Richard W. Beringer e David L. Ash, gli scienziati le applicazioni, prodotti Thermo NanoDrop scientifico, per l&#39;assistenza tecnica e le riprese.

1. Microvolumi Quantificazione degli acidi nucleici Utilizzando un NanoDrop 2000c Spettrofotometro <ol><li> Per iniziare, pulire le superfici superiori ed inferiori ottica del sistema di ritenzione spettrofotometro microvolumi campione pipettando 2-3 ml di acqua deionizzata pulita sulla superficie inferiore ottica. </li><li> Chiudere il braccio di leva, assicurandosi che il piedistallo superiore entra in contatto con l&#39;acqua deionizzata. Sollevare il braccio di leva e pulire entrambe le superfici ottiche con un panno pulito, asciutto e privo di laboratorio di pulire. </li><li> Aprire il software NanoDrop e selezionare l&#39;applicazione di acido nucleico. Utilizzare un piccolo volume, pipettatore calibrato per eseguire una misurazione vuoto dispensando 1 ml di tampone sulla superficie inferiore ottica. Abbassare il braccio di leva e selezionare &quot;vuoto&quot; nella domanda di acido nucleico. </li><li> Una volta che la misura è vuoto completo, pulire entrambe le superfici ottiche con un panno pulito, asciutto e privo di laboratorio di pulire. </li><li> Scegli la costante appropriata per il campione che deve essere misurato. <table border="1"><tbody><tr><td> Tipo di campione </td><td> Selezionare l&#39;opzione </td><td> Costante utilizzata per calcolare la concentrazione </td></tr><tr><td> dsDNA </td><td> DNA-50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNA </td><td> DNA-33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> RNA-40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Oligo </td><td> Costume </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Tipici acidi nucleici gamme di concentramento diretto A280 misure assorbanza usando un NanoDrop microvolumi spettrofotometro, un tradizionale cuvetta a base di spettrofotometro usato con un Microcell TrayCell cuvetta, e un fluorospectrometer NanoDrop microvolumi in collaborazione con il saggio PicoGreen. </li><li> Dispensare 1 ml di campione di acido nucleico sul piedistallo più basso ottico e chiudere il braccio di leva. Poiché la misura è volume indipendente, il campione ha solo bisogno di colmare il divario tra le due superfici ottiche per una misura da effettuare. </li><li> Selezionare &quot;misura&quot; nel software applicativo. Il software calcola automaticamente l&#39;acido nucleico rapporti di concentrazione e purezza. A seguito di misura, controlla l&#39;emissione spettrale. </li><li> Il software calcola automaticamente l&#39;acido nucleico rapporti di concentrazione e purezza. A seguito di misura, controlla l&#39;immagine spettrale di valutare la qualità del campione. </li><li> Un esempio tipico di acidi nucleici avrà un profilo molto caratteristico. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Un esempio tipico di acidi nucleici avrà un profilo molto caratteristico. </li><li> Le fonti comuni di contaminanti associati a specifiche tecniche di acidi nucleici isolamento includono l&#39;estrazione fenolo / Trizol e colonna. Nel caso di estrazione fenolo / Trizol, la contaminazione dei reagenti residuo può essere indicato da spettri anomali tra 220-240 nm e dagli spostamenti nella regione 260-280 nm. Al contrario, guanidina residuo dall&#39;estrazione colonna possono contribuire a raggiungere un picco vicino a 230 nm e un cambiamento nella vasca da 230 nm a circa 240 nm. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. I cambiamenti nella alti e bassi dei campioni B e C rispetto al campione A illustrare come contaminanti possono influenzare gli spettri di campioni di acidi nucleici. </li><li> Per valutare accuratamente la qualità del campione, 260/280 o 260/230 rapporti devono essere analizzati in combinazione con la complessiva qualità spettrale. Pure acidi nucleici tipicamente produrre un rapporto di 260/280 ~ 1,8 e un rapporto di 260/280 ~ 2.0 per DNA e RNA, rispettivamente. Questo rapporto dipende dal pH e forza ionica del tampone usato per fare il vuoto e le misure del campione. Soluzioni acide sarà sotto-rappresentano il rapporto di 0,2-0,3, mentre una soluzione di base si sovra-rappresentare il rapporto di 0,2-0,3. Rapporti di purezza significativamente differenti possono indicare la presenza di proteine, fenolo o altri contaminanti che assorbono fortemente nei pressi o 280 nm. Il rapporto di 260/230 purezza è una seconda misura di purezza del DNA con i valori di un acido &quot;puro&quot; nucleici comunemente nel range di 1,8-2,2. Rapporti di purezza che sono significativamente inferiori ai valori attesi possono indicare la tecnica di isolamento utilizzato può richiedere un&#39;ulteriore ottimizzazione. </li><li> Spettrofotometri NanoDrop può anche essere utilizzato per quantificare le proteine ​​mediante assorbanza direttamente o tramite test colorimetrici proteine. Per garantire una corretta formazione della colonna e riproducibilità, 2-microlitri campioni si consiglia di campioni di proteine. Fare riferimento al seguente video jove: Determinazione delle proteine ​​microvolumi Concentrazione Utilizzando lo spettrofotometro NanoDrop <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610</a> </li></ol><ol><li> Per dimostrare ad alta sensibilità quantificazione degli acidi nucleici microvolumi utilizzando il NanoDrop 3300, un kit PicoGreen fluorescenza viene utilizzato. Per iniziare, equilibrare gli standard kit e tutti i campioni di acidi nucleici a temperatura ambiente. Campioni fluorescenti sono sensibili alla luce e deve essere conservato in ambra o tubi avvolti in alluminio. </li><li> Preparare abbastanza 1x tampone TE per tutti gli standard ed i campioni da misurare, nonché per la soluzione PicoGreen di lavoro che saranno necessarie. Preparare tampone 1xTE diluendo il fornita 20x TE buffer con acqua priva di nucleasi per protocollo del produttore. Volumi di reazione può variare da 200 ul a un minimo di 10 ul. In questo esempio, 10 volumi di reazione microlitri sarà preparato. </li><li> Preparare in serie standard diluita dsDNA a 2x la concentrazione finale desiderata nucleasi-free fiale o provette. Trasferire 5 ml di ciascuna soluzione standard di dsDNA diluito in un individuo etichettato nucleasi-free ambra o alluminio coperto di tubo. </li><li> Aliquota 5 ml di ogni campione dsDNA di interesse in adeguatamente etichettati nucleasi-free ambra o foglio coperto di tubi. </li><li> Preparare la soluzione PicoGreen di lavoro secondo il protocollo del produttore. Trasferire un volume uguale della soluzione PicoGreen di lavoro ad ogni provetta contenente sia uno standard o campione di interesse (5 microlitri in questo esempio). </li><li> Combina volumi uguali di 1x tampone TE e PicoGreen soluzione di lavoro per preparare il controllo negativo, che serve come soluzione di riferimento. </li><li> Mescolare il contenuto di ogni provetta accuratamente pipettando dolce e incubare le reazioni a temperatura ambiente per 5 minuti. Tutti gli standard ed i campioni devono essere equilibrati per la stessa temperatura prima della misurazione come segnale di fluorescenza è influenzata dalla temperatura. </li><li> Per preparare lo strumento e di eseguire le misurazioni, in primo luogo la pulizia delle superfici inferiore e superiore del sistema di ritenzione del campione. Pipettare 2-3 ml di acqua deionizzata sulla superficie inferiore ottica, chiudere quindi aprire il braccio di leva, e cancella i piedistalli superiore e inferiore con un panno pulito, privo di lanugine, pulire laboratorio. Assicurarsi che le superfici siano prive di lanugine prima di procedere come niente può esibire fluorescenza in presenza di una fonte di eccitazione e possono interferire con la misurazione. </li><li> Aprire il software dello strumento, selezionare l&#39;opzione &quot;Nucleic Acids&quot; applicazione e selezionare l&#39;opzione &quot;PicoGreen-dsDNA&quot;. </li><li> Al vuoto dello strumento, aggiungere 2 ml di TE 1x al piedistallo più basso, vicino al braccio, e selezionare &quot;Vuoto&quot; nel campo del software dello strumento. Una volta vuota è completo, macchia al largo della prova in bianco su entrambe le superfici del sistema di ritenzione del campione. </li><li> Mescolare la soluzione di riferimento pipettando gentile. Utilizzando punte bassa ritenzione, pipetta 2 microlitri sul piedistallo più basso e chiudere il braccio. </li><li> Selezionare &quot;di riferimento&quot; nel tipo di misura, e selezionare le unità desiderate. Fare clic su &quot;misura&quot; per avviare il ciclo di misurazione. </li><li> Quando il ciclo di misura, aprire completamente il braccio e macchia le superfici Sistema di ritenzione del campione. Misura fino a cinque repliche di riferimento, su una nuova aliquota per ogni replica. </li><li> Ripetere la procedura per gli standard aggiuntivi per costruire una curva standard. Fino a sette norme possono essere utilizzati. Il software è progettato per memorizzare fino a cinque repliche per ogni standard. Replica degli standard viene calcolata la media per generare una curva standard da cui concentrazioni del campione sono determinati automaticamente. </li><li> Una volta che la curva standard è completo, selezionare la scheda &quot;Campioni&quot;, inserire le rispettive informazioni ID campionamento e la misurazione di ogni campione sconosciuto. </li></ol>

<ol>
	<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity.">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li><li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Quantification+of+Nucleic+Acids:+LabelGuard+enables+photometric+quantification+of+submicroliter+samples+using+a+standard+photometer.">Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer.</a> Implen Applications Note. , (2006).</li><li>Jr, I. n. g. l. e., D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spectrochemical analysis. , XV-590 (1988).</li><li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA.">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li></ol>

Philippe Desjardins e Debra Conklin sono dipendenti di Thermo Scientific NanoDrop Products, Inc che produce gli strumenti utilizzati in questo articolo.

I protocolli di quantificazione qui presentati sono basati sul più diffuso dei sistemi microvolumi. Tali sistemi offrono alternative pratiche per la tradizionale metodologia di quantificazione acidi nucleici, che si basano su maggiori volumi di campione e l&#39;impiego di attrezzature di contenimento. NanoDrop microvolumi tecnologia si avvale di un sistema di ritenzione del campione che si basa sulle proprietà tensione della superficie del campione da misurare a formare una colonna di liquido. E &#39;essenziale che il campione entra in contatto con le superfici superiori ed inferiori misura ottica per la formazione di colonna corretta. Se in qualsiasi momento i risultati delle misurazioni sembrano imprecisi o non riproducibili, è probabilmente il risultato di eterogeneità del campione o la rottura della colonna liquida. Detergenti e alcool isopropilico non sono consigliati detergenti in quanto potrebbero uncondition le superfici piedistallo di misura. Un piedistallo incondizionata si verifica quando le proprietà di superficie idrofoba del piedistallo sono stati compromessi, con un conseguente appiattimento della goccia campione. Piedistalli incondizionato può portare alla rottura della colonna di liquido durante la misurazione. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Superficie Figura 3. Incondizionato è caratterizzata da un appiattimento di una goccia d&#39;acqua. Superfici piedistallo Uncondtioned possono essere revisionati con Compound NanoDrop piedistallo Ricondizionamento (PR-1, Thermo Scientific Prodotti NanoDrop). Un sottile strato di composto ricondizionamento viene applicata alle superfici piedistallo superiore e inferiore, lasciato asciugare per circa 30 secondi, poi strofinando con un panno pulito, asciutto e privo di laboratorio di pulire. Uno stato con successo ricondizionati è caratterizzato da una goccia d&#39;acqua perline quando applicato sulla superficie in basso piedistallo. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Ricondizionati Una superficie è caratterizzata da una bordatura di una goccia d&#39;acqua. Sistemi di quantificazione microvolumi ridurre notevolmente il consumo di campione e aumentare notevolmente il range di concentrazione rispetto ai più tradizionali sistemi di quantificazione. Anche se la quantificazione microvolumi è diventato spesso una tecnologia abilitante per le circostanze che coinvolgono la massa limitata di cellule, come le biopsie ago e laser-capture microdissezione, l&#39;efficienza e la facilità d&#39;uso di questa metodologia ha reso un ampiamente accettato alternativa ai tradizionali metodi di quantificazione acidi nucleici anche campione quando è abbondante.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

nanodrop microvolume quantitation of nucleic acids

Analisi biomolecolari sono in costante sviluppo che usano quantità sempre più piccoli di materiale, spesso precludendo l&#39;utilizzo di tradizionali strumenti basati cuvetta per la quantificazione degli acidi nucleici per coloro che possono eseguire quantificazione microvolumi. Il NanoDrop microvolumi Sistema di ritenzione del campione (Thermo Prodotti NanoDrop Scientifica) le funzioni unendo tecnologia delle fibre ottiche e le proprietà naturali della tensione superficiale di catturare e trattenere piccole quantità di campione indipendente di apparecchi di contenimento tradizionali come cuvette o capillari. Inoltre, il sistema impiega lunghezze di percorso più breve, che si traducono in una vasta gamma di misure di concentrazione di acidi nucleici, essenzialmente eliminando la necessità di eseguire diluizioni. Riduzione del volume di campione per l&#39;analisi spettroscopica facilita anche l&#39;inserimento di ulteriori passi di controllo di qualità in molti flussi di lavoro molecolare, aumentando l&#39;efficienza e, in definitiva portando ad una maggiore fiducia nei risultati a valle. La necessità di alta sensibilità di analisi a fluorescenza di massa limitata è anche emerso con i recenti progressi sperimentali. Utilizzando la stessa tecnologia di ritenzione del campione microvolumi, misure fluorescenti possono essere eseguite con 2 ml di materiale, permettendo fluorescente requisiti volume di saggi di essere significativamente ridotta. Microreactions tale di 10 L o meno sono ora possibili utilizzando un fluorospectrometer dedicato microvolumi. Due microvolumi acidi nucleici protocolli di quantificazione sarà dimostrato che l&#39;uso integrato di sistemi di ritenzione del campione come alternative alle tradizionali pratiche cuvetta protocolli basati su. In primo luogo, un metodo diretto A260 assorbanza con uno spettrofotometro microvolumi è descritto. Questa è seguita da una dimostrazione di un metodo basato fluorescenza, che consente le reazioni fluorescenza ridotto volume con un fluorospectrometer microvolumi. Queste nuove tecniche permettono la valutazione delle concentrazioni degli acidi nucleici che vanno da 1 pg / mL a 15.000 ng / mL con un consumo minimo di campione.

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NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

L&#39;uso di sistemi NanoDrop microvolumi come alternativa pratica ed efficace ai tradizionali metodologia di quantificazione acidi nucleici è descritto attraverso la dimostrazione di due protocolli di acido nucleico quantificazione microvolumi.

NanoDrop microvolumi quantificazione degli acidi nucleici

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Video: NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

Immunoprecipitazione DNA metilato

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Ricerca

Biologia

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine ​​con il NanoDrop 2000c Spettrofotometro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Di circolazione MicroRNA Quantificazione Utilizzando DNA-binding Dye Chimica e di gocce Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Bioingegneria

<meta charset="utf8"></head><body>Nanomacchine DNAzyme di precisione per l'analisi discriminativa di RNA e DNA

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Progressi nei nanosensori del DNA - Affrontare le sfide della sensibilità e della selettività nel rilevamento molecolare

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

DNAzyme 10-23 - Nanomacchine basate sul riconoscimento degli acidi nucleici

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

Biochimica

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Determinazione concentrazione di acidi nucleici e proteine ​​Utilizzando il Micro-volume Bio-spec Spettrofotometro Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Legatura altamente efficiente delle piccole molecole di RNA per microRNA Quantificazione mediante sequenziamento High-Throughput

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Base-Probe Real-time PCR Approcci per la misurazione quantitativa dei microRNA

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Semplice Lettura di massa di Digital acido nucleico quantificazione Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

NanoDrop microvolumi quantificazione degli acidi nucleici

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