Richard W. Beringer et David L. Ash, scientifiques applications, produits Thermo Scientific NanoDrop, d&#39;assistance technique et de tournage.

1. Quantification microvolume acide nucléique en utilisant une NanoDrop 2000c Spectrophotomètre <ol><li> Pour commencer, nettoyer les surfaces supérieures et inférieures optique du système de rétention spectrophotomètre microvolume échantillon par pipetage 2 à 3 uL d&#39;eau déminéralisée propre sur la surface inférieure optique. </li><li> Fermer le bras de levier, assurant que le piédestal supérieure vient en contact avec l&#39;eau déminéralisée. Soulever le bras de levier et essuyez les surfaces optiques avec un chiffon propre, sec, non pelucheux laboratoire essuyer. </li><li> Ouvrez le logiciel NanoDrop et sélectionnez l&#39;application des acides nucléiques. Utiliser un petit volume, pipette calibrée pour effectuer un essai à blanc en supprimant 1 ul de tampon sur la surface inférieure optique. Abaissez le bras de levier et sélectionnez &quot;vierge&quot; dans l&#39;application des acides nucléiques. </li><li> Une fois l&#39;essai à blanc est terminée, nettoyer les deux surfaces optiques avec un chiffon propre, sec, non pelucheux laboratoire essuyer. </li><li> Choisissez la constante appropriée de l&#39;échantillon qui doit être mesuré. <table border="1"><tbody><tr><td> Type d&#39;échantillon </td><td> Sélectionnez l&#39;option </td><td> Constante utilisée pour calculer la concentration </td></tr><tr><td> ADNdb </td><td> DNA-50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ADNss </td><td> DNA-33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> ARN </td><td> ARN-40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Oligo </td><td> Personnalisé </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Typiques nucléiques gammes de concentration d&#39;acide pour les mesures d&#39;absorbance A280 directe en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop microvolume, une cuvette traditionnelle basée spectrophotomètre utilisé avec une cuvette TrayCell Microcell, et un fluorospectrometer NanoDrop microvolume en conjonction avec le dosage PicoGreen. </li><li> Répartir 1 ul d&#39;échantillon d&#39;acides nucléiques sur la partie inférieure piédestal optique et fermer le bras de levier. Parce que la mesure est indépendant du volume, l&#39;échantillon a seulement besoin de combler le fossé entre les deux surfaces optiques pour une mesure à prendre. </li><li> Sélectionnez &quot;mesure&quot; dans le logiciel d&#39;application. Le logiciel calcule automatiquement le taux de concentration d&#39;acides nucléiques et de pureté. Suite à la mesure de l&#39;échantillon, l&#39;examen de la sortie spectrale. </li><li> Le logiciel calcule automatiquement le taux de concentration d&#39;acides nucléiques et de pureté. Suite à la mesure de l&#39;échantillon, l&#39;examen de l&#39;image spectrale pour évaluer la qualité de l&#39;échantillon. </li><li> Un échantillon d&#39;acide nucléique typiques ont un profil très caractéristique. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Un échantillon d&#39;acide nucléique typiques ont un profil très caractéristique. </li><li> Les sources communes de polluants associés à des techniques d&#39;isolement nucléiques acides comprennent l&#39;extraction phénol / Trizol et la colonne. Dans le cas de l&#39;extraction phénol / Trizol, la contamination réactif résiduel peut être indiquée par des spectres anormaux entre 220 à 240 nm ainsi que par des changements dans la région 260-280 nm. Inversement, la guanidine résiduelles provenant de l&#39;extraction de colonne peut contribuer à un pic de près de 230 nm et un changement dans le creux de 230 nm à environ 240 nm. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Les changements dans les pics et les creux des échantillons B et C par rapport à l&#39;échantillon A d&#39;illustrer comment les contaminants peuvent affecter les spectres des échantillons d&#39;acide nucléique. </li><li> Pour évaluer avec précision la qualité des échantillons, 260/280 ou 260/230 ratios doivent être analysés en combinaison avec la qualité spectrale globale. Pur acides nucléiques généralement un ratio de rendement des 260/280 ~ 1,8 et un ratio de 260/280 de ~ 2.0 pour l&#39;ADN et l&#39;ARN, respectivement. Ce ratio est dépendant du pH et la force ionique du tampon utilisé pour faire l&#39;ébauche et les mesures d&#39;échantillons. Des solutions acides seront sous-représenter le ratio de 0,2-0,3, tandis qu&#39;une solution de base sera sur-représenter le ratio de 0,2-0,3. Ratios significativement différents de pureté peut indiquer la présence de protéines, de contaminants de phénol ou d&#39;autres qui absorbent fortement à ou près 280 nm. Le ratio 260/230 pureté est une deuxième mesure de pureté de l&#39;ADN avec des valeurs pour un acide nucléique «pure» couramment de l&#39;ordre de 1.8 à 2.2. Ratios de pureté qui sont nettement inférieurs aux valeurs attendues peuvent indiquer la technique d&#39;isolement utilisées peuvent nécessiter une optimisation plus poussée. </li><li> Spectrophotomètres NanoDrop peut également être utilisé pour quantifier les protéines à l&#39;aide d&#39;absorbance directe ou par des analyses de protéines colorimétrique. Pour assurer la formation adéquate et une reproductibilité de colonne, 2-ul échantillons sont conseillés pour les échantillons de protéines. Se référer à la vidéo suivante JoVE: Détermination microvolume concentration de protéines utilisant le spectrophotomètre NanoDrop <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610</a> </li></ol><ol><li> Pour démontrer à haute sensibilité quantification microvolume acide nucléique en utilisant les 3300 NanoDrop, un kit PicoGreen fluorescence est utilisée. Pour commencer, à équilibrer le kit normes et tous les échantillons d&#39;acides nucléiques à température ambiante. Échantillons fluorescents sont sensibles à la lumière et doit être conservé dans l&#39;ambre ou des tubes enveloppés aluminium. </li><li> Préparez assez 1x tampon TE pour toutes les normes et les échantillons à mesurer, ainsi que pour la solution PicoGreen travail qui sera nécessaire. Préparer un tampon 1xTE en diluant le tampon TE 20x fourni avec une eau sans nucléase par le protocole du fabricant. Volumes de réaction peut varier de 200 uL d&#39;aussi peu que 10 ul. Dans cet exemple, 10 volumes de réaction uL sera préparé. </li><li> Préparer dilués en série de normes ADNdb à 2x la concentration finale souhaitée sans nucléase flacons ou des tubes. Transférer 5 ul de chacune des normes ADNdb dilué dans un individu étiqueté sans nucléase ambre ou de papier d&#39;aluminium couverte tube. </li><li> Aliquote de 5 ul de chaque échantillon ADNdb d&#39;intérêt dans dûment étiquetés sans nucléase ambre ou de papier d&#39;aluminium recouvert tubes. </li><li> Préparer la solution PicoGreen de travail selon le protocole du fabricant. Transfert d&#39;un volume égal de la solution PicoGreen de travail dans chaque tube contenant soit une norme ou un échantillon d&#39;intérêt (5 uL dans cet exemple). </li><li> Combiner des volumes égaux de 1x tampon TE et PicoGreen solution de travail pour préparer le contrôle négatif, qui sert de solution de référence. </li><li> Mélanger le contenu de chaque tube de réaction à fond par pipetage doux et incuber les réactions à la température ambiante pendant 5 minutes. Toutes les normes et les échantillons doivent être équilibrées à la même température avant la mesure en tant que signal de fluorescence est affectée par la température. </li><li> Pour préparer l&#39;instrument et effectuer des mesures, d&#39;abord nettoyer les surfaces inférieure et supérieure du système de rétention de l&#39;échantillon. Pipeter 2 à 3 uL d&#39;eau déminéralisée sur la surface inférieure d&#39;optique, à proximité, puis ouvrez le bras de levier, et éponger les piédestaux supérieure et inférieure avec un chiffon propre, non pelucheux, essuyez laboratoire. Assurez-vous que les surfaces sont libres de charpie avant de procéder comme charpie peuvent présenter fluorescence en présence d&#39;une source d&#39;excitation et peut interférer avec la mesure. </li><li> Ouvrez le logiciel de l&#39;instrument, sélectionnez l&#39;option &quot;Nucleic Acids&quot; application, et sélectionnez l&#39;option &quot;PicoGreen-ADNdb&quot; option. </li><li> Pour l&#39;instrument vierge, ajouter 2 ul de TE 1x à la baisse piédestal, fermer le bras, et sélectionnez &quot;vierge&quot; dans le domaine logiciel de l&#39;instrument. Une fois vide est complet, éponger hors de la solution à blanc par les deux surfaces du système de rétention de l&#39;échantillon. </li><li> Mélanger la solution de référence par pipetage doux. En utilisant des pointes faible rétention, pipette 2 uL sur la partie inférieure piédestal et fermer le bras. </li><li> Sélectionnez &quot;référence&quot; dans le type de mesure, et de sélectionner les unités désirées. Cliquez sur &quot;Mesure&quot; pour lancer le cycle de mesure. </li><li> Lorsque le cycle de mesure est terminée, ouvrez le bras et à fond blot sur les surfaces de l&#39;échantillon de rétention du système. Mesure jusqu&#39;à cinq répétitions de la référence, en utilisant une aliquote fraîche pour chaque réplique. </li><li> Répétez le processus pour les normes supplémentaires pour construire une courbe standard. Jusqu&#39;à sept normes peuvent être utilisés. Le logiciel est conçu pour stocker jusqu&#39;à cinq répétitions pour chaque norme. Réplique des normes sont en moyenne de générer une courbe standard à partir de laquelle les concentrations de l&#39;échantillon sont déterminés automatiquement. </li><li> Une fois la courbe standard est complète, sélectionnez l&#39;option &quot;échantillons&quot; onglet, entrez les informations de l&#39;échantillon respectifs ID et de mesurer chaque échantillon inconnu. </li></ol>

<ol>
	<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity.">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li><li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Quantification+of+Nucleic+Acids:+LabelGuard+enables+photometric+quantification+of+submicroliter+samples+using+a+standard+photometer.">Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer.</a> Implen Applications Note. , (2006).</li><li>Jr, I. n. g. l. e., D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spectrochemical analysis. , XV-590 (1988).</li><li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA.">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li></ol>

Philippe Desjardins et Debra Conklin sont employés par des produits Thermo Scientific NanoDrop, Inc qui produit des instruments utilisés dans cet article.

Les protocoles de quantification présentées ici sont basées sur les systèmes les plus largement acceptées microvolume. Ces systèmes fournissent des solutions de rechange pratique pour méthode traditionnelle d&#39;acide nucléiques quantification, qui reposent sur des volumes d&#39;échantillon plus grande et l&#39;utilisation d&#39;appareils de confinement. NanoDrop microvolume technologie utilise un système de rétention d&#39;échantillon qui s&#39;appuie sur les propriétés de tension superficielle de l&#39;échantillon mesuré pour former une colonne liquide. Il est essentiel que l&#39;échantillon est en contact avec les surfaces supérieures et inférieures de mesure optique pour la formation de la colonne appropriée. Si à tout moment les résultats de mesure semblent inexactes ou non reproductibles, il est probablement le résultat de l&#39;hétérogénéité de l&#39;échantillon ou le bris de colonne liquide. Détergents et d&#39;alcool isopropylique ne sont pas recommandés agents de nettoyage, car ils peuvent incondition les surfaces de mesure piédestal. Un piédestal inconditionnée se produit lorsque les propriétés de surface hydrophobe du piédestal a été compromise, ce qui entraîne un aplatissement de la goutte d&#39;échantillon. Socles Inconditionné peut conduire à la rupture de la colonne de liquide pendant le mesurage. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Surface de la figure 3. Inconditionné est caractérisée par un aplatissement d&#39;une goutte d&#39;eau. Surfaces piédestal Uncondtioned peut être reconditionné en utilisant le composé piédestal NanoDrop reconditionnement (PR-1, Thermo Scientific Products NanoDrop). Une fine couche de composé reconditionnement est appliqué sur les surfaces supérieures et inférieures piédestal, on laisse sécher pendant environ 30 secondes, puis déteint l&#39;aide d&#39;un endroit propre, sec, non pelucheux laboratoire essuyer. Un état avec succès reconditionnés est caractérisée par une gouttelette d&#39;eau perlant place lorsqu&#39;il est appliqué à la surface piédestal bas. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Une surface reconditionnés est caractérisée par un perlage d&#39;une goutte d&#39;eau. Systèmes de quantification microvolume réduire considérablement la consommation de l&#39;échantillon et augmenter considérablement la gamme de concentration par rapport aux systèmes quantification plus traditionnels. Bien que la quantification microvolume est souvent devenu une technologie habilitante pour des circonstances impliquant la masse cellulaire limitée tels que biopsies à l&#39;aiguille et le laser capture microdissection, l&#39;efficacité et la facilité d&#39;utilisation de cette méthodologie a fait largement accepté alternative aux méthodes de quantification d&#39;acides nucléiques, même lorsque l&#39;échantillon est abondante.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

nanodrop microvolume quantitation of nucleic acids

Dosages biomoléculaire sont continuellement développés qui utilisent des quantités progressivement plus petites de matériel, souvent obstacle à l&#39;utilisation de la cuvette conventionnelle basée sur des instruments de quantification d&#39;acides nucléiques pour ceux qui peuvent effectuer une quantification microvolume. Le système de rétention NanoDrop microvolume échantillon (Produits Thermo Scientific NanoDrop) en combinant les fonctions technologie des fibres optiques et les propriétés naturelles tension de surface pour capturer et retenir des quantités infimes d&#39;échantillon indépendant de l&#39;appareil de confinement traditionnels tels que les cuvettes ou capillaires. Par ailleurs, le système utilise la longueur des trajets plus courts, ce qui résulte dans une large gamme de mesures de concentration d&#39;acide nucléiques, éliminant la nécessité d&#39;effectuer des dilutions. Réduire le volume d&#39;échantillon requis pour l&#39;analyse spectroscopique facilite également l&#39;inclusion d&#39;autres étapes de contrôle qualité tout au long de nombreux flux moléculaire, augmentant l&#39;efficacité et conduisant finalement à une plus grande confiance dans les résultats en aval. La nécessité d&#39;une haute sensibilité d&#39;analyse de fluorescence de masse limitée est également apparu avec les récentes avancées expérimentales. Utilisant la même technologie microvolume de rétention de l&#39;échantillon, les mesures de fluorescence peut être réalisée avec 2 pi de matériel, permettant des dosages fluorescents exigences de volume pour être sensiblement réduits. Ces microréactions de 10 uL ou moins sont désormais possibles en utilisant une fluorospectrometer dédié microvolume. Deux protocoles de quantification microvolume nucléiques acide sera démontré que l&#39;utilisation de systèmes intégrés de conservation de l&#39;échantillon comme des alternatives aux pratiques traditionnelles cuvette des protocoles. D&#39;abord, une méthode directe A260 d&#39;absorbance avec un spectrophotomètre microvolume est décrite. Elle est suivie par une démonstration d&#39;une méthode de fluorescence qui permet aux volumes réduits réactions de fluorescence avec un fluorospectrometer microvolume. Ces nouvelles techniques permettent l&#39;évaluation des concentrations d&#39;acides nucléiques allant de 1 pg / uL à 15.000 ng / uL avec une consommation minimale de l&#39;échantillon.

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NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

L&#39;utilisation de systèmes microvolume NanoDrop comme des alternatives concrètes et efficaces pour méthode traditionnelle d&#39;acide nucléiques quantification est décrite à travers la démonstration de deux protocoles de quantification microvolume nucléiques acides.

NanoDrop microvolume quantification des acides nucléiques

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Vidéo: NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

Immunoprécipitation ADN méthylé

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Recherche

Biologie

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Détermination microvolume concentration de protéines en utilisant le spectrophotomètre NanoDrop 2000c

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Circulant microARN Quantification Utilisation DNA-binding Dye Chemistry and Droplet PCR numérique

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Bio-ingénierie

<meta charset="utf8"></head><body>Nanomachines DNAzyme de précision pour l’analyse discriminante de l’ARN et de l’ADN

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>Pleins feux sur l’auteur : Progrès dans les nanocapteurs d’ADN - Relever les défis de la sensibilité et de la sélectivité dans la détection moléculaire

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

Nanomachines à base de DNAzyme 10-23 pour la reconnaissance des acides nucléiques

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

Biochimie

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Détermination de la concentration des acides nucléiques et des protéines en utilisant le micro-volume Bio-spec Spectrophotomètre Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

La ligature très efficace de petites molécules d&#39;ARN pour microARN quantification par séquençage à haut débit

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

PCR en temps réel basée sur une sonde Approches de mesure quantitative des microARN

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

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Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

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