ריצ&#39;רד וו Beringer דוד L. אש, יישומים מדענים, תרמו מוצרים מדעי NanoDrop, סיוע טכני הצילומים.

<html> 1. Microvolume כימות חומצות גרעין שימוש 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל, לנקות את המשטחים אופטי העליון והתחתון של מערכת מדגם ספקטרופוטומטר microvolume השמירה על ידי pipetting 2-3 μL deionized מים נקיים על פני השטח אופטי נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את זרוע המנוף, על מנת להבטיח כי הדום העליון בא במגע עם המים deionized. הרם את זרוע המנוף לנגב הן משטחים אופטיים עם ונטולת מוך נקי ויבש מעבדה לנגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת NanoDrop ובחר ביישום חומצות גרעין. השתמש נפח קטן, pipettor מכויל לבצע מדידה ריק על ידי מחלק 1 μL של המאגר על גבי משטח אופטי נמוך. מנמיכים את זרוע המנוף בחר &quot;ריק&quot; ביישום חומצות גרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המדידה ריק תושלם, גם משטחים נקיים אופטי עם ונטולת מוך נקי ויבש מעבדה לנגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את קבוע מתאים המדגם זה כדי להימדד. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לדוגמה סוג </td><td> בחר אפשרות </td><td> קבועים המשמשים לחישוב ריכוז </td></tr><tr><td> dsDNA </td><td> DNA-50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNA </td><td> DNA-33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> RNA-40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> אוליגו </td><td> מנהג </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. אופיינית ריכוז חומצת גרעין טווחי עבור A280 מדידות ישירות באמצעות ספיגת NanoDrop microvolume ספקטרופוטומטר, ספקטרופוטומטר קובט מסורתיים מבוססי המשמשים עם microcell TrayCell קובט, וכן fluorospectrometer NanoDrop microvolume בשיתוף עם assay PicoGreen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 1 μL המדגם חומצות גרעין על הכן אופטי נמוך ולסגור את זרוע המנוף. כי המדידה היא בנפח עצמאית, המדגם צריך רק כדי לגשר על הפער בין שני משטחים אופטיים עבור המדידה להתבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;מדוד&quot; תוכנת היישום. התוכנה יחשב באופן אוטומטי את גרעין ריכוז טוהר יחס חומצה. בעקבות מדידה מדגם, לסקור את הפלט רפאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התוכנה יחשב באופן אוטומטי את גרעין ריכוז טוהר יחס חומצה. בעקבות מדידה מדגם, לסקור את התמונה ספקטרלי כדי להעריך את איכות המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמה טיפוסית חומצות גרעין יהיה פרופיל אופייני מאוד. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. מדגם טיפוסי חומצות גרעין יהיה פרופיל אופייני מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקורות נפוצים של מזהמים הקשורים ספציפית טכניקות בידוד גרעין חומצה כוללים להפקת פנול / Trizol ועמודה. במקרה של מיצוי פנול / Trizol, זיהום מגיב השיורי עשוי להיות מסומן על ידי ספקטרום נורמלי בין 220-240 ננומטר, כמו גם על ידי משמרות באזור 260-280 ננומטר. לעומת זאת, guanidine שיורית מתוך מיצוי טור עשויים לתרום שיא ליד 230 ננומטר שינוי השוקת מ 230 ננומטר של כ 240 ננומטר. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. המשמרות את העליות והמורדות של דגימות B ו-C לעומת מדגם להמחיש כיצד מזהמים יכולים להשפיע על ספקטרום של דגימות חומצות גרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך נכונה איכות המדגם, 260/280 או 260/230 יחס צריך להיות מנותח בשילוב עם איכות רפאים הכולל. חומצות גרעין טהור בדרך כלל תשואה יחס של 260/280 ~ 1.8 ו 260/280 יחס של 2.0 ~ עבור DNA ו-RNA, בהתאמה. יחס זה תלוי pH וחוזק היוני של המאגר המשמש לייצור הריק ומדידות במדגם. פתרונות חומציים יהיה מתחת מייצגים את היחס של 0.2-0.3, ואילו הפתרון הבסיסי יהיה מעל מייצגים את היחס של 0.2-0.3. יחסי טוהר שונה באופן משמעותי עלול להעיד על נוכחות של מזהמים חלבון פנול או אחרים לספוג חזק ליד או 280 ננומטר. יחס 260/230 טוהר הוא מדד השנייה של טוהר DNA עם ערכי חומצת &quot;טהור&quot; גרעין בדרך כלל בטווח של 1.8-2.2. יחסי טוהר כי נמוכים משמעותית את ערכי צפוי עשוי להצביע על הטכניקה בידוד בשימוש עשויים לדרוש אופטימיזציה נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הספקטרופוטומטרים NanoDrop יכול לשמש גם לכמת חלבונים באמצעות ספיגת ישיר או באמצעות מבחני חלבון colorimetric. כדי להבטיח בטור reproducibility נכונה, 2-μl דגימות מומלץ עבור דגימות חלבון. עיין וידאו יופיטר הבאים: קביעת ריכוז חלבון Microvolume באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610</a> </li></ol>s = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. רגישות גבוהה Microvolume quantitation חומצות גרעין שימוש Fluorospectrometer NanoDrop 3300 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפגין רגישות גבוהה quantitation microvolume חומצות גרעין באמצעות NanoDrop 3300, ערכה הקרינה PicoGreen משמש. כדי להתחיל, לאזן את הסטנדרטים ערכת וכל דגימות חומצות גרעין לטמפרטורת החדר. דגימות פלורסנט אור רגיש יש לשמור ענבר או צינורות אלומיניום עטופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1x מספיק חיץ TE לכל הסטנדרטים דגימות כדי להימדד כמו גם לפתרון PicoGreen לעבוד כי יהיה צורך. הכן חיץ 1xTE על ידי דילול בתנאי 20x TE חיץ עם מים nuclease חופשי לכל פרוטוקול של היצרן. כרכים תגובת יכול לנוע בין 200 ל μL ul קטנה כמו 10. בדוגמה זו, 10 כרכים התגובה μL יהיה מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סדרתי סטנדרטים בדילול dsDNA בריכוז 2x הרצוי הסופי nuclease ללא צלוחיות או צינורות. העברת 5 μL של כל אחד מן הסטנדרטים dsDNA בדילול אל הפרט שכותרתו nuclease ללא ענבר או קרקרים צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 Aliquot μL של המדגם כל dsDNA עניין לתוך ענבר nuclease ללא שכותרתו כראוי או קרקרים צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון PicoGreen עובד על פי פרוטוקול של היצרן. העברת נפח שווה של הפתרון PicoGreen עובדים כדי שכל אחת מהן מכילה גם צינור רגיל או מדגם של עניין (5 μL בדוגמה זו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב כרכים שווה של 1x TE חיץ פתרון PicoGreen לעבוד כדי להכין את השליטה שלילית, המהווה פתרון התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תכולת שפופרת כל תגובה ביסודיות על ידי pipetting עדין דגירה התגובות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. כל הסטנדרטים דגימות צריך להיות equilibrated לטמפרטורה זהה לפני המדידה כאות הקרינה מושפעת טמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את המכשיר לבצע מדידות, תחילה לנקות את המשטח העליון והתחתון של מערכת השמירה המדגם. 2-3 Pipet μL של מים על פני השטח deionized אופטי נמוך, סגור ולאחר מכן פתח את זרוע המנוף, ומוחה את כנים העליון והתחתון עם נקייה ונטולת מוך, נגב מעבדה. ודא משטחים חופשיים של מוך לפני שתמשיך כמו מוך יכול להציג פלואורסצנציה בנוכחות מקור עירור והוא יכול להפריע המדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנה במכשיר, בחר את &quot;חומצות גרעין&quot; יישומים, ובחר את &quot;PicoGreen-dsDNA&quot; אפשרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ריק המכשיר, להוסיף 2 μL של 1x TE אל הכן התחתון, לסגור את הזרוע, ולחצו על &quot;ריק&quot; בתחום התוכנה במכשיר. לאחר השלמת ריק, כתם את הפתרון ריק משני משטחים של מערכת השמירה המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הפתרון על ידי התייחסות pipetting עדין. בעזרת טיפים שימור נמוך, μL 2 פיפטה על הדום התחתונה ולסגור את הזרוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;הפניה&quot; בסוג המדידה, בחר את היחידות הרצויות. לחץ על &quot;מדוד&quot; ליזום את מחזור המדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מחזור המדידה היא מוחלטת, לפתוח את היד וביסודיות למחוק את השמירה מדגם משטחים המערכת. מדוד עד חמש משכפל התייחסות, באמצעות aliquot טרי לשכפל כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך עבור הסטנדרטים נוסף לבנות עקומת סטנדרטי. עד שבעה תקנים ניתן להשתמש. התוכנה נועדה לאחסן עד חמישה משכפל עבור כל תקן. משכפל סטנדרטים הם בממוצע כדי ליצור עקומת סטנדרט שממנו ריכוזי מדגם נקבעים באופן אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עקומת הסטנדרטי הוא שלם, בחר את &quot;דוגמאות&quot; הכרטיסייה, הזן את המידע המתאים מזהה מדגם ולמדוד כל מדגם לא ידוע. </li></ol>

<ol><li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li>
<li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoolstra%2C+C+%22Implen+Applications+Note%22">Implen Applications Note</a>. , Munich, Germany. (2006).</li>
<li>Jr, I. ngle, D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJr%2C+Ingle+%22Spectrochemical+analysis%22">Spectrochemical analysis</a>. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. XV-590 (1988).</li>
<li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Lett%22%5BJournal%5D)">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li>
</ol>

פיליפ Desjardins ו דברה קונקלין מועסקים על ידי Thermo Scientific NanoDrop מוצרים, Inc המייצרת את המכשירים המשמשים במאמר זה.

פרוטוקולים quantitation המוצגים כאן מבוססים על רוב מקובל microvolume מערכות. מערכות אלו מספקות אלטרנטיבות מעשיות מסורתיות מתודולוגיה חומצות גרעין quantitation, אשר מסתמכים על כרכים מדגם גדול יותר ושימוש מנגנון הבלימה. NanoDrop microvolume טכנולוגיה מעסיקה השמירה מדגם מערכת שמסתמכת על המתח מאפייני פני השטח של המדגם הנמדדים כדי ליצור עמודה נוזלי. זה חיוני כי המדגם יוצר מגע עם משטחים העליון והתחתון מדידה אופטיות עבור בטור המתאים. אם בכל נקודה על תוצאות המדידה נראה לשחזור מדויק או לא, היא ככל הנראה תוצאה של הטרוגניות מדגם או שבירה טור נוזלי. דטרגנטים ואלכוהול איזופרופיל אינם מומלצים חומרי ניקוי, כיוון שהם עלולים uncondition המדידה משטחים הדום. הדום מותנית מתרחשת כאשר מאפייני פני השטח של הידרופובי הכן נפרץ, וכתוצאה מכך השטחת אגל המדגם. כנים מותנית יכולה להוביל שבירה של הטור נוזל בזמן המדידה. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. משטח מותנה מאופיין השטחת אגל מים. משטחים הדום Uncondtioned יכול להיות משופץ באמצעות מתחם Pedestal NanoDrop שפוץ (PR-1, Thermo Scientific מוצרים NanoDrop). שכבה דקה של המתחם שפוץ מוחל על משטחי רגל העליון והתחתון, להתייבש במשך ~ 30 שניות, ולאחר מכן שפשף את השימוש נקייה ונטולת מוך יבש, מעבדה לנגב. המדינה מחודשים בהצלחה מאופיין אגל מים ואגלי כאשר מוחל על פני השטח הדום התחתונה. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. משטח משופץ מאופיין ואגלי את אגל מים. מערכות Microvolume quantitation לצמצם במידה ניכרת את צריכת מדגם להגדיל באופן משמעותי את טווח הריכוז בהשוואה למערכות כימות מסורתיים יותר. למרות quantitation microvolume יש לעתים קרובות להפוך טכנולוגיה המאפשרת בנסיבות מעורבים מסת תאים מוגבל כגון ביופסיות מחט לייזר ללכוד microdissection, את היעילות ואת קלות השימוש של מתודולוגיה זו הפכה אותה מקובל אלטרנטיבה המסורתי גרעין quantitation שיטות חומצה אפילו כאשר המדגם הוא בשפע.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

nanodrop microvolume quantitation of nucleic acids

מבחני Biomolecular הרף מפותח כי השימוש בהדרגה כמויות קטנות של החומר, לעיתים קרובות מניעת השימוש קובט מבוססות מכשירים קונבנציונלי עבור quantitation חומצות גרעין עבור אלה שיכולים לבצע quantitation microvolume. החזקת NanoDrop microvolume מערכת מדגם (Thermo Scientific מוצרים NanoDrop) פונקציות על ידי שילוב הטכנולוגיה סיב אופטי טבעי מתח מאפייני פני השטח כדי ללכוד ולשמר כמויות זעירות של מדגם עצמאי של מנגנון הבלימה מסורתיים כגון cuvettes או נימים. יתר על כן, המערכת מעסיקה אורכי נתיב קצר יותר, אשר התוצאה מגוון רחב של מדידות ריכוז חומצת גרעין, למעשה מבטל את הצורך לבצע דילולים. הקטנת נפח של המדגם הנדרש עבור ניתוח ספקטרוסקופיות גם מקלה על הכללת צעדים שליטה נוספת באיכות ברחבי workflows מולקולרית רבים, הגברת היעילות, ובסופו של דבר מוביל בביטחון רב יותר בתוצאות במורד הזרם. הצורך בניתוח רגישות גבוהה הניאון של מסה מוגבל התפתחה גם עם התקדמות הניסוי האחרונות. שימוש באותה טכנולוגיה שימור microvolume מדגם, מדידות פלורסנט ניתן לבצע עם μL 2 של החומר, דבר המאפשר פלורסנט מבחני דרישות נפח להצטמצם באופן משמעותי. Microreactions כזה של μL 10 פחות או יותר כעת אפשרי באמצעות fluorospectrometer ייעודי microvolume. שני microvolume גרעין quantitation פרוטוקולים חומצה יהיה הפגינו המשתמשים משולב מדגם שימור מערכות כמו חלופות מעשיות קובט פרוטוקולים מבוססי המסורתית. ראשית, שיטה ישירה A260 ספיגת באמצעות ספקטרופוטומטר microvolume מתואר. זה ואחריו הפגנה של השיטה הקרינה מבוססי המאפשרת לצמצם נפח תגובות פלואורסצנציה עם fluorospectrometer microvolume. אלו טכניקות הרומן לאפשר הערכה של ריכוזי חומצות גרעין החל 1 pg / μL עד 15,000 ng / μL עם צריכה מינימלית של המדגם.

Watch this Scientific Journal Video about NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids at JoVE.com

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

השימוש במערכות NanoDrop microvolume כחלופות מעשי ויעיל המסורתית מתודולוגיה חומצות גרעין quantitation מתוארת באמצעות הדגמה של שני פרוטוקולים microvolume quantitation חומצת גרעין.

NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

<a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2891"> &#x4E2D;&#x6587; </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2892"> Deutsch </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2893"> Fran&#231;ais </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2894"> Espa&ntilde;ol </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/Details.stp?ID=2895"> &#x65E5;&#x672C;&#x8A9E; </a>

nanodrop-microvolume-quantitation-of-nucleic-acids

Research

JoVE Journal

Biology

202.0K Views.  Thermo Scientific NanoDrop Products.  中文 Deutsch Français 

Video: NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

ה-DNA מפוגל immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

ריכוז חלבון Microvolume קביעת באמצעות 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Bioengineering

<meta charset="utf8"></head><body>ננו-מכונות DNAzyme מדויקות לניתוח RNA ו-DNA מפלים

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: התקדמות בננו-חיישנים של DNA – התמודדות עם אתגרי רגישות וסלקטיביות בזיהוי מולקולרי

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

Biochemistry

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

קביעת ריכוז חומצות גרעין וחלבונים שימוש Micro בנפח Bio-spec ספקטרופוטומטר Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron transport chain. Unlike the diploid nuclear genome, most cells contain many more copies of mtDNA, ranging from less than 100 to over 200,000 copies depending on cell type. MtDNA copy number is increasingly used as a biomarker for a number of age-related degenerative conditions and diseases, and thus, accurate measurement of the mtDNA copy number is becoming a key tool in both research and diagnostic settings. Mutations in the mtDNA, often occurring as single nucleotide polymorphisms (SNPs) or deletions, can either exist in all copies of the mtDNA within the cell (termed homoplasmy) or as a mixture of mutated and WT mtDNA copies (termed heteroplasmy). Heteroplasmic mtDNA mutations are a major cause of clinical mitochondrial pathology, either in rare diseases or in a growing number of common late-onset diseases such as Parkinson's disease. Determining the level of heteroplasmy present in cells is a critical step in the diagnosis of rare mitochondrial diseases and in research aimed at understanding common late-onset disorders where mitochondria may play a role. MtDNA copy number and heteroplasmy have traditionally been measured by quantitative (q)PCR-based assays or deep sequencing. However, the recent introduction of ddPCR technology has provided an alternative method for measuring both parameters. It offers several advantages over existing methods, including the ability to measure absolute mtDNA copy number and sufficient sensitivity to make accurate measurements from single cells even at low copy numbers. Presented here is a detailed protocol describing the measurement of mtDNA copy number in single cells using ddPCR, referred to as droplet generation PCR henceforth, with the option for simultaneous measurement of heteroplasmy in cells with mtDNA deletions. The possibility of expanding this method to measure heteroplasmy in cells with mtDNA SNPs is also discussed.

Here we present a protocol for measuring absolute mitochondrial (mt)DNA copy number and mtDNA deletion heteroplasmy levels in single cells.

NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

Transcript

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST