Biz içtenlikle Pal laboratuvar üyeleri bu gösteri hazırlığı ile ilgili yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma NIH / NIAID PHS hibe AI076684 ve AI080615 tarafından desteklenmiştir.

1. Nymphal Ixodes scapularis Keneler, Mikroenjeksiyon 1. Hazırlanması iğneler <ol><li> Isıtma ve bir cam mikropipet çektirmesi cihazı (Narishige) 1 mm cam kapiller tüplerin (Dünya Hassas Aletler) çekerek birkaç mikroenjeksiyon iğneler üretmektedirler. Kırılgan kılcal tüpler dikkatlice çıkarın. </li><li> Mağaza bir Petri kabındaki, iğne ucu yukarı bakacak şekilde yapışkan bant çekti. </li></ol> 2. B. hazırlanması burgdorferi <ol><li> B. büyütün BSK kültür ortamı 7 ml başına yaklaşık 7 10 hücrelerinin bir konsantrasyon kadar burgdorferi. Spiroketler Petroff-Hausser sayma kamara (Hausser bilimsel) bir karanlık alan mikroskobu altında sayılır. </li><li> Pelet B. oda sıcaklığında 10 dakika için 3000 xg&#39;de santrifüj burgdorferi. </li><li> Süpernatantı ve tamamen BSK medya pelet hafifçe ml başına 10 9 hücrelerinin nihai konsantrasyonu 200 mcL steril mikrotip geçerek tekrar süspansiyon haline getirin. Yüksek hücre yoğunluğu hücrelerinin yeniden süspanse hücre süspansiyonu, mikroenjeksiyon için hemen bir araya gelme olmalıdır olabilir göre. </li></ol> 3. Hazırlanması keneler <ol><li> Bir bardak slayt açık, çift taraflı yapışkan bant yerleştirin. </li><li> Yapışkan bir minder üzerinde çalışarak, küçük bir fırça kullanarak kapsayıcı nymphal keneler dikkatlice çıkarın. </li><li> Aynı yöne bakacak şekilde, yapışkan bant, ventral tarafta enjekte edilmek üzere gerekli sayıda kene yerleştirin. </li></ol> 4. Enjekte keneler <ol><li> Yük B. 5 mcL 20 mcL Microloader pipet (Eppendorf) kullanılarak çekilmiş kılcal iğne içine burgdorferi kültür. Hava kabarcığı için iğne kontrol edin ve gerekirse iğne, bakteri kültürü ile yeniden. </li><li> Diseksiyon mikroskop altında kene ve kene anal açıklık alanı odaklanmak. Kılcal bir iğne ucu çapı mikroenjeksiyon iğne oluşturarak, kene anal diyafram biraz daha küçük tüp kırmak için hafifçe dokunun. Bu adım, uygun olmayan bir iğne ucu ile kene enjekte etmek için herhangi bir girişimde enjekte kene olası yaralanma ve ölüm nedenleri olarak kritik öneme sahiptir. </li><li> Diseksiyon binoküler mikroskop altında immobilize keneler yerleştirin ve iki hareketli anal plakalar ile kaplıdır anal diyafram, odaklanmak. Ince forseps kullanarak, hafifçe dokunmak ve anal diyafram yakınında herhangi bir yerde çok hafif basınç uygulayın. Bu anal plakalar ve gut bağlanan anal gözenek açılması ayrılması sağlayacaktır. Zorla anal plakalar açıklıktan anal boşluğuna iğne ucu biraz dikkatlice yerleştirin. İğne ekleme cam ucu rektum bağlayan yarı saydam hindgut zarar verebilir minimum düzeyde tutulmalıdır. Otomatik ayak kontrolü (Eppendorf) ile donatılmış bir mikroenjektör kullanarak, B. enjekte 1,000 hectopascals (hPa) enjeksiyon basıncı, 0.2 saniye enjeksiyon süresi ve 8 inç tazminat basıncı: aşağıdaki parametreleri kullanarak burgdorferi çözüm. Her kene, tek bir enjeksiyon alır. </li><li> Mikroenjeksiyon, keneler enjeksiyon öncesi durumuna benzer davranmalıdır. Örneğin, kene uyaranlara yanıt olarak tarama gerekir. </li><li> Biz genellikle, keneler 24 yaşında bir çevre odasında 48 saat boyunca kurtarmak için izin ° C 16 saat / 8 saat aydınlık / karanlık fotoperiyodun rejimi ve% 95 nem. Bir oda mevcut değilse, enjekte keneler nemli koşullar, düzenli bir desikatöre odası gibi bir hava geçirmez bir kap içinde oda sıcaklığında saklanabilir. Gerekirse önce fareler üzerinde beslemek için kullanılır, keneler iyileşme süresi de bir kaç saat kısaltılmış olabilir. </li></ol> 2. B. Konfokal İmmünofloresan Mikroskopi burgdorferi Yerelleştirme 1. Diseksiyon keneler <ol><li> Damlacık fosfat tamponlu salin (PBS) mikroskopi için bir poli-L-lisin kaplı slayt (Sigma), diseksiyon ve başka bir temiz bir cam slayt . Çift taraflı yapışkan bant ile başka bir cam slayt hazırlayın. </li><li> Kene küçük bir fırça kullanarak, çift taraflı yapışkan bant konteyner ve yerden çıkarın. </li><li> Diseksiyon mikroskobu kene bakın ve odaklanın. Bacak birinci ve ikinci çiftleri arasındaki kene keskin bir jilet yerleştirin. Karın erişim sağlayan iki adet kesme kene sıkıca aşağı doğru bastırın. Hemen batığın PBS bir damlacık karın. </li><li> Çok ince forseps kullanarak, kesme site çevresinde dorsal ve ventral Exoskeleton kapmak. Dorsal kalkan kahverengi renkli bağırsakta divertikül açığa kene dikkatlice yukarı çekin ve uzak. PBS kapsamında diseksiyon keneler her zaman tutmak için dikkatli olun. </li><li> Yarı-saydam bir tükürük bezi topuzdles gut ön bölgenin her iki tarafında bulunmaktadır, ve eğer istenirse, bu noktada kaldırılabilir. Forseps ile yerde kalan dış iskelet Holding, bağırsak karın dikkatlice dışarı çekin. </li><li> (Örneğin, trakea) sıkışan dokuları kaldırarak gut yavaşça temizleyin. </li><li> Ucu ince forseps kullanarak, hızlı bir poli-L-lisin cam slayt PBS bir damlacık kene gut aktarın. Ince bıçakları kullanarak küçük parçalar halinde ayrı ayrı veya bağırsak, ince forseps ucu ile hafifçe basılarak. Dikkatlice bağırsak dokuların etrafında aşırı PBS aspirat. </li><li> Bağırsak dokularında, oda sıcaklığında kurumaya bırakın. </li><li> 10 dakika aseton daldırarak kene gut sabitleyin. Oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Slaytlar ay boyunca hava geçirmez bir kap içinde -20 ° C&#39;de bu aşamada depolanmış olabilir. </li></ol> 2. Boyanma <ol><li> Kağıt mendil kullanarak, doku çevresindeki aşırı neme kaldırın ve bir pap-kalem veya herhangi bir hidrofobik bariyer astar cihazı kuru kene bağırsak etrafında bir daire çizin. Bu sonraki İnkübasyon sırasında boyama çözümler korumak için yardımcı olacaktır. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir ya da birkaç damla engelleme tampon (PBS içinde Tween-20,% 5 keçi serumu% 0.05) ile kene gut örtün. Engellemek için kullanılan serum antikor konak hayvanın kaynağına bağlıdır. Slayt bu noktadan itibaren kurumasına izin vermeyin. </li><li> Yavaş yavaş engelleme tampon aspirat. Bağırsak uygun birincil ve / veya sekonder antikor çözümleri ile inkübe edin. - Floresein izotiyosiyanat (FITC) anti-B etiketli burgdorferi antikor (Kirkegaard &amp; Perry Laboratories), oda sıcaklığında 1 saat süreyle tampon engelleme 1:100 dilüsyon . Konteyner ışığa maruz kalma sınırı için alüminyum folyo ile örtün. </li><li> Nazik aspirasyonu ile antikor çözüm çıkarın. 4 gibi etiket kene dokular, floresan boya &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) veya propidium iyodür gut inkübe edin. Biz normalde 5 dakika süreyle PBS içinde 20 mcg / mL propidium iyodür (Sigma) kullanın. oda sıcaklığında. </li><li> % 0.05 Tween-20 PBS içinde 3 kere yıkayın. </li><li> Mount Slowfade (Invitrogen) gibi bir antifade reaktif içeren tamponlu gliserol slayt ve bir cam lamel dikkatlice ile kaplayın. Slaytlar hava geçirmez bir kap içinde, birkaç ay boyunca, 4 ° C bu adımı saklanabilir. Görüntü ve B. lokalize konfokal mikroskop altında burgdorferi. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar Pozisyon ve mikroenjeksiyon için nymphal kene B. temsil eden bir görüntü kene bağırsaktaki burgdorferi yerelleştirme Şekil 1&#39;de sunulmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/2544/2544fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. B. Mikroenjeksiyon ve lokalizasyonu kene bağırsak içine burgdorferi. Nymphal I. (A) Ventral scapularis kene mikroenjeksiyon için konumlandırılmış. Anal diyafram takılı mikroenjeksiyon iğnesi (ok) (ok ucu) içerlek büyütme altında gösterilir. Ince forsepsle anal plakalar ve mikroenjeksiyon için anal gözenek açılması ayrılması izin verilen gövde, hafif bir basınç uygulamak için kullanılır. (B) görünürlüğünü arttırmak Coomassie parlak mavi bir çözüm iğne ile doldurulur., B. konfokal immünofloresan görüntüleme Temsilcisi sonuçları kene bağırsak içinde burgdorferi. Bağırsak divertikülü ön bölge gösterilmiştir. Gut çekirdekleri ve spiroketlerine propidium iyodür (kırmızı) veya FITC-konjuge anti-B ile etiketlenir (ok) sırasıyla burgdorferi (yeşil renkli). Bar = 20 mikron.

<ol>
	<li>Steere, A. C., Coburn, J., Glickstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+Lyme+disease.">The emergence of Lyme disease.</a> J Clin Invest. 113, 1093-1101 (2004).</li><li>Barthold, S. W., Diego, C., Philipp, M. T., Samuels, D. S., Radolf, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Borrelia, Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis. , 353-405 (2010).</li><li>Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OspC+facilitates+Borrelia+burgdorferi+invasion+of+Ixodes+scapularis+salivary+glands.">OspC facilitates Borrelia burgdorferi invasion of Ixodes scapularis salivary glands.</a> J Clin Invest. 113, 220-230 (2004).</li><li>Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+OspA/B+in+the+life+cycle+of+the+Lyme+disease+spirochete.">Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete.</a> J Exp Med. 199, 641-648 (2004).</li><li>Zhang, X., Yang, X., Kumar, M., Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BB0323+function+is+essential+for+Borrelia+burgdorferi+virulence+and+persistence+through+tick-rodent+transmission+cycle.">BB0323 function is essential for Borrelia burgdorferi virulence and persistence through tick-rodent transmission cycle.</a> J Infect Dis. 200, 1318-1330 (2009).</li><li>Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TROSPA,+an+Ixodes+scapularis+receptor+for+Borrelia+burgdorferi.">TROSPA, an Ixodes scapularis receptor for Borrelia burgdorferi.</a> Cell. 119, 457-468 (2004).</li><li>Barbour, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+Lyme+disease+spirochetes.">Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes.</a> Yale J Biol Med. 57, 521-525 (1984).</li><li>Narasimhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Ixodes+scapularis+anticoagulation+by+using+RNA+interference.">Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 1141-1146 (2004).</li><li>Narasimhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tick+antioxidant+facilitates+the+Lyme+disease+agent's+successful+migration+from+the+mammalian+host+to+the+arthropod+vector.">A tick antioxidant facilitates the Lyme disease agent's successful migration from the mammalian host to the arthropod vector.</a> Cell Host Microbe. 2, 7-18 (2007).</li><li>Broadwater, A. H., Sonenshine, D. E., Hynes, W. L., Ceraul, S., DeSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glass+capillary+tube+feeding:+a+method+for+infecting+nymphal+Ixodes+scapularis+(Acari:+Ixodidae)+with+the+Lyme+disease+spirochete+Borrelia+burgdorferi.">Glass capillary tube feeding: a method for infecting nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) with the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi.</a> J Med Entomol. 39, 285-292 (2002).</li><li>Policastro, P. F., Schwan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+infection+of+Ixodes+scapularis+larvae+(Acari:+Ixodidae)+by+immersion+in+low+passage+cultures+of+Borrelia+burgdorferi.">Experimental infection of Ixodes scapularis larvae (Acari: Ixodidae) by immersion in low passage cultures of Borrelia burgdorferi.</a> J Med Entomol. 40, 364-370 (2003).</li><li>Fuente, d. e. l. a., Kocan, J., M, K., Almazan, C., Blouin, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+for+the+study+and+genetic+manipulation+of+ticks.">RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks.</a> Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).</li></ol>

Burada bakteriyel patojen B. nymphal Ixodes keneler hızlı ve etkin enfeksiyon mikroenjeksiyon tabanlı bir prosedür göstermek burgdorferi. Ayrıca B. tespiti için bir konfokal immünofloresan prosedürü tarif in situ kene gut burgdorferi. Bizim gösteri nymphal gut ibaret olmasına rağmen, benzer prosedürler, larva veya yetişkin 8,9 olarak keneler diğer gelişim evreleri için de geçerlidir . Ancak, küçük boyutu nedeniyle, teknik larvaları kullanmak ...

<table><tbody><tr><td>Glass capillary tubes</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Vertical glass puller</td><td>Narishige International</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Petroff-Hausser counting chamber</td><td>Hausser Scientific</td><td>3900</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipette tips</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>920010504</td><td></td></tr><tr><td>Foot control FemtJet</td><td>Eppendorf</td><td>920005098</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td>Filter-sterilized</td></tr></tbody></table>

methods for rapid transfer and localization of lyme disease pathogens within the tick gut

Lyme hastalığı kene kemirgen enfeksiyon döngüsü 1 doğa korunur spirochete patojen Borrelia burgdorferi ile enfeksiyona neden olur. Kene kaynaklı bir fare modelinde 2 laboratuvar Lyme hastalığı araştırmak için geliştirilmiştir . Naif keneler B ile enfekte olabilir burgdorferi enfekte fareler üzerinde onları beslemek, döküm işlemi tamamlamak için ay birkaç hafta sürer. Bu nedenle, mikroenjeksiyon tabanlı bir prosedür olarak daha hızlı ve verimli bir kene enfeksiyonu teknikleri, geliştirme, Lyme hastalığı 3,4 çalışması için önemli bir araçtır. Bu prosedür, sadece saat keneler üretmek için gerektirir ve bir kohort keneler spiroketlerine eşit miktarlarda teslim üzerinde kontrol sağlar. Bu nesil olarak B. özellikle önemlidir fareler kullanarak doğal beslenme süreci burgdorferi keneler beslenen keneler arasında patojen yükünün değişimi% 100 enfeksiyon oranı ve potansiyel sonuçları sağlamak için başarısız olur. Ayrıca, mikroenjeksiyon, B ile keneler enfekte için kullanılabilir burgdorferi bir zayıflatılmış gerginlik farelerde enfeksiyon kuramadı ve böylece doğal keneler 5 tarafından elde edilemez durumlarda izole eder. Bu teknik aynı zamanda kenelerin diğer biyolojik malzemelerin çeşitli sunmak için kullanılabilir, örneğin, spesifik antikorlar veya çift RNA 6 telli . Bu makalede, B. in vitro yetiştirilen nymphal keneler mikroenjeksiyon gösterecektir burgdorferi. Biz de, Lyme hastalığı kene gut konfokal immünofloresan mikroskopi kullanılarak patojenlerin lokalizasyonu için bir yöntem anlatacağım.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut at JoVE.com

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme hastalığı araştırma çalışmaları, genellikle bir süreç genellikle birkaç hafta sürer patojen Borrelia burgdorferi ile enfekte kenelerin nesil gerektirir. Burada saat içinde yapılabilir mikroenjeksiyon tabanlı bir kene enfeksiyonu prosedürü göstermektedir. Ayrıca keneler içinde B. burgdorferi in situ lokalizasyonu için immünofloresan yöntemi göstermektedir.

Hızlı Aktarım ve Lyme Hastalığı Patojenler lokalizasyonu için işaretleyin Gut içinde Yöntemleri

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

methods-for-rapid-transfer-localization-lyme-disease-pathogens-within

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.5K Görüntüleme.  University of Maryland. Lyme hastalığı araştırma çalışmaları, genellikle bir süreç genellikle birkaç hafta sürer patojen Borrelia burgdorferi ile enfekte kenelerin nesil gerektirir. Burada saat içinde yapılabilir mikroenjeksiyon tabanlı bir kene enfeksiyonu prosedürü göstermektedir. Ayrıca keneler içinde B. burgdorferi in situ lokalizasyonu için immünofloresan yöntemi göstermektedir.

Video: Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

RNA Interference in Ticks

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors of human diseases1 and the most important vectors affecting cattle industry worldwide2. Ticks are classified in the subclass Acari, order Parasitiformes, suborder Ixodida and are distributed worldwide from Arctic to tropical regions3. Despite efforts to control tick infestations, these ectoparasites remain a serious problem for human and animal health4,5.
RNA interference (RNAi)6 is a nucleic acid-based reverse genetic approach that involves disruption of gene expression in order to determine gene function or its effect on a metabolic pathway. Small interfering RNAs (siRNAs) are the effector molecules of the RNAi pathway that is initiated by double-stranded RNA (dsRNA) and results in a potent sequence-specific degradation of cytoplasmic mRNAs containing the same sequence as the dsRNA trigger7-9. Post-transcriptional gene silencing mechanisms initiated by dsRNA have been discovered in all eukaryotes studied thus far, and RNAi has been rapidly developed in a variety of organisms as a tool for functional genomics studies and other applications10.
RNAi has become the most widely used gene-silencing technique in ticks and other organisms where alternative approaches for genetic manipulation are not available or are unreliable5,11. The genetic characterization of ticks has been limited until the recent application of RNAi12,13. In the short time that RNAi has been available, it has proved to be a valuable tool for studying tick gene function, the characterization of the tick-pathogen interface and the screening and characterization of tick protective antigens14. Herein, a method for RNAi through injection of dsRNA into unfed ticks is described. It is likely that the knowledge gained from this experimental approach will contribute markedly to the understanding of basic biological systems and the development of vaccines to control tick infestations and prevent transmission of tick-borne pathogens15-19.

A method for RNA interference (RNAi) by injection of dsRNA into unfed ticks is described. RNAi is the most widely used gene-silencing technique in ticks where the use of other methods of genetic manipulation has been limited.

Keneler de RNA Girişim

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these diseases, do not exist in isolation when they colonize the vector; rather, they likely engage in interactions with resident microorganisms in the gut lumen. The vector microbiota has been demonstrated to play an important role in pathogen transmission for several vector-borne diseases. Whether resident bacteria in the gut of the Ixodes scapularis tick, the vector of several human pathogens including Borrelia burgdorferi, influence tick transmission of pathogens is not determined. We require methods for characterizing the composition of the bacteria associated with the tick gut to facilitate a better understanding of potential interspecies interactions in the tick gut. Using whole-mount in situ hybridization to visualize RNA transcripts associated with particular bacterial species allows for the collection of qualitative data regarding the abundance and distribution of the microbiota in intact tissue. This technique can be used to examine changes in the gut microbiota milieu over the course of tick feeding and can also be applied to analyze expression of tick genes. Staining of whole tick guts yield information about the gross spatial distribution of target RNA in the tissue without the need for three-dimensional reconstruction and is less affected by environmental contamination, which often confounds the sequencing-based methods frequently used to study complex microbial communities. Overall, this technique is a valuable tool that can be used to better understand vector-pathogen-microbiota interactions and their role in disease transmission.

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Here, we present a protocol to spatially and temporally assess the presence of viable microbiota in tick guts using a modified whole-mount in situ hybridization approach.

Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Genetik

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

Ixodes scapularis Keneler gelen tükürük, Tükürük Bezi ve hemolimf Koleksiyonu

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on mammalian hosts. In nature, this zoonotic bacterial pathogen may use a variety of reservoir hosts, but the white-footed mouse (Peromyscus leucopus) is the primary reservoir for larval and nymphal ticks in North America. Humans are incidental hosts most frequently infected with B. burgdorferi by the bite of ticks in the nymphal stage. B. burgdorferi adapts to its hosts throughout the enzootic cycle, so the ability to explore the functions of these spirochetes and their effects on mammalian hosts requires the use of tick feeding. In addition, the technique of xenodiagnosis (using the natural vector for detection and recovery of an infectious agent) has been useful in studies of cryptic infection. In order to obtain nymphal ticks that harbor B. burgdorferi, ticks are fed live spirochetes in culture through capillary tubes. Two animal models, mice and nonhuman primates, are most commonly used for Lyme disease studies involving tick feeding. We demonstrate the methods by which these ticks can be fed upon, and recovered from animals for either infection or xenodiagnosis.

Lyme disease is the most commonly-reported vector-borne disease in North America. The causative agent, Borrelia burgdorferi is a spirochete bacterium transmitted by Ixodid ticks. Transmission and detection of infection in animal models is optimized by the use of tick feeding, which we describe here.

Lyme Hastalığı Araştırma İletim ve Xenodiagnosis için Hayvanlar Keneler besleme

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight loss, depreciation of the animals&#39; leather and also can act as a vector of several pathogens. Due to the exorbitant costs to control these parasites, damage to the environment caused by the inappropriate use of chemical acaricides, and the increased resistance against traditional parasiticides, alternative control of ticks, by the use of entomopathogenic fungi, for example, has been considered an interesting approach. Nevertheless, few studies have demonstrated how the tick&#39;s immune system acts to fight these entomopathogens. Therefore, this protocol demonstrates two methods used for entomopathogen inoculation into engorged females and two techniques used for hemolymph collection and hemocytes harvesting. Inoculation of pathogens at the leg insertion in the tick female&#39;s body allows evaluation of females biologic parameters unlike the inoculation between the scutum and capitulum, which frequently damages Gen&#233;&#39;s organ. Dorsal hemolymph collection yielded a higher volume recovery than collection through the legs. Some limitations of tick hemolymph collection and processing include i) high rates of hemocytes&#39; disruption, ii) hemolymph contamination with disrupted midgut, and iii) low hemolymph volume recovery. When hemolymph is collected through the leg cutting, the hemolymph takes time to accumulate at the leg opening, favoring the clotting process. In addition, fewer hemocytes are obtained in the collection through the leg compared to the dorsal collection, even though the first method is considered easier to be performed. Understanding the immune response in ticks mediated by entomopathogenic agents helps to unveil their pathogenesis and develop new targets for tick control. The inoculation processes described here require very low technological resources and can be used not only to expose ticks to pathogenic microorganisms. Similarly, the collection of tick hemolymph may represent the first step for many physiological studies.

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Analysis of tick hemolymph represents an important source of information on how some pathogens cause disease and how ticks immunologically respond to this infection. The present study demonstrates how to inoculate fungal propagules and collect hemolymph from Rhipicephalus microplus engorged females.

Hemolymph toplama ve Metarhizyum blastosporların omurgasız patoloji çalışmalarına doğru Rhipicephalus Microplus ticks içine inoculation

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This process has notably lower efficiencies in the Lyme disease spirochete relative to other, better-characterized Gram-negative bacteria. The rate of success of transformation is highly dependent upon having concentrated amounts of high-quality DNA from specific backgrounds and is subject to significant strain-to-strain variability. Alternative means for introducing foreign DNA (i.e., shuttle vectors, fluorescent reporters, and antibiotic-resistance markers) into B. burgdorferi could be an important addition to the armamentarium of useful tools for the genetic manipulation of the Lyme disease spirochete. Bacteriophage have been well-recognized as natural mechanisms for the movement of DNA among bacteria in a process called transduction. In this study, a method has been developed for using the ubiquitous borrelial phage &#966;BB-1 to transduce DNA between B. burgdorferi cells of both the same and different genetic backgrounds. The transduced DNA includes both borrelial DNA and heterologous DNA in the form of small shuttle vectors. This demonstration suggests a potential use of phage-mediated transduction as a complement to electroporation for the genetic manipulation of the Lyme disease spirochete. This report describes methods for the induction and purification of phage &#966;BB-1 from B. burgdorferi, the use of this phage in transduction assays, and the selection and screening of potential transductants.

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

The ability of bacteriophage to move DNA between bacterial cells makes them effective tools for the genetic manipulation of their bacterial hosts. Presented here is a methodology for inducing, recovering, and using &#966;BB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi, to transduce heterologous DNA between different strains of the Lyme disease spirochete.

Lyme Hastalığının Faj Aracılı Genetik Manipülasyonu Spiroket Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

Kene Kaynaklı Hastalık Araştırmaları için Larva Kenelerine İnsan Maruziyeti

A Model for Experimental Exposure of Humans to Larval Ixodes scapularis Ticks

Tickborne diseases are a significant public health problem in the United States and worldwide. Ticks are obligate blood-feeding arthropods; an ixodid tick must remain attached to the skin of the host and complete its multi-day feeding process to acquire its blood meal. Exposing animals to ticks is a common practice for studying host responses to tick bites and tickborne diseases. We developed the procedure, conducted the first human research study, and published the findings on exposing human volunteers to uninfected larval Ixodes scapularis ticks. This article describes the methodology used to construct the containment dressing, how to apply and secure the ticks to the host, how to maintain the dressing, and how to remove the ticks from the host. Exposing volunteers to tick bites is an experimental procedure and must be performed under a clinical research protocol approved by the appropriate regulatory authorities. This method allows for translational research to better understand the human response to tick bites and foster the development of diagnostics, prevention, and therapies for tickborne diseases.

Yazar Spotlight: Kene Araştırması ve Lyme Hastalığı Çalışmaları için Kontrollü İnsan Maruziyet Modeli

This article presents the methodology for exposing humans to larval Ixodes scapularis for clinical research. The technique is relatively simple, tolerable by the research volunteers, and can be modified according to experimental needs. Such research involving human subjects must be conducted under clinical study protocols approved by the appropriate regulatory authorities.

İnsanların Larva Ixodes scapularis Kenelerine Deneysel Maruziyeti İçin Bir Model

Tickborne diseases are a significant public health problem in the United States and worldwide. Ticks are obligate blood-feeding arthropods; an ixodid tick ...

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to humans through the bite of infected Ixodes ticks. The primary etiological agent in North America is Borrelia burgdorferi sensu stricto. As geographic risk regions expand, it is prudent to support robust surveillance programs that can measure tick infection rates, and communicate findings to clinicians, veterinarians, and the general public. The molecular technique of nested polymerase chain reaction (nPCR) has long been used for this purpose, and it remains a central, inexpensive, and robust approach in the detection of Borrelia in both ticks and wildlife. 
This article demonstrates the application of nPCR to tick DNA extracts to identify infected specimens. Two independent B. burgdorferi targets, genes encoding Flagellin B (FlaB) and Outer surface protein A (OspA), have been used extensively with this technique. The protocol involves tick collection, DNA extraction, and then an initial round of PCR to detect each of the two Borrelia-specific loci. Subsequent polymerase chain reaction (PCR) uses the product of the first reaction as a new template to generate smaller, internal amplification fragments. The nested approach improves upon both the specificity and sensitivity of conventional PCR. A tick is considered positive for the pathogen when inner amplicons from both Borrelia genes can be detected by agarose gel electrophoresis.

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Nested PCR is a sensitive, specific, and straightforward technique that can be applied to tick DNA extracts to probe for Borrelia burgdorferi, the causative agent of Lyme disease. The initial PCR experiment uses gene-specific primers to generate long amplicons, which then become templates for a subsequent reaction using internal primers.

İç içe geçmiş PCR kullanarak keneler Lyme hastalığı Sfilis, Borrelia Burgdorferi, algılama

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...

Hızlı Aktarım ve Lyme Hastalığı Patojenler lokalizasyonu için işaretleyin Gut içinde Yöntemleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Keneler de RNA Girişim

Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme

Ixodes scapularis Keneler gelen tükürük, Tükürük Bezi ve hemolimf Koleksiyonu

Lyme Hastalığı Araştırma İletim ve Xenodiagnosis için Hayvanlar Keneler besleme

Hemolymph toplama ve Metarhizyum blastosporların omurgasız patoloji çalışmalarına doğru Rhipicephalus Microplus ticks içine inoculation

Lyme Hastalığının Faj Aracılı Genetik Manipülasyonu Spiroket Borrelia burgdorferi

İnsanların Larva Ixodes scapularis Kenelerine Deneysel Maruziyeti İçin Bir Model

İnsanların Larva Ixodes scapularis Kenelerine Deneysel Maruziyeti İçin Bir Model

İnsanların Larva Ixodes scapularis Kenelerine Deneysel Maruziyeti İçin Bir Model

İç içe geçmiş PCR kullanarak keneler Lyme hastalığı Sfilis, Borrelia Burgdorferi, algılama