بينما تم إجراء التغذية بالغشاء الاصطناعي من قبل ، فإن بروتوكولنا أسهل في الإعداد وقابل للتكيف مع أنواع القراد الأخرى مع بعض التعديلات. الميزة الرئيسية للتغذية بالغشاء الاصطناعي هي أنها تسمح بالتعرض لمسببات الأمراض والعلاجات التي قد لا تكون ممكنة عن طريق تغذية الحيوانات. يمكن تطبيق نظام تغذية الغشاء الاصطناعي هذا على أنواع المفصليات الأخرى مع بعض الاختبارات للمنشطات البلعمية المثالية والتعديلات على سمك الغشاء المثالي.
يتطلب إنتاج سمك الغشاء الصحيح بعض الممارسة. تأكد من استخدام ميكرومتر لقياس السماكة في عدة مواقع على الغشاء. سيساعدني بنيامين كول ، باحث ما بعد الدكتوراه في مختبرنا ، في توضيح الإجراء.
للبدء ، امسح سطحا مستويا غير مسامي مثل لوح من الزجاج أو قاعدة معدنية مطلية بالسيراميك لحامل ذراع بنسبة 70٪ من الإيثانول ثم قم بتغطيته بطبقة واحدة من الغلاف البلاستيكي. تأكد من أن الغلاف البلاستيكي مسطح وبدون فقاعات أو تجاعيد. قم بلصق ورق تنظيف عدسة الرايون بنسبة 100٪ على السطح المجهز.
تأكد من أنها مسطحة ومشدودة قليلا مع شريط لاصق على جميع الجوانب الأربعة للورقة. قم بإعداد خليط السيليكون الصلابة 0010 عن طريق قياس خمسة ملليلتر من كل جزء من مجموعة السيليكون في حاوية يمكن التخلص منها. امزج السائلين برفق وأضف 1.5 ملليلتر من الهكسان.
استمر في الخلط حتى يصبح الخليط متجانسا ومختلطا تماما. استخدم ممسحة صغيرة لتوزيع مزيج السيليكون على ورق العدسة واتركه يقف لمدة دقيقة واحدة للتأكد من نقع السيليكون في ورق العدسة. بثبات ، اكشط السيليكون الزائد إلى الجانب مع الممسحة باستخدام كمية صغيرة من الضغط الهبوطي.
قم بإجراء تمريرة ثانية باستخدام الممسحة دون ممارسة الضغط لأسفل لإزالة أي خطوط من السيليكون وإنتاج طبقة ناعمة. بالنسبة لليرقات فقط ، اغمس الجزء العلوي من حجرة التغذية في راتنج فلوروبوليمر Fluon عدة مرات ، مما يسمح لها بالجفاف بين التطبيقات لإنتاج طبقة متسقة. اترك الغشاء للعلاج لمدة 24 ساعة على الأقل في بيئة خالية من الغبار مثل خزانة مغلقة للمواد الكيميائية أو السلامة الحيوية.
بعد ذلك ، امزج أجزاء متساوية من مزيج السيليكون A و B لتحضير خليط السيليكون 30 صلابة لربط الغرف بالغشاء. اغمس غرف البولي كربونات حوالي ربع بوصة في خليط السيليكون ثم ضعها على لوح الغشاء ، مع الحرص على عدم تداخل أي من الأشرطة. اترك السيليكون المرفق للعلاج لمدة 24 ساعة على الأقل.
باستخدام مشرط ، قم بقص الغشاء بعناية حول كل غرفة من الغرف المرفقة ، مع تقليم الحواف بحيث يمكن وضعها بسلاسة في بئر من لوحة الآبار الستة دون كشط كبير على الجانبين. السماح بمواد كافية خارج الغرفة لزيادة إضافة الغشاء. قطع قطعة صغيرة من الغشاء المتبقي من كل زاوية ومركز ورقة الغشاء.
قم بإزالة الغلاف البلاستيكي من كل قطعة وقم بقياس القطع باستخدام ميكرومتر لتحديد متوسط سمك الغشاء. ضع غرف التغذية مع حلقة O واحدة لكل حجرة في دورق زجاجي ليتم تعقيمها عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل لتعقيمها. اترك الغرف تبرد قبل استخدامها.
بعد إخراج غرف الغشاء المعقمة المعدة مسبقا ووضع الحلقة O حولها ، املأ كل غرفة بما يكفي من الإيثانول بنسبة 70٪ لتغطية الغشاء. اتركه في طبق من ستة آبار لمدة خمس دقائق ثم ابحث عن أي تسرب بين الغرفة والغشاء وفي الغشاء نفسه. أفرغ الإيثانول من الغرف ثم اتركه يجف في الهواء داخل خزانة السلامة الحيوية أو غطاء التدفق الرقائقي.
لتسخين وتنشيط المكمل في الدم ، قم بتسخينه عند 56 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة وتكملة دم البقر مزيل الرجفان ميكانيكيا بجرامين لكل لتر من الجلوكوز. بمجرد أن يجف الغشاء ، ضع حوالي 20 ميكرولترا من المنشطات البلعمية داخل الحجرة وقم بإمالة الحجرة لنشرها حول السطح. عندما يجف المنشط البلعمي ، أضف القراد بسرعة إلى الغرفة إما بفرشاة أو ملقط.
أغلق الجزء العلوي بالبارافيلم لأن الحرارة من الحمام المائي يمكن أن تتسبب في تمزقه. ثم أضف خمسة ملليلتر من الحرارة والدم المنشط لكل بئر أو غرفة في أنبوب مخروطي ووضعه في حمام مائي مضبوط على 36 درجة مئوية. أضف خمسة ميكرولترات من ثلاثة ملليمولار ATP و 50 ميكرولترا من مخزون 100X من فطريات الستربتومايسين البنسلين لكل خمسة ملليلتر من الدم إلى الأنبوب ونقل 4.5 ملليلتر من الدم إلى بئر من ستة آبار صفيحة.
ضع الحجرة برفق في البئر ، واضبط ارتفاع الحلقة O على الحجرة بحيث يجلس الغشاء في الدم ، لكن مستوى الدم حول الجانب لا يتجاوز البئر. ثم ضع البئر في الدم بزاوية لتجنب تكوين فقاعة الهواء بين الدم والغشاء. ضع غطاء لوحة البئر الستة أعلى غرف التغذية.
ضع لوحة الآبار الستة مع الغرف في حمام مائي معد 34 درجة مئوية والغطاء. أضف خمسة ميكرولترات من ثلاثة ملليمولار ATP و 50 ميكرولترا من مخزون 100X من فطريات الستربتومايسين البنسلين لكل بئر إلى أنبوب الدم وانقل 4.5 ملليلتر من الدم إلى بئر من صفيحة ستة آبار جديدة كما هو موضح سابقا. أخرج لوحة الآبار الستة مع غرفة القراد من الحمام المائي وأخرج الغرفة من البئر.
شطف الجزء الخارجي من الغرفة والغشاء مع 10 ملليلتر من 1X PBS معقمة لإزالة الدم. باستخدام ورق الترشيح المعقم ، جفف الغشاء والغرفة برفق لإزالة PBS الزائد. إذا كان هناك الكثير من التكثيف داخل الغرفة ، جفف البقع الرطبة بورق ترشيح معقم قبل إغلاقه ببارافيلم جديد.
ثم استبدل البارافيلم في الجزء العلوي من الغرفة. ضع حجرة القراد في طبق الآبار الستة الجديد بدماء جديدة ، واضبط ارتفاع الحلقة O إذا لزم الأمر. كرر هذه الخطوات لكل غرفة على اللوحة.
أخيرا ، ضع غطاء لوحة الآبار الستة فوق الجزء العلوي من الغرف وانقل لوحة الآبار الستة الجديدة مرة أخرى إلى حمام مائي 34 درجة مئوية. يتم عرض تغذية مستمرة مع حوريات ixodes scapularis المحتقنة جزئيا. النقاط السوداء أو البنية حول مواقع التعلق هي الصقيع الذي يمكن جمعه أثناء وبعد التغذية لصنع المنشط البلعمي.
وينظر إلى الحوريات كتفي كتفي المحتقنة جزئيا تعلق على الغشاء. يمكن أيضا رؤية قشر قالب اليرقات المحتقن هنا. يتم عرض أرقام احتقان القراد وأوزان كتلة البيض في هذا الجدول.
كانت الظروف التجريبية لاحتقان اليرقات والحوريات تحتوي على تجانس أعضاء الغزلان المضافة إلى الدم بالإضافة إلى المكملات المستخدمة في هذه التقنية. هنا ، تم تعريف الاحتقان الناجح على أنه إما القراد المحتقن الذي نجح في الانتقال إلى المرحلة الحية التالية أو الإناث المحتقنة التي وضعت البيض بنجاح. يتطلب الأمر ممارسة للحصول على سمك مقبول عند وضع السيليكون على ورق العدسة ، لذلك من المهم دائما قياس سمك الغشاء قبل الاستخدام.
التغذية الغشائية يمكن أن تعرض القراد لمسببات الأمراض أو المضادات الحيوية. يمكن تقييم آثار هذه على جوانب بيولوجيا القراد مثل نجاح طرح الريش ووضع البيض والبقاء على قيد الحياة بعد التغذية.
