ريتشارد دبليو برنجر وديفيد آش L. ، تطبيقات العلماء ، والمنتجات الحرارية NanoDrop العلمية ، للحصول على المساعدة الفنية والتصوير.

<html> 1. Microvolume الكمي الأحماض النووية باستخدام 2000c NanoDrop الطيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتبدأ ، وتنظيف الأسطح العلوية والسفلية البصري للنظام معمل microvolume الاحتفاظ العينة pipetting 2-3 ميكرولتر من المياه النظيفة منزوع الأيونات على سطح الدنيا البصرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق ذراع الرافعة ، وضمان أن رمى العليا يأتي في اتصال مع الماء منزوع الأيونات. رفع ذراع الرافعة وتمحو كل من السطوح البصرية مع نظيفة ، خالية من الوبر ، جافة محو المختبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افتح البرنامج وحدد NanoDrop تطبيق الأحماض النووية. استخدام صغيرة الحجم ، pipettor معايرة لإجراء القياس بواسطة فارغة الاستغناء 1 ميكرولتر من عازلة على السطح السفلي البصرية. انخفاض ذراع الرافعة وحدد &quot;فارغة&quot; في تطبيق الأحماض النووية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد اكتمال قياس فارغة ونظيفة والسطوح البصرية على حد سواء مع نظيفة ، خالية من الوبر ، جافة محو المختبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر ثابتة ملائمة للعينة التي سيتم قياسها. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> نوع العينة </td><td> حدد الخيار </td><td> ثابت يستخدم لحساب التركيز </td></tr><tr><td> dsDNA </td><td> DNA - 50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNA </td><td> DNA - 33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> RNA - 40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> أليغو </td><td> عرف </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. النموذجية تركيز حمض النووي نطاقات مباشرة قياسات الامتصاصية A280 باستخدام NanoDrop microvolume معمل ، وكفيت التقليدية المستندة إلى معمل استخدامها مع كفيت microcell TrayCell ، وfluorospectrometer NanoDrop microvolume بالتزامن مع مقايسة PicoGreen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء 1 ميكرولتر من عينة الحمض النووي على قاعدة التمثال انخفاض البصرية وإغلاق ذراع الرافعة. لأن القياس هو حجم مستقلة ، والعينة يحتاج فقط إلى سد الفجوة بين سطحين البصرية للقياس في هذا الشأن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;القياس&quot; في تطبيق البرمجيات. يقوم البرنامج تلقائيا بحساب تركيز حمض النووي ونقاء النسب. قياس العينة التالية ، استعراض الإخراج الطيفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يقوم البرنامج تلقائيا بحساب تركيز حمض النووي ونقاء النسب. قياس العينة التالية ، واستعراض الصور الطيفية لتقييم جودة عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وهناك عينة نموذجية من الحمض النووي لمحة مميزة جدا. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. سوف نموذجي عينة الحمض النووي لديك ملف مميزة جدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مصادر مشتركة من الملوثات المرتبطة محددة تقنيات عزل الحمض النووي تشمل استخراج الفينول / Trizol والعمود. في حالة استخراج الفينول / Trizol ، قد أشارت المتبقية التلوث بواسطة كاشف أطياف شاذة بين 220-240 نانومتر فضلا عن التحولات في المنطقة 260-280 نانومتر. على العكس ، قد الجوانيدين المتبقية من استخراج العمود تسهم في ذروة قرب 230 نانومتر ، وتحولا في الحوض الصغير من 230 نانومتر إلى حوالي 240 نانومتر. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2 ، والتحولات في القمم وهبوطا من B و C العينات بالمقارنة مع عينة لتوضيح كيفية الملوثات يمكن أن تؤثر على أطياف عينات الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم جودة عينة من الدقة ، ينبغي تحليل 260/280 260/230 أو نسب في تركيبة مع الجودة الشاملة الطيفية. الأحماض النووية محض عادة نسبة العائد 260/280 من ~ 1.8 و 260/280 من نسبة 2.0 ~ ل DNA و RNA ، على التوالي. هذه النسبة تعتمد على درجة الحموضة والقوة الأيونية للالعازلة التي استخدمت لصنع نموذج فارغ والقياسات. والمحاليل الحمضية تحت تمثل النسبة التي 0،2-0،3 ، في حين أن الحل الأساسي والإفراط في تمثيل النسبة التي 0،2-0،3. قد تختلف اختلافا كبيرا نقاء النسب تشير إلى وجود الملوثات ، والفينول أو غيرها من البروتين التي تمتص بشدة عند أو بالقرب من 280 نانومتر. نسبة نقاوة 260/230 هو التدبير الثاني من النقاء الحمض النووي مع القيم عن &quot;نقية&quot; الحمض النووي عادة في نطاق 1،8-2،2. وقد نسب نقاء التي هي أقل بكثير من القيم المتوقعة تشير إلى استخدام أسلوب العزل قد تتطلب التحسين أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أيضا أن تستخدم NanoDrop مطياف لقياس بروتينات باستخدام الامتصاصية المباشر أو عن طريق فحوصات بروتين اللونية. المناسبة لضمان تشكيل العمود واستنساخ ، وينصح 2 ميكرولتر العينات للحصول على عينات من البروتين. الرجوع إلى الفيديو إن الرب التالية : Microvolume تحديد تركيز البروتين استخدام الطيف NanoDrop <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">https://www.jove.com/index/Details.stp؟ID=1610</a> </li></ol>ق = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. عالية الحساسية Microvolume الكميات الأحماض النووية باستخدام NanoDrop 3300 Fluorospectrometer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإثبات ذات حساسية عالية microvolume الكميات باستخدام الحمض النووي NanoDrop 3300 ، تم استخدام عدة PicoGreen مضان. لتبدأ ، يوازن معايير عدة ، وجميع عينات الحمض النووي إلى درجة حرارة الغرفة. عينات الفلورسنت خفيفة حساسة ويجب أن يوضع في العنبر أو أنابيب مغلفة الألومنيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1X يكفي TE العازلة للجميع المعايير والعينات المراد قياسها وكذلك من أجل حل PicoGreen العمل التي ستكون هناك حاجة. إعداد 1xTE العازلة التي قدمت تمييع 20X TE العازلة مع nuclease خالية من المياه في البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. رد فعل يمكن أن أحجام تتراوح ما بين 200 ميكرولتر إلى أقل من 10 ماي. في هذا المثال ، سيتم إعداد 10 مجلدات رد فعل ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد معايير dsDNA متسلسل المخفف في التركيز النهائي المطلوب في 2X nuclease خالية من قوارير أو أنابيب. نقل 5 ميكرولتر من كل من معايير dsDNA المخفف في الفرد المسمى nuclease خالية من العنبر أو احباط المغطاة الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 5 ميكرولتر من كل عينة من dsDNA الفائدة في العنبر nuclease خالية المسمى بشكل مناسب أو احباط المغطاة الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل PicoGreen العمل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. نقل حجم مساو من الحل PicoGreen العمل على كل أنبوب تحتوي إما القياسية أو عينة من الفائدة (5 ميكرولتر في هذا المثال). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع كميات متساوية من 1X TE العازلة وPicoGreen حل عمل للاعداد لسيطرة السلبية ، التي هي بمثابة حل المرجع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط محتويات كل أنبوب دقيق من قبل pipetting رد فعل لطيف واحتضان ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ينبغي لجميع المعايير ومعايرتها العينات إلى نفس درجة الحرارة قبل القياس كما يتأثر بدرجة الحرارة إشارة مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد وتنفيذ صك القياسات ، وتنظيف الأسطح أولا السفلي والعلوي من العينة نظام الاستبقاء. الماصة 2-3 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات على السطح السفلي الضوئية ، ثم أغلق فتح ذراع الرافعة ، وصمة عار على الركائز العليا والسفلى مع نظيفة ، خالية من الوبر ، والمختبرات القضاء. ضمان الأسطح خالية من الوبر قبل المضي قدما كما يمكن أن يحمل مضان الوبر في وجود مصدر الإثارة ويمكن أن تتداخل مع القياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح أداة البرمجيات ، حدد &quot;الأحماض النووية&quot; التطبيق ، وحدد &quot;PicoGreen - dsDNA&quot; الخيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى فارغة الصك ، إضافة 2 ميكرولتر من TE 1X إلى انخفاض رمى ، على مقربة من الذراع ، وحدد &quot;فارغة&quot; في الصك مجال البرمجيات. بمجرد اكتمال فارغة ، وصمة عار قبالة حل فارغة من كل السطوح من العينة نظام الاستبقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الحل إشارة pipetting لطيف. نصائح الاحتفاظ به منخفضة ، ماصة 2 ميكرولتر على أقل رمى وإغلاق الذراع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;مرجع&quot; في نوع القياس ، وحدد الوحدات المطلوبة. انقر على &quot;التدبير&quot; لبدء دورة القياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تكون دورة القياس اكتمال فتح الذراع وصمة عار تماما قبالة السطوح عينة نظام الاستبقاء. قياس ما يصل إلى خمسة مكررات الإشارة ، وذلك باستخدام قسامة جديدة لكل تكرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر العملية لمعايير إضافية لبناء منحنى القياسية. ويمكن استخدام ما يصل الى سبعة المعايير. وقد صمم البرنامج لتخزين ما يصل إلى خمسة مكررات لكل معيار. وبلغ متوسط ​​مكررات من المعايير لإنشاء منحنى القياسية التي تتحدد تلقائيا تركيزات العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد اكتمال منحنى القياسية ، حدد &quot;عينات&quot; التبويب ، أدخل الرقم عينة منها المعلومات وقياس كل عينة مجهولة. </li></ol>

<ol>
	<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity.">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li><li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Quantification+of+Nucleic+Acids:+LabelGuard+enables+photometric+quantification+of+submicroliter+samples+using+a+standard+photometer.">Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer.</a> Implen Applications Note. , (2006).</li><li>Jr, I. n. g. l. e., D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spectrochemical analysis. , XV-590 (1988).</li><li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA.">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li></ol>

ويعمل فيليب ديجاردان وكونكلين ديبرا المنتجات الحرارية التي NanoDrop العلمية ، وشركة التي تنتج الأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

تستند بروتوكولات الكميات المعروضة هنا على أنظمة microvolume الأكثر قبولا على نطاق واسع. مثل هذه الأنظمة توفير بدائل عملية للحمض النووي المنهجية التقليدية الكميات ، التي تعتمد على كميات أكبر من العينات واستخدام أجهزة الاحتواء. NanoDrop microvolume توظف التكنولوجيا نظام الاحتفاظ العينة التي تعتمد على خصائص التوتر السطحي من العينة التي يجري قياسها على شكل عمود السائل. فمن الضروري أن العينة يجعل الاتصال مع قياس السطوح البصرية العلوي والسفلي لتشكيل العمود المناسب. إذا في أي نقطة من نتائج القياس يبدو غير صحيحة أو لا يمكن استنساخه ، فمن الأرجح نتيجة عدم التجانس أو عينة السائل كسر العمود. لا ينصح المنظفات ومواد التنظيف ايزوبروبيل لأنها قد uncondition السطوح قياس التمثال. ورمى دون شروط يحدث عندما تعرضت لما يثير الشبهة خصائص سطح مسعور من التمثال ، مما أدى إلى تسطيح للقطيرة عينة. ويمكن أن يؤدي إلى الركائز دون شروط كسر العمود السائل خلال القياس. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> ويتميز الشكل 3. السطح دون شروط من قبل تسطيح قطرات المياه. قد تكون مجددة السطوح رمى به Uncondtioned NanoDrop مجمع الركيزة تجديد (PR - 1 ، الحرارية العلمية منتجات NanoDrop). يتم تطبيق طبقة رقيقة من مجمع مساحته إلى السطوح رمى العلوي والسفلي ، سمح لتجف لمدة 30 ثانية ~ ، ثم يفرك قبالة باستخدام جافة ونظيفة وخالية من الوبر مختبر المسح. وتتميز حالة مجددة بنجاح بواسطة قطرات المياه الديكور حتى عندما يطبق إلى أسفل سطح التمثال. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. يتميز سطح مجددة من الديكور تتكون من قطرات الماء. نظم الكميات Microvolume الحد بشكل كبير من استهلاك العينة وزيادة كبيرة في نطاق التركيز عند مقارنة لأنظمة القياس الكمي أكثر تقليدية. على الرغم من أن الكميات microvolume أصبحت في كثير من الأحيان عبارة عن تقنية تمكن من الظروف التي تنطوي على محدودية كتلة الخلية مثل إبرة الخزعات وmicrodissection الليزر التقاط والكفاءة وسهولة استخدام هذه المنهجية قد جعل من بديل لقبول التقليدية على نطاق واسع الكميات حمض النووي حتى طرق عندما عينة وفيرة.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

nanodrop microvolume quantitation of nucleic acids

ويجري باستمرار المقايسات الجزيئية البيولوجية المتقدمة التي تستخدم كميات صغيرة من المواد تدريجيا ، غالبا ما يحول دون استخدام الأدوات التقليدية المستندة كفيت عن الكميات الحمض النووي لتلك التي يمكن أن تؤدي الكميات microvolume. العينة microvolume NanoDrop نظام الاستبقاء (المنتجات الحرارية NanoDrop العلمية) من خلال الجمع بين وظائف تكنولوجيا الألياف البصرية ، والخصائص الطبيعية التوتر السطحي لالتقاط والاحتفاظ بها كميات ضئيلة من عينة مستقلة عن أجهزة الاحتواء التقليدية مثل cuvettes أو الشعيرات الدموية. وعلاوة على ذلك ، فإن النظام يعمل طول مسار أقصر ، مما يؤدي إلى طائفة واسعة من قياسات تركيز حمض النووي ، والقضاء اساسا على الحاجة إلى إجراء التخفيفات. تخفيض حجم العينة المطلوبة لتحليل الطيفي تسهل أيضا إدراج خطوات إضافية لمراقبة الجودة في جميع أنحاء سير العمل الجزيئية كثيرة ، وزيادة كفاءة ويؤدي في نهاية المطاف إلى مزيد من الثقة في النتائج النهائية. وقد برزت الحاجة إلى حساسية عالية من التحليل الشامل الفلورسنت محدودة أيضا مع التقدم التجريبية الاخيرة. باستخدام التكنولوجيا نفسها microvolume الاحتفاظ عينة ، قد يتم تنفيذ قياسات الفلورسنت مع 2 ميكرولتر من المواد ، مما يسمح الفلورسنت متطلبات حجم المقايسات خفضت بشكل ملحوظ. microreactions هذه ميكرولتر من 10 أو أقل من الممكن الآن استخدام fluorospectrometer microvolume مخصص. سيظهر اثنين microvolume الكميات الحمض النووي البروتوكولات التي تستخدم نظم متكاملة الاحتفاظ العينة كما بدائل عملية لبروتوكولات كفيت التقليدية القائمة. الأول ، هو وصف لطريقة مباشرة الامتصاصية A260 باستخدام معمل microvolume. اعقب ذلك عرض لطريقة مضان على أساس أنه يتيح تقليص حجم وتفاعلات مع مضان fluorospectrometer microvolume. هذه التقنيات الجديدة تمكن من تقييم تركيز الحمض النووي التي تتراوح بين 1 بيكوغرام / ميكرولتر إلى 15000 نانوغرام / ميكرولتر مع استهلاك الحد الأدنى من العينة.

Watch this Scientific Journal Video about NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids at JoVE.com

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

يوصف استخدام نظم microvolume NanoDrop كبدائل عملية وفعالة للحمض النووي التقليدية من خلال منهجية الكميات المظاهرة اثنين من بروتوكولات الكميات microvolume النووية الحمضية.

NanoDrop Microvolume الكميات من الأحماض النووية

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

<a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2891"> &#x4E2D;&#x6587; </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2892"> Deutsch </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2893"> Fran&#231;ais </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2894"> Espa&ntilde;ol </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/Details.stp?ID=2895"> &#x65E5;&#x672C;&#x8A9E; </a>

nanodrop-microvolume-quantitation-of-nucleic-acids

Research

JoVE Journal

Biology

201.9K Views.  Thermo Scientific NanoDrop Products.  中文 Deutsch Français 

Video: NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

ميثليته الحمض النووي مناعي

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Microvolume تحديد تركيز البروتين باستخدام 2000c NanoDrop الطيف

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

تعميم الرنا الميكروي الكمي باستخدام الحمض النووي ملزم صبغ الكيمياء والقطرة PCR الرقمية

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Bioengineering

<meta charset="utf8"></head><body>آلات نانوية دقيقة للحمض النووي لتحليل الحمض النووي الريبي والحمض النووي التمييزي

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>تسليط الضوء على المؤلف: التطورات في أجهزة الاستشعار النانوية للحمض النووي - معالجة تحديات الحساسية والانتقائية في الكشف الجزيئي

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

آلات نانوية قائمة على DNAzyme 10-23 للتعرف على الحمض النووي

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

Biochemistry

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

تعيين تركيز الأحماض النووية والبروتينات باستخدام الصغرى ، حجم الطيف نانو بيو المواصفات

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

ربط ذات كفاءة عالية من الحمض النووي الريبي الجزيئات الصغيرة لالرنا الميكروي الكميات من قبل التسلسل الإنتاجية العالية

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

يستند التحقيق، في الوقت الحقيقي PCR مقاربات للقياس الكمي من microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

قراءات السائبة بسيطة الرقمية نوكليك حمض الكمي فحوصات

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

NanoDrop Microvolume الكميات من الأحماض النووية

Transcript

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST