Richard W. Beringer e David L. Ash, Aplicações Os cientistas, os produtos NanoDrop Thermo Scientific, de assistência técnica e filmagens.

1. Microvolume Quantificação de Ácido Nucleico Usando um NanoDrop 2000c Espectrofotômetro <ol><li> Para começar, limpar as superfícies superior e inferior óptica do sistema de retenção microvolume espectrofotômetro amostra pipetando 2-3 mL de água deionizada para limpar a superfície inferior óptica. </li><li> Fechar o braço de alavanca, garantindo que o pedestal superior entra em contato com a água deionizada. Levante o braço de alavanca e limpe ambas as superfícies ópticas com um pano limpo, sem fiapos, limpe a seco laboratório. </li><li> Abra o software NanoDrop e selecione o aplicativo de ácido nucléico. Use um volume pequeno, pipetador calibrado para realizar uma medição em branco, dispensa 1 mL de tampão para a superfície inferior óptica. Abaixe o braço de alavanca e selecione &quot;branco&quot; na aplicação de ácido nucléico. </li><li> Uma vez que a medição em branco é completa, limpa ambas as superfícies ópticas com um pano limpo, sem fiapos, limpe a seco laboratório. </li><li> Escolha a constante apropriada para o exemplo que está a ser medido. <table border="1"><tbody><tr><td> Tipo de amostra </td><td> Selecione Opção </td><td> Constante Utilizado para Calcular Concentração </td></tr><tr><td> dsDNA </td><td> DNA-50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNA </td><td> DNA-33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> RNA-40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Oligo </td><td> Personalizado </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Típicos varia de ácido nucléico de concentração para as medidas de absorbância direta A280 usando um NanoDrop microvolume espectrofotômetro, um espectrofotômetro cuvete tradicional baseado usado com uma microcélula TrayCell cuvete, e um fluorospectrometer NanoDrop microvolume em conjunto com o ensaio PicoGreen. </li><li> Dispense 1 mL de amostra de ácido nucléico para o pedestal inferior ópticas e fechar o braço de alavanca. Porque a medida é de volume independente, a amostra só precisa preencher a lacuna entre as duas superfícies ópticas para uma medição a ser feita. </li><li> Selecione &quot;Measure&quot; no software de aplicação. O software irá calcular automaticamente as taxas de ácido nucléico concentração e pureza. Após medição da amostra, analisar a saída espectral. </li><li> O software irá calcular automaticamente as taxas de ácido nucléico concentração e pureza. Após medição da amostra, rever a imagem espectral para avaliar a qualidade da amostra. </li><li> Uma amostra de ácido nucleico típico terá um perfil muito característico. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Uma amostra de ácido nucleico típico terá um perfil muito característico. </li><li> As fontes comuns de contaminantes específicos associados com técnicas de isolamento de ácido nucléico incluem a extração de fenol / Trizol e coluna. No caso da extração de fenol / Trizol, a contaminação do reagente residual pode ser indicado por espectros anormal entre 220-240 nm, bem como por mudanças na região 260-280 nm. Por outro lado, guanidina residual da extração de coluna podem contribuir para um pico próximo 230 nm e uma mudança no cocho de 230 nm a cerca de 240 nm. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. As mudanças nos picos e depressões das amostras B e C, em comparação com amostra A ilustrar como contaminantes podem afetar os espectros de amostras de ácidos nucléicos. </li><li> Para avaliar com precisão a qualidade da amostra, 260/280 ou 260/230 índices deveriam ser analisados ​​em combinação com qualidade espectral global. Pure ácidos nucléicos normalmente produzem uma relação de 260 / 280 ~ 1,8 e uma relação de 260/280 de ~ 2.0 para DNA e RNA, respectivamente. Esta relação é dependente do pH e força iônica do buffer usado para fazer o branco e as medições da amostra. Soluções ácidas será sub-representação da relação por 0,2-0,3, enquanto uma solução básica sobre-representam a razão por 0,2-0,3. Relações pureza significativamente diferentes podem indicar a presença de proteínas, fenol ou outros contaminantes que absorvem fortemente em ou perto de 280 nm. O grau de pureza de 260/230 é uma segunda medida de pureza do DNA com os valores de um ácido nucléico &quot;puro&quot; em geral na faixa de 1,8-2,2. Relações pureza que são significativamente inferiores aos valores esperados podem indicar a técnica de isolamento utilizado pode exigir maior otimização. </li><li> Espectrofotômetros NanoDrop também podem ser usados ​​para quantificar proteínas usando absorbância direta ou por ensaios de proteína colorimétrico. Para garantir a formação adequada coluna e reprodutibilidade, 2 mL amostras são aconselhados para as amostras de proteína. Consulte o vídeo JOVE seguinte: Microvolume determinação da concentração de proteínas usando o espectrofotômetro NanoDrop <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610</a> </li></ol><ol><li> Para demonstrar a alta sensibilidade microvolume quantificação de ácidos nucléicos usando o 3300 NanoDrop, um kit PicoGreen fluorescência é usada. Para começar, equilibrar os padrões do kit e todas as amostras de ácido nucléico à temperatura ambiente. Amostras fluorescentes são sensíveis à luz e deve ser mantido em âmbar ou envolto tubos de alumínio. </li><li> Prepare o suficiente 1x tampão TE para todos os padrões e amostras a serem medidos, bem como para a solução PicoGreen de trabalho que serão necessários. Prepare tampão 1xTE diluindo fornecidas 20x tampão TE com água livre de nuclease por protocolo do fabricante. Volumes de reação pode variar de 200 mL para menos de 10 ul. Neste exemplo, 10 volumes de reação mL será preparado. </li><li> Prepare série padrão diluídas dsDNA em 2X a concentração final desejada em nuclease livre de frascos ou tubos. Transferir 5 mL de cada um dos padrões dsDNA diluído em um indivíduo rotulado nuclease livre de âmbar ou cobertos de folha de tubo. </li><li> ML alíquota 5 de cada amostra de interesse em dsDNA devidamente rotulados âmbar nuclease-free ou folhas cobertas de tubos. </li><li> Prepare PicoGreen solução de trabalho de acordo com o protocolo do fabricante. Transferência de um volume igual de solução PicoGreen trabalhando a cada tubo contendo um padrão ou amostra de interesse (5 mL, neste exemplo). </li><li> Combine volumes iguais de 1x tampão TE e solução PicoGreen de trabalho para preparar o controle negativo, que serve como uma solução de referência. </li><li> Misture o conteúdo de cada tubo de reacção completamente pipetando suave e incubar as reações à temperatura ambiente por 5 minutos. Todos os padrões e as amostras devem ser equilibrados à mesma temperatura antes da medição como sinal de fluorescência é afetado pela temperatura. </li><li> Para preparar o instrumento e efectuar medições, primeiro limpe as superfícies inferior e superior do sistema de retenção de amostra. Pipete 2-3 de água deionizada para a menor superfície óptica, feche em seguida, abra o braço de alavanca, e secar os pedestais superior e inferior com um pano limpo, sem fiapos, limpe laboratório. Assegurar as superfícies são livres de fiapos antes de prosseguir como fiapos podem apresentar fluorescência na presença de uma fonte de excitação e pode interferir com a medição. </li><li> Abra o software do aparelho, selecione a opção &quot;ácidos nucléicos&quot;, aplicação e selecione a opção &quot;PicoGreen-dsDNA&quot; opção. </li><li> Para o instrumento em branco, adicionar 2 mL de TE 1x ao menor pedestal, perto do braço, e selecione &quot;Blank&quot; no campo de software instrumento. Uma vez em branco é completa, limpe a solução em branco de ambas as superfícies do sistema de retenção de amostra. </li><li> Misturar a solução de referência por pipetagem suave. Usando dicas de retenção baixa, pipeta mL 2 sobre o pedestal inferior e fechar o braço. </li><li> Selecione &quot;referência&quot; no tipo de medição, e selecione as unidades desejadas. Clique em &quot;Measure&quot; para iniciar o ciclo de medição. </li><li> Quando o ciclo de medição estiver completo, abra o braço e completamente fora da amostra blot superfícies do sistema de retenção. Medir até cinco repetições de referência, utilizando uma nova porção para cada repetição. </li><li> Repita o processo para as normas complementares para construir uma curva padrão. Até sete padrões podem ser usados. O software é projetado para armazenar até cinco repetições para cada padrão. Replica das normas são em média para gerar uma curva padrão a partir do qual as concentrações da amostra são determinados automaticamente. </li><li> Uma vez que a curva padrão é completo, selecione a opção &quot;Samples&quot; guia, insira as informações ID respectivos amostra e medir cada amostra desconhecida. </li></ol>

<ol>
	<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity.">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li><li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Quantification+of+Nucleic+Acids:+LabelGuard+enables+photometric+quantification+of+submicroliter+samples+using+a+standard+photometer.">Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer.</a> Implen Applications Note. , (2006).</li><li>Jr, I. n. g. l. e., D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spectrochemical analysis. , XV-590 (1988).</li><li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA.">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li></ol>

Philippe Desjardins e Debra Conklin são empregados por produtos Thermo Scientific NanoDrop, Inc, que produz os instrumentos utilizados neste artigo.

Os protocolos de quantificação aqui apresentados são baseados no mais aceita microvolume sistemas. Tais sistemas fornecem alternativas práticas para a metodologia de quantificação de ácidos nucleicos tradicionais, que contam com maiores volumes de amostra e do uso de aparelhos de contenção. NanoDrop microvolume tecnologia emprega um sistema de retenção de amostra que se baseia nas propriedades de tensão de superfície da amostra que está sendo medido para formar uma coluna de líquido. É essencial que a amostra entra em contato com a superfície superior e inferior de medição óptica para a formação de coluna adequada. Se em algum momento os resultados da medição não parece ser preciso ou não reprodutíveis, o mais provável é o resultado da heterogeneidade da amostra ou quebra de coluna líquida. Detergentes e álcool isopropílico não são recomendados agentes de limpeza, pois podem descondicionar as superfícies de medição pedestal. Um pedestal incondicionada ocorre quando as propriedades de superfície hidrofóbica do pedestal ter sido comprometida, resultando em um achatamento da gota de amostra. Pedestais incondicionado pode levar à quebra da coluna de líquido durante a medição. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Incondicionado superfície é caracterizada por um achatamento de uma gota de água. Superfícies pedestal Uncondtioned podem ser recondicionados usando compostos Pedestal NanoDrop Recondicionamento (PR-1, os produtos Thermo Scientific NanoDrop). Uma fina camada de composto de recondicionamento é aplicada às superfícies pedestal superior e inferior, deixa-se secar para ~ 30 segundos, em seguida, esfregou fora de usar um pano limpo, sem fiapos, limpe a seco laboratório. Um estado com sucesso recondicionados é caracterizada por uma gota de água beading acima quando aplicados à superfície pedestal inferior. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Recondicionados Uma superfície é caracterizada por uma beading de uma gota de água. Sistemas de quantificação Microvolume reduzir significativamente o consumo de amostra e aumentar drasticamente a faixa de concentração, quando comparado aos sistemas de quantificação mais tradicionais. Embora a quantificação microvolume tem freqüentemente se tornado uma tecnologia que permite em circunstâncias envolvendo massa celular limitados, tais como biópsias de agulhas e laser de captura de microdissecção, a eficiência ea facilidade de utilização desta metodologia tornou um alternativas amplamente aceitas para os métodos tradicionais de quantificação de ácidos nucleicos mesmo quando a amostra é abundante.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

nanodrop microvolume quantitation of nucleic acids

Ensaios de biomolecular estão continuamente a ser desenvolvido, que utiliza quantidades progressivamente menores de material, muitas vezes impossibilitando o uso de cubeta convencional baseada em instrumentos para quantificação de ácidos nucleicos para aqueles que podem realizar quantificação microvolume. O NanoDrop microvolume sistema de retenção de amostra (Produtos NanoDrop Thermo Scientific) funções através da combinação de tecnologia de fibra óptica e propriedades tensão natural da superfície para captar e reter pequenas quantidades de amostra independente de aparelhos de contenção tradicionais, como tinas ou capilares. Além disso, o sistema utiliza comprimentos de caminho mais curto, que resultam em uma ampla gama de medições da concentração do ácido nucléico, essencialmente, eliminando a necessidade de realizar diluições. Reduzindo o volume de amostra necessário para análise espectroscópica também facilita a inclusão de etapas adicionais de controle de qualidade em todo muitos fluxos de trabalho molecular, aumentando a eficiência e, finalmente, levando a uma maior confiança nos resultados a jusante. A necessidade de análise de alta sensibilidade fluorescentes de massa limitada também surgiu com os recentes avanços experimentais. Usando a mesma tecnologia de retenção de amostra microvolume, medições fluorescentes pode ser realizada com 2 mL de material, permitindo fluorescentes requisitos ensaios volume a ser reduzido significativamente. Microreactions tais de 10 mL ou menos são agora possíveis através de um fluorospectrometer microvolume dedicados. Dois protocolos microvolume quantificação de ácidos nucleicos será demonstrado que o uso de sistemas integrados de retenção de amostra como alternativas práticas para cuvete tradicionais baseados em protocolos. Primeiro, um método de absorção direta A260 usando um espectrofotômetro microvolume é descrito. Isto é seguido por uma demonstração de um método baseado em fluorescência que permite redução de volume reações de fluorescência com uma fluorospectrometer microvolume. Estas novas técnicas permitem a avaliação das concentrações de ácido nucléico que variam de 1 pg / mL a 15.000 ng / mL com o consumo mínimo de amostra.

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NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

O uso de sistemas NanoDrop microvolume como alternativas práticas e eficientes para a metodologia de quantificação de ácidos nucleicos tradicional é descrito através da demonstração de dois protocolos microvolume quantificação de ácidos nucleicos.

NanoDrop quantificação Microvolume de Ácidos Nucléicos

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Vídeo: NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

Imunoprecipitação DNA metilado

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Biologia

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Microvolume determinação da concentração de proteína utilizando o NanoDrop 2000c Espectrofotômetro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Circulando MicroRNA Quantificação Usando DNA de ligação Dye Química e Gota Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Bioengenharia

<meta charset="utf8"></head><body>Nanomáquinas DNAzyme de precisão para análise discriminativa de RNA e DNA

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Avanços em nanossensores de DNA - Abordando os desafios de sensibilidade e seletividade na detecção molecular

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas baseadas para reconhecimento de ácidos nucleicos

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

Bioquímica

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Determinação de concentração de ácidos nucléicos e proteínas Usando o Micro-volume Bio-spec Espectrofotômetro Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Ligadura altamente eficiente de pequeno RNA moléculas microRNA para quantificação por sequenciamento de alto rendimento

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Baseado-Probe-PCR em tempo real Abordagens para a medição quantitativa de microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Simples massa de Leitura Digital de Ácido Nucleico Quantificação Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

NanoDrop quantificação Microvolume de Ácidos Nucléicos

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