorferi in der Zecke gut in situ. Obwohl unsere Demonstration beinhaltet nymphal gut, sind ähnliche Verfahren auch für andere Entwicklungsstadien der Zecken, wie Larven oder Erwachsene 8,9. Aufgrund ihrer geringen Größe kann die...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glass capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vertical glass puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>PC-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petroff-Hausser counting chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hausser scientific</td>
<td>3900</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader pipette tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>930001007</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Femtojet microinjector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>920010504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foot control FemtJet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>920005098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP665-1</td>
<td>Filter-sterilized</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

methods for rapid transfer and localization of lyme disease pathogens within the tick gut

Lyme-Borreliose wird durch eine Infektion mit dem Erreger Borrelia burgdorferi Spirochäten, die in der Natur von einer Zecke-Nagetier Infektionszyklus 1 beibehalten verursacht. Eine durch Zecken übertragene murine Modell 2 wurde entwickelt, um Lyme-Borreliose im Labor zu untersuchen. Während naive Zecken mit B. infiziert sein burgdorferi, indem man sie auf infizierten Mäusen, so erfolgt die Häutung Prozess mehrere Wochen bis Monate in Anspruch nehmen. Daher ist die Entwicklung von schnelleren und effizienteren Zecken Infektion Techniken, wie eine Mikroinjektion-basiertes Verfahren, ein wichtiges Instrument für die Erforschung der Lyme-Borreliose 3,4. Das Verfahren erfordert nur wenige Stunden, um infizierte Zecken zu generieren und ermöglicht die Kontrolle über die Lieferung von gleichen Mengen von Spirochäten in einer Kohorte von Zecken. Dies ist besonders wichtig, da die Erzeugung von B. burgdorferi infizierten Zecken durch die natürliche Fütterung Prozess mit Mäusen nicht zu 100% Infektionsrate und potenziell Ergebnisse in Variation der Erreger Belastung unter zugeführt Zecken zu gewährleisten. Darüber hinaus kann die Mikroinjektion verwendet werden, um Zecken mit B. zu infizieren burgdorferi-Isolate in Fällen, in denen eine abgeschwächte Stamm ist nicht auf eine Infektion in Mäusen zu etablieren und damit kann natürlich nicht durch Zecken 5 Erwerb werden. Diese Technik kann auch verwendet werden, um eine Vielzahl von anderen biologischen Materialien in Zecken zu liefern, z. B. spezifische Antikörper oder Doppel-RNA 6 gestrandet. In diesem Artikel werden wir die Mikroinjektion von Nymphen mit in vitro-grown B. zeigen, burgdorferi. Wir werden auch eine Methode zur Lokalisierung von Lyme-Borreliose Erreger in der Zecke gut mit Hilfe der konfokalen Immunfluoreszenz-Mikroskopie.

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Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme-Borreliose Studien erfordern oft Generation von Zecken mit dem Erreger Borrelia burgdorferi, ein Prozess, der dauert in der Regel mehrere Wochen infiziert. Hier zeigen wir eine Mikroinjektion-basierte Zecken Infektion Verfahren, das innerhalb weniger Stunden erreicht werden kann. Wir zeigen auch einer Immunfluoreszenz-Methode zur in situ-Lokalisation von B. burgdorferi in Zecken.

Methoden zur raschen Transfer und die Lokalisierung von Lyme-Borreliose Erreger innerhalb der Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

methods-for-rapid-transfer-localization-lyme-disease-pathogens-within

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.5K Aufrufe.  University of Maryland. Lyme-Borreliose Studien erfordern oft Generation von Zecken mit dem Erreger Borrelia burgdorferi, ein Prozess, der dauert in der Regel mehrere Wochen infiziert. Hier zeigen wir eine Mikroinjektion-basierte Zecken Infektion Verfahren, das innerhalb weniger Stunden erreicht werden kann. Wir zeigen auch einer Immunfluoreszenz-Methode zur in situ-Lokalisation von B. burgdorferi in Zecken.

Serie: Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

Speichel, Speicheldrüse, und Hämolymphe Abholung Ixodes scapularis Zecken

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em&gt; In-vitro-</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on mammalian hosts. In nature, this zoonotic bacterial pathogen may use a variety of reservoir hosts, but the white-footed mouse (Peromyscus leucopus) is the primary reservoir for larval and nymphal ticks in North America. Humans are incidental hosts most frequently infected with B. burgdorferi by the bite of ticks in the nymphal stage. B. burgdorferi adapts to its hosts throughout the enzootic cycle, so the ability to explore the functions of these spirochetes and their effects on mammalian hosts requires the use of tick feeding. In addition, the technique of xenodiagnosis (using the natural vector for detection and recovery of an infectious agent) has been useful in studies of cryptic infection. In order to obtain nymphal ticks that harbor B. burgdorferi, ticks are fed live spirochetes in culture through capillary tubes. Two animal models, mice and nonhuman primates, are most commonly used for Lyme disease studies involving tick feeding. We demonstrate the methods by which these ticks can be fed upon, and recovered from animals for either infection or xenodiagnosis.

Lyme disease is the most commonly-reported vector-borne disease in North America. The causative agent, Borrelia burgdorferi is a spirochete bacterium transmitted by Ixodid ticks. Transmission and detection of infection in animal models is optimized by the use of tick feeding, which we describe here.

Fütterung von Zecken auf Tiere, die zur Übertragung und Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

Rettung von rekombinanten Newcastle Disease Virus aus cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to antibiotics. Genomic studies reveal that S. aureus carries many virulence and resistance genes located in mobile genetic elements, suggesting that horizontal gene transfer (HGT) plays a critical role in S. aureus evolution. However, a full and detailed description of the methodology used to study HGT in S. aureus is still lacking, especially regarding natural transformation, which has been recently reported in this bacterium. This work describes three protocols that are useful for the in vitro investigation of HGT in S. aureus: conjugation, phage transduction, and natural transformation. To this aim, the cfr gene (chloramphenicol/florfenicol resistance), which confers the Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A (PhLOPSA)-resistance phenotype, was used. Understanding the mechanisms through which S. aureus transfers genetic materials to other strains is essential to comprehending the rapid acquisition of resistance and helps to clarify the modes of dissemination reported in surveillance programs or to further predict the spreading mode in the future.

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

We describe here three different protocols for the in vitro investigation of conjugation, transduction, and natural transformation in Staphylococcus aureus.

Methodik für die Studie des horizontalen Gentransfers in<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. While the direct fluorescent antibody (DFA) test or the direct rapid immunohistochemical test (DRIT) are most commonly utilized for the antigen detection, both tests require fresh and/or frozen tissues for impressions on slides prior to the antigen detection using antibodies. If samples are collected and fixed in formalin, neither test is optimal for the antigen detection, however, testing can be performed by conventional immunohistochemistry (IHC) after embedding in paraffin blocks and sectioning. With this IHC method, tissues are stained with anti-rabies antibodies, sections are deparaffinized, antigen retrieved by partial proteolysis or other methods, and incubated with primary and secondary antibodies. Antigens are stained using horseradish peroxidase / amino ethyl carbazole and counterstained with hematoxylin for the visualization using a light microscope. In addition to the specific antigen detection, formalin fixation offers other advantages like the determination of histological changes, relaxed conditions for specimen storage and transport (under ambient temperatures), ability to test retrospective cases and improved biological safety through the inactivation of infectious agents.

Here, we present an immunohistochemistry test protocol for the detection of rabies virus antigen as an alternative diagnostic test for formalin-fixed tissues.

Immunhistochemischer Test für den Lyssavirus-Antigennachweis aus formalinfixierten Geweben

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.

Visualisierung von Pseudomonas aeruginosa im Sputum von Mukoviszidose-Patienten

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This process has notably lower efficiencies in the Lyme disease spirochete relative to other, better-characterized Gram-negative bacteria. The rate of success of transformation is highly dependent upon having concentrated amounts of high-quality DNA from specific backgrounds and is subject to significant strain-to-strain variability. Alternative means for introducing foreign DNA (i.e., shuttle vectors, fluorescent reporters, and antibiotic-resistance markers) into B. burgdorferi could be an important addition to the armamentarium of useful tools for the genetic manipulation of the Lyme disease spirochete. Bacteriophage have been well-recognized as natural mechanisms for the movement of DNA among bacteria in a process called transduction. In this study, a method has been developed for using the ubiquitous borrelial phage &#966;BB-1 to transduce DNA between B. burgdorferi cells of both the same and different genetic backgrounds. The transduced DNA includes both borrelial DNA and heterologous DNA in the form of small shuttle vectors. This demonstration suggests a potential use of phage-mediated transduction as a complement to electroporation for the genetic manipulation of the Lyme disease spirochete. This report describes methods for the induction and purification of phage &#966;BB-1 from B. burgdorferi, the use of this phage in transduction assays, and the selection and screening of potential transductants.

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

The ability of bacteriophage to move DNA between bacterial cells makes them effective tools for the genetic manipulation of their bacterial hosts. Presented here is a methodology for inducing, recovering, and using &#966;BB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi, to transduce heterologous DNA between different strains of the Lyme disease spirochete.

Phagenvermittelte genetische Manipulation der Borreliose Spirochete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

Quantifizierung von impfstoffinduzierten neutralisierenden Antikörpern in SARS-CoV-2-Varianten

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 variants and the effectiveness of vaccine-induced neutralizing antibodies against viral variants. These assays are essential for pandemic surveillance and validating vaccines and variant-specific boosters. This manuscript demonstrates the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) for quick quantification of SARS-CoV-2 variant infectivity and vaccine-induced neutralizing antibodies to viral variants. Ha-CoV-2 is a SARS-CoV-2 virus-like particle consisting of viral structural proteins (S, M, N, and E) and a fast-expressing RNA genome derived from an alphavirus, Semliki Forest Virus (SFV). Ha-CoV-2 also contains both green fluorescent protein (GFP) and luciferase reporter genes that allow for quick quantification of viral infectivity. As an example, the infectivity of the SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) and the Omicron (B.1.1.529) variants are quantified, and their sensitivities to a neutralizing antibody (27VB) are also measured. These examples demonstrate the great potential of Ha-CoV-2 as a robust platform for rapid quantification of SARS-CoV-2 variants and their susceptibility to neutralizing antibodies.

Autor im Rampenlicht: Ein Pseudotyp-Virussystem zur Bewertung von Omikron-Subvarianten und zur Neutralisierung von Antikörpern in der SARS-CoV-2-Forschung

This protocol describes the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) as a platform for rapid quantification of infectivity of SARS-CoV-2 variants and their sensitivity to neutralizing antibodies.

Anwendung des Ha-CoV-2-Pseudovirus zur schnellen Quantifizierung von SARS-CoV-2-Varianten und neutralisierenden Antikörpern

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...