Richard W. Beringer y David L. Ash, científicos de aplicaciones, productos de Thermo NanoDrop Ciencia, para la asistencia técnica y la filmación.

1. Microvolumen cuantificación de ácidos nucleicos El uso de un espectrofotómetro NanoDrop 2000c <ol><li> Para comenzar, limpiar las superficies ópticas superiores e inferiores del sistema de espectrofotómetro microvolumen retención de muestras con pipeta 2 a 3 l de agua desionizada limpia en la superficie inferior óptica. </li><li> Cierre el brazo de palanca, asegurando que el pedestal superior entra en contacto con el agua destilada. Levante el brazo de palanca y limpie tanto las superficies ópticas con un paño limpio, seco y sin pelusa, un paño de laboratorio. </li><li> Abra el software NanoDrop y seleccione la aplicación de ácidos nucleicos. Utilice un pequeño volumen, pipeta calibrada para realizar una medición en blanco mediante la supresión de un l de tampón sobre la superficie óptica inferior. Baje el brazo de palanca y seleccione &quot;En blanco&quot; en la aplicación de ácido nucleico. </li><li> Una vez que la medición en blanco es completo, limpie las superficies ópticas con un paño limpio, seco y sin pelusa, un paño de laboratorio. </li><li> Elija la constante apropiada para la muestra que se va a medir. <table border="1"><tbody><tr><td> Tipo de muestra </td><td> Seleccione la opción </td><td> Constante que se utiliza para calcular la concentración </td></tr><tr><td> dsDNA </td><td> ADN-50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNA </td><td> ADN-33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> ARN </td><td> ARN-40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Oligo </td><td> Costumbre </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Típicos rangos de concentración de ácido nucleico para dirigir A280 medidas de absorbancia con un espectrofotómetro NanoDrop microvolumen, una cubeta tradicionales basados ​​en espectrofotómetro utilizado con una cubeta TrayCell microcelular, y un fluorospectrometer NanoDrop microvolumen junto con el ensayo PicoGreen. </li><li> Prescindir de una L de muestra de ácido nucleico en el pedestal óptica inferior y estrecha del brazo de palanca. Debido a que la medida es independiente de volumen, la muestra sólo tiene que cerrar la brecha entre las dos superficies ópticas para la medición a realizar. </li><li> Seleccione &quot;medida&quot; en el software de aplicación. El software calcula automáticamente el ácido nucleico coeficientes de concentración y la pureza. Después de la medición de la muestra, revisar el espectro de salida. </li><li> El software calcula automáticamente el ácido nucleico coeficientes de concentración y la pureza. Después de la medición de la muestra, revisar la imagen espectral para evaluar la calidad de la muestra. </li><li> Un ejemplo típico de ácidos nucleicos tendrá un perfil muy característico. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Un ejemplo típico de ácidos nucleicos que tienen un perfil muy característico. </li><li> Las fuentes comunes de contaminantes asociados a las técnicas específicas de aislamiento de ácidos nucleicos incluyen extracción con fenol / Trizol y la columna. En el caso de extracción con fenol / Trizol, contaminación de los reactivos residuales puede ser indicado por espectros anormales entre 220-240 nm, así como por los cambios en la región de 260 nm a 280. Por el contrario, guanidina residual de la extracción de la columna puede contribuir a un pico cercano a 230 nm y un cambio en el canal de 230 nm a 240 nm aproximadamente. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Los cambios en los picos y valles de las muestras B y C, en comparación con la muestra A ilustrar cómo los contaminantes pueden afectar a los espectros de las muestras de ácido nucleico. </li><li> Para evaluar con precisión la calidad de la muestra, 260/280 o 260/230 ratios deben ser analizados en combinación con una calidad espectral global. Pura ácidos nucleicos generalmente producen una proporción 260/280 de ~ 1,8 y un ratio de 260/280 de ~ 2,0 para el ADN y ARN, respectivamente. Esta relación depende del pH y fuerza iónica del buffer usado para hacer que el blanco y las mediciones de la muestra. Las soluciones ácidas se subestima la relación de 0.2-0.3, mientras que una solución básica sobre-representar la proporción de 0,2-0,3. Relaciones de pureza significativamente diferentes pueden indicar la presencia de la proteína, los contaminantes fenol u otros que absorben fuertemente en o cerca de 280 nm. El índice de pureza del 260/230 es una segunda medida de la pureza del ADN con los valores de un ácido &quot;puro&quot; nucleicos comúnmente en el rango de 1.8-2.2. Relaciones de pureza que son significativamente inferiores a los valores esperados pueden indicar la técnica de aislamiento utilizada puede requerir una mayor optimización. </li><li> Espectrofotómetros NanoDrop también puede ser utilizado para cuantificar las proteínas utilizando absorbancia directa o mediante ensayos colorimétricos proteínas. Para asegurar la formación adecuada y la reproducibilidad de columna, 2-l muestras se recomienda para las muestras de proteínas. Consulte el siguiente video de Jove: Proteína microvolumen determinación de la concentración con el espectrofotómetro NanoDrop <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610</a> </li></ol><ol><li> Para demostrar la alta sensibilidad microvolumen cuantificación de ácidos nucleicos utilizando la NanoDrop 3300, un equipo de PicoGreen fluorescencia se utiliza. Para comenzar, se equilibran las normas kit y todas las muestras de ácidos nucleicos a temperatura ambiente. Muestras fluorescentes son sensibles a la luz y se debe mantener en ámbar o tubos de aluminio envuelto. </li><li> Prepare el buffer TE 1x suficiente para todos los estándares y las muestras a medir, así como para la solución PicoGreen de trabajo que serán necesarios. Prepare el buffer de 1xTE diluyendo el siempre 20x buffer TE con agua libre de nucleasa por el protocolo del fabricante. Volúmenes de reacción puede variar desde 200 l hasta un mínimo de 10 ul. En este ejemplo, 10 volúmenes de reacción de l estará preparado. </li><li> Prepare diluciones seriadas normas dsDNA a 2 veces la concentración final deseada en el libre de nucleasa frascos o tubos. La transferencia de 5 L de cada uno de los estándares de ADN de doble cadena diluye en un individuo marcado libre de nucleasa ámbar o forrada con papel aluminio tubo. </li><li> Alícuota de 5 l de cada muestra de ADN de doble cadena de interés en un etiquetado apropiado libre de nucleasa ámbar o forrada con papel aluminio tubos. </li><li> Preparar la solución PicoGreen trabajo de acuerdo con el protocolo del fabricante. La transferencia de un volumen igual de la solución PicoGreen de trabajo a cada tubo conteniendo un patrón o la muestra de interés (5 l en este ejemplo). </li><li> Combinar volúmenes iguales de tampón TE 1x y la solución PicoGreen de trabajo para preparar el control negativo, que sirve como solución de referencia. </li><li> Mezclar el contenido de cada tubo de reacción a fondo por pipeteo suave e incubar las reacciones a temperatura ambiente durante 5 minutos. Todos los estándares y las muestras deben ser equilibrados a la misma temperatura antes de la medición como señal de fluorescencia se ve afectada por la temperatura. </li><li> Para preparar el instrumento y realizar las mediciones, primero limpiar las superficies superior e inferior del sistema de retención de la muestra. Pipeta de 2 a 3 l de agua destilada sobre la superficie óptica inferior, cerca a continuación, abra el brazo de palanca, y borra los pedestales superior e inferior con un paño limpio y sin pelusa, limpie de laboratorio. Asegúrese de que las superficies estén libres de pelusa antes de proceder como pelusas pueden presentar fluorescencia en presencia de una fuente de excitación y pueden interferir con la medición. </li><li> Abra el software del equipo, seleccione la opción &quot;Ácidos nucleicos&quot; la aplicación y seleccionar la opción &quot;PicoGreen-DNA de doble cadena&quot; opción. </li><li> En blanco del instrumento, añadir 2 l de TE 1x al pedestal inferior, cerca del brazo, y seleccione &quot;En blanco&quot; en el campo de instrumentos de software. Una vez que se completa en blanco, mancha de la solución en blanco en ambas superficies del sistema de retención de la muestra. </li><li> Mezclar la solución de referencia por pipeteo suave. Utilizando puntas de baja retención, pipeta 2 l en el pedestal inferior y estrecha del brazo. </li><li> Seleccione &quot;referencia&quot; en el tipo de medida y seleccionar las unidades deseadas. Haga clic en &quot;medida&quot; para iniciar el ciclo de medición. </li><li> Cuando el ciclo de medición, abra el brazo y el fondo mancha las superficies de retención de muestra del sistema. Llegar a medir hasta cinco réplicas de la referencia, con una alícuota de cada réplica. </li><li> Repita el proceso para las normas adicionales para construir una curva estándar. Hasta siete normas pueden ser utilizadas. El software está diseñado para almacenar un máximo de cinco repeticiones para cada estándar. Réplicas de las normas se promedian para generar una curva estándar a partir de la cual las concentraciones de la muestra se determina automáticamente. </li><li> Una vez que la curva de calibración se ha completado, seleccione la opción &quot;muestras&quot;, ingrese la información de la muestra correspondiente ID y medir cada muestra desconocida. </li></ol>

<ol>
	<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity.">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li><li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Quantification+of+Nucleic+Acids:+LabelGuard+enables+photometric+quantification+of+submicroliter+samples+using+a+standard+photometer.">Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer.</a> Implen Applications Note. , (2006).</li><li>Jr, I. n. g. l. e., D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spectrochemical analysis. , XV-590 (1988).</li><li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA.">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li></ol>

Philippe Desjardins y Conklin Debra son empleados por los productos Thermo Scientific NanoDrop, Inc, que produce los instrumentos utilizados en este artículo.

Los protocolos de cuantificación que aquí se presenta se basa en la más aceptada sistemas microvolumen. Estos sistemas ofrecen alternativas prácticas para la tradicional metodología de cuantificación de ácidos nucleicos, que se basan en el volumen de la muestra mayor y el uso de aparatos de contención. NanoDrop microvolumen tecnología emplea un sistema de retención de la muestra que se basa en las propiedades de tensión superficial de la muestra que se está midiendo para formar una columna de líquido. Es esencial que la muestra se pone en contacto con las superficies superior e inferior de medición óptico para la formación de la columna correcta. Si en algún momento los resultados de las mediciones parecen inexactos o no reproducible, lo más probable es el resultado de la heterogeneidad de la muestra o la rotura de columna de líquido. Detergentes y el alcohol isopropílico no se recomiendan los agentes de limpieza, ya que pueden sin condiciones de las superficies de medición pedestal. Un pedestal incondicionada se produce cuando las propiedades de superficie hidrofóbica del pedestal se han comprometido, resultando en un aplanamiento de la gota de la muestra. Pedestales acondicionado puede conducir a la rotura de la columna de líquido durante la medición. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="Figura 3" /> La superficie de la figura 3. Incondicionado se caracteriza por un aplanamiento de una gota de agua. Superficies Uncondtioned pedestal pueden ser reacondicionadas con pedestal compuesto NanoDrop reacondicionamiento (PR-1, Thermo Scientific Productos NanoDrop). Una fina capa de compuesto de reacondicionamiento se aplica a las superficies superior e inferior del pedestal, se deja secar durante aproximadamente 30 segundos, y luego contagió con un paño limpio, seco y sin pelusa, un paño de laboratorio. Un estado con éxito reacondicionados se caracteriza por una gota de agua abalorios cuando se aplica a la superficie inferior del pedestal. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Una superficie reacondicionados se caracteriza por una partida de una gota de agua. Sistemas de cuantificación microvolumen reducir en gran medida el consumo de la muestra y aumentar considerablemente el rango de concentración en comparación con los sistemas de cuantificación más tradicionales. Aunque la cuantificación microvolumen a menudo ha convertido en una tecnología que permite a circunstancias relacionadas con la masa de células limitados, tales como biopsias con aguja y microdisección láser de captura, la eficiencia y la facilidad de uso de esta metodología ha hecho que sea ampliamente aceptada alternativa a los métodos de cuantificación de ácidos nucleicos, incluso cuando la muestra es abundante.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

nanodrop microvolume quantitation of nucleic acids

Ensayos biomoleculares se están desarrollando continuamente que el uso de cantidades cada vez más pequeños de material, que a menudo impide el uso de cubetas convencionales basados ​​en instrumentos para la cuantificación de ácidos nucleicos para aquellos que pueden realizar la cuantificación microvolumen. La muestra NanoDrop microvolumen sistema de retención (Thermo Científico Productos NanoDrop) funciona mediante la combinación de la tecnología de fibra óptica y las propiedades naturales de la tensión superficial para captar y retener pequeñas cantidades de muestra independiente de los aparatos de contención tradicionales, tales como cubetas o capilares. Además, el sistema cuenta con más cortos recorridos, que se traducen en un amplio rango de mediciones de concentración de ácido nucleico, básicamente eliminando la necesidad de realizar diluciones. Reducir el volumen de muestra necesario para el análisis espectroscópico también facilita la inclusión de nuevas medidas de control de calidad a lo largo de muchos flujos de trabajo molecular, incrementando la eficiencia y en última instancia conduce a una mayor confianza en los resultados posteriores. La necesidad de un análisis de alta sensibilidad fluorescentes de masa limitada también ha surgido con los últimos avances experimentales. Utilizando la tecnología de retención que microvolumen muestra, las mediciones de fluorescencia se puede realizar con 2 l de material, lo que permite fluorescentes requisitos de volumen de ensayos se redujo significativamente. Microreactions como de 10 l o menos, ahora es posible con una dedicada fluorospectrometer microvolumen. Dos nucleicos microvolumen protocolos de cuantificación de ácidos se demostró que el uso integrado de sistemas de retención de la muestra como una alternativa práctica a los tradicionales protocolos basados ​​en la cubeta. En primer lugar, un método directo A260 absorbancia con un espectrofotómetro microvolumen se describe. Esto es seguido por una demostración de un método de fluorescencia basada en que permite reducir volumen de las reacciones de fluorescencia con un fluorospectrometer microvolumen. Estas nuevas técnicas permiten la evaluación de las concentraciones de ácido nucleico que van de 1 pg / mL a 15.000 ng / l con un consumo mínimo de la muestra.

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NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

El uso de sistemas de NanoDrop microvolumen como alternativa práctica y eficaz a la tradicional metodología de cuantificación de ácidos nucleicos se describe a través de la demostración de dos protocolos de ácido nucleico microvolumen cuantificación.

NanoDrop microvolumen cuantificación de ácidos nucleicos

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Video: NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

Inmunoprecipitación de ADN metilado

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Investigación

Biología

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Concentración de proteínas microvolumen Determinación mediante el NanoDrop 2000c Espectrofotómetro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Que circula MicroARN Cuantificación Usando ADN vinculante tinte Química y gotita de PCR digital

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Bioingeniería

<meta charset="utf8"></head><body>Nanomáquinas de precisión DNAzyme para el análisis discriminativo de ARN y ADN

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Avances en nanosensores de ADN: abordando los desafíos de sensibilidad y selectividad en la detección molecular

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas basadas en el reconocimiento de ácidos nucleicos

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

Bioquímica

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Determinación de la concentración de ácidos nucleicos y proteínas utilizando el micro-volumen Bio-spec Espectrofotómetro Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Ligadura Altamente Eficiente de los Pequeños ARN moléculas de microARN cuantificación mediante secuenciación de alto rendimiento

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

PCR en tiempo real basada en sondeos Enfoques para la medición cuantitativa de microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

NanoDrop microvolumen cuantificación de ácidos nucleicos

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