Ричард У. Берингер и Дэвид Л. Эш, Приложения Ученые, Термо продукты Научно NanoDrop, для оказания технической помощи и съемок.

1. Микрообъеме нуклеиновых кислот с использованием количественного NanoDrop 2000c Спектрофотометр <ol><li> Во-первых, чистые верхние и нижние оптических поверхностей образца микрообъеме система удержания спектрофотометр с помощью пипетки 2 до 3 мкл чистой деионизированной воды на нижнюю оптической поверхности. </li><li> Закройте рычаг, гарантируя, что верхний пьедестал вступает в контакт с деионизированной водой. Поднимите рычаг и вытрите как оптические поверхности чистой, сухой, без ворса протрите лаборатории. </li><li> Открытое NanoDrop программного обеспечения и выберите нуклеиновых кислот приложений. Использование небольшого объема, калиброванные пипетки для выполнения измерений по пустым дозирования 1 мкл буфера на нижнюю оптической поверхности. Нижний рычаг и выберите &quot;Blank&quot; в нуклеиновые кислоты приложений. </li><li> Как только пустые измерение завершено, чистый как оптические поверхности чистой, сухой, без ворса протрите лаборатории. </li><li> Выберите подходящий для постоянного образца, который должен быть измерен. <table border="1"><tbody><tr><td> Тип пробы </td><td> Выберите вариант </td><td> Постоянное используется для расчета концентрации </td></tr><tr><td> дц </td><td> ДНК-50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> оцДНК </td><td> ДНК-33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> РНК </td><td> РНК-40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Oligo </td><td> Обычай </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> Таблица 1. Типичные нуклеиновой кислоты концентрацией диапазоны для прямого поглощения A280 измерений с помощью NanoDrop микрообъеме спектрофотометр, традиционные кювет основе спектрофотометра использоваться с TrayCell микроэлемент кювет и fluorospectrometer микрообъеме NanoDrop в сочетании с анализа PicoGreen. </li><li> Внесите 1 мкл нуклеиновой кислоты образца на нижний оптический пьедестал и закрыть рычаг. Потому что измерение объема независимой, образец нужно только преодолеть разрыв между двумя оптическими поверхностями для измерения должны быть сделаны. </li><li> Выберите &quot;Мера&quot; в прикладном программном обеспечении. Программное обеспечение автоматически рассчитает нуклеиновой кислоты концентрации и чистоты отношений. После измерения пробы, анализ спектральных выход. </li><li> Программное обеспечение автоматически рассчитает нуклеиновой кислоты концентрации и чистоты отношений. После измерения пробы, анализ спектральных изображений для оценки качества образцов. </li><li> Типичный образец нуклеиновых кислот, будет иметь очень характерный профиль. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Типичный образец нуклеиновых кислот, будет иметь очень характерный профиль. </li><li> Общие источники загрязнения, связанные с конкретными нуклеиновых кислот включают изоляцию Фенол / Trizol и столбцов добычи. В случае фенола / Trizol добычи, остаточное загрязнение реагентов может быть обозначено ненормальным спектра от 220 до 240 нм, а также сдвиги в 260 до 280 нм. И наоборот, остаточная гуанидина из колонки добычи может способствовать пик вблизи 230 нм и сдвиг в корыто от 230 нм до приблизительно 240 нм. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Сдвиги в пики и впадины образцов В и С по сравнению с образцом иллюстрации того, как загрязняющие вещества могут влиять на спектры нуклеиновых кислот. </li><li> Чтобы точно оценить качество образцов, 260/280 или 260/230 отношения должны быть проанализированы в сочетании с общей спектрального качества. Чистая нуклеиновых кислот обычно дает 260/280 отношение ~ 1,8 и 260/280 отношение ~ 2,0 для ДНК и РНК, соответственно. Это соотношение зависит от рН и ионной силы буфера используется, чтобы сделать пустым и выборочных измерений. Кислотные растворы будет недостаточно представляют соотношение 0,2-0,3, в то время как основное решение будет чрезмерно представляют соотношение 0,2-0,3. Значительно различных соотношениях чистоты может указывать на наличие белка, фенола или других загрязняющих веществ, которые поглощают сильно в или около 280 нм. 260/230 чистоты соотношение Вторая мера чистоты ДНК со значениями для &quot;чистой&quot; нуклеиновой кислоты, обычно в диапазоне 1,8-2,2. Чистота отношений, которые значительно ниже, чем ожидаемые значения может указывать на изоляцию техника, используемая могут потребовать дальнейшей оптимизации. </li><li> NanoDrop спектрофотометры также может быть использована для количественного белков с использованием прямого поглощения или белка колориметрических анализов. Для обеспечения правильного формирования колонны и воспроизводимость, 2-мкл образцов рекомендуется для белка образцов. См. следующее видео Юпитера: микрообъеме концентрации белка Определение Использование NanoDrop Спектрофотометр <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610</a> </li></ol><ol><li> Чтобы продемонстрировать высокую чувствительность микрообъеме нуклеиновых кислот с использованием количественного NanoDrop 3300, комплект PicoGreen флуоресценции используется. Во-первых, равновесие комплект стандартов и всех нуклеиновых кислот до комнатной температуры. Флуоресцентные образцов светочувствительных и должен храниться в янтаре или алюминиевых труб упаковке. </li><li> Подготовка достаточно 1x TE буфера для всех стандартов и образцов для измерения, а также для PicoGreen рабочего раствора, которые будут необходимы. Подготовка 1xTE буфера путем разбавления при условии, 20x TE буфера с нуклеазы без воды в соответствии с протоколом производителя. Реакция объемов может составлять от 200 мкл до всего лишь 10, ул. В этом примере, 10 мкл реакция будет подготовлен. </li><li> Подготовка последовательно разбавлены дцДНК стандартов на скорости 2х окончательной желаемой концентрации в нуклеазы без флаконах или трубках. Передача 5 мкл каждого из разбавленных стандартов двухцепочечной ДНК в отдельных помечены нуклеазы без янтаря или фольгой покрытых труб. </li><li> Алиготе 5 мкл каждого образца дцДНК интереса в соответствующей маркировкой нуклеазы без янтаря или фольгой покрытых труб. </li><li> Подготовка PicoGreen рабочего раствора в соответствии с протоколом производителя. Передача равным объемом PicoGreen рабочего раствора в каждую пробирку, содержащие либо стандартного или образец интерес (5 мкл в данном примере). </li><li> Комбинат равные объемы 1x TE буфера и PicoGreen рабочего раствора для подготовки отрицательного контроля, который служит в качестве раствора сравнения. </li><li> Смешайте содержимое каждой реакционной трубы тщательно, осторожно пипеткой и инкубировать реакции при комнатной температуре в течение 5 минут. Все стандарты и образцы должны быть доведены до той же температуры до измерения, сигнал флуоресценции зависит от температуры. </li><li> Для подготовки документа и проводить измерения, в первую чистую нижней и верхней поверхностях системы удержания образца. Внесите 2 до 3 мкл деионизованной воды на нижнюю оптической поверхности, рядом откройте рычаг, и промокните верхнего и нижнего основания с чистым, без ворса, лабораторные салфетки. Обеспечить поверхности свободны от нибудь вкусненькое прежде чем приступить, как ткань может выставить флуоресценции в присутствии источника возбуждения и может вмешиваться в измерения. </li><li> Открытый программный инструмент, выберите &quot;нуклеиновые кислоты&quot; приложение и выберите &quot;PicoGreen-дц&quot; вариант. </li><li> Для пустой документ, добавьте 2 мкл ТЕ-1x в нижний постамент, рядом руку, и выберите &quot;Blank&quot; в области программного инструмента. Как только заготовка полной, пятно от пустое решение с обеих поверхностях системы удержания образца. </li><li> Смешайте раствор сравнения, осторожно пипеткой. Использование низких советы удержания, пипетки 2 мкл на нижний постамент и закрыть рукой. </li><li> Выберите &quot;ссылку&quot; в тип измерения и выберите желаемый единиц. Нажмите &quot;Мера&quot;, чтобы начать цикл измерений. </li><li> Когда цикла измерения полного, открытого руки и тщательно пятно с поверхности образцов удерживающей системы. Мера до пяти повторов ссылки, используя свежие аликвоту для каждой репликации. </li><li> Повторите эту процедуру для дополнительных стандартов для создания калибровочной кривой. До семи стандарты могут быть использованы. Программа предназначена для хранения до пяти повторяет для каждого стандарта. Репликация стандартов усредняются для получения стандартной кривой, из которой образец концентрации определяются автоматически. </li><li> После стандартной кривой завершена, выберите &quot;Образцы&quot; на вкладке, введите соответствующую информацию ID образцом и мерой каждого неизвестного образца. </li></ol>

<ol>
	<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity.">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li><li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Quantification+of+Nucleic+Acids:+LabelGuard+enables+photometric+quantification+of+submicroliter+samples+using+a+standard+photometer.">Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer.</a> Implen Applications Note. , (2006).</li><li>Jr, I. n. g. l. e., D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spectrochemical analysis. , XV-590 (1988).</li><li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA.">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li></ol>

Филипп Дежарден и Дебра Конклин являются сотрудниками Thermo Scientific Продукты NanoDrop, Inc, которая производит инструменты, используемые в этой статье.

Количественного протоколы, представленные здесь, основаны на наиболее широко признанных микрообъеме систем. Такие системы обеспечивают практические альтернативы для традиционных нуклеиновых методологии количественного кислоты, которые полагаются на большее объемы проб и использование сдерживания аппарата. NanoDrop микрообъеме технология работает система удержания образца, который полагается на поверхностное натяжение свойства образца измеряется в форме столба жидкости. Очень важно, чтобы образец вступает в контакт с верхней и нижней поверхностях оптических измерений для правильного формирования колонки. Если в любой момент результаты измерений, кажется неточным или не воспроизводимы, то, скорее всего результат неоднородности образца или жидкости поломки колонки. Моющие средства и изопропиловый спирт, не рекомендуется чистящие средства, поскольку они могут uncondition поверхности пьедестала измерения. Безусловных пьедестал происходит, когда гидрофобные свойства поверхности пьедестала были скомпрометированы, в результате чего уплощение образца капли. Безусловное пьедесталы может привести к поломке столба жидкости во время измерения. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="Рисунок 3" /> Рисунок 3. Безусловное поверхность характеризуется уплощением капли воды. Uncondtioned поверхности пьедестал может быть восстановленные использованием NanoDrop Пьедестал Восстановление соединений (ПР-1, Thermo Scientific NanoDrop продукты). Тонкий слой восстановление соединения применяется к верхней и нижней поверхностях пьедестала, дают высохнуть в течение ~ 30 секунд, затем стирается с помощью чистой, сухой, без ворса протрите лаборатории. Успешно восстановленное состояние характеризуется капли воды бисером, когда наносится на поверхность пьедестала вниз. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="Рисунок 4" /> Рисунок 4. Восстановленное поверхность характеризуется бисером из капли воды. Системы микрообъеме количественного значительно сократить потребление и образец значительно увеличить диапазон концентраций по сравнению с более традиционными системами количественной оценки. Хотя микрообъеме количественного нередко становится технологией для обстоятельств, связанных с ограниченным клеточной массы, таких как иглы биопсии и лазерно-захвата микродиссекции, эффективность и простоту в использовании данной методики дало широкое признание альтернативой традиционным методам количественного нуклеиновые кислоты даже когда образец имеется в изобилии.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

nanodrop microvolume quantitation of nucleic acids

Биомолекулярных анализов постоянно развивается постепенно, использующих меньшее количество материала, часто исключающих применение обычных кювет основе инструментов для нуклеиновых кислот количественного для тех, которые могут выполнять микрообъеме количественного определения. NanoDrop образец микрообъеме удерживающая система (Thermo Продукты Научно NanoDrop) функции путем объединения волоконно-оптических технологий и природных свойств поверхностного натяжения, чтобы захватить и удерживать незначительное количество образца независимо от традиционного аппарата сдерживания таких как кювет или капилляров. Кроме того, система использует более короткий путь длины, что приводит к широкому спектру нуклеиновых измерения концентрации кислоты, по существу, избавляя пользователя от необходимости выполнять разведения. Сокращение объема образцов, необходимых для спектрального анализа также облегчает включение дополнительных мер контроля качества на протяжении многих молекулярные процессы, повышая эффективность и в конечном итоге приводит к большей уверенности в нижнем течении результаты. Необходимость высокой чувствительности флуоресцентного анализа ограниченной массы также появились с недавних экспериментальных достижений. Используя ту же технологию удержания образца микрообъеме, флуоресцентные измерения могут быть выполнены с 2 мкл материала, что позволяет флуоресцентные объем анализов требования, которые должны значительно сокращен. Такие microreactions от 10 мкл или менее теперь возможно с помощью выделенного fluorospectrometer микрообъеме. Два микрообъеме нуклеиновые кислоты протоколами количественного будет показано, что использование интегрированных пример сохранения системы как практические альтернативы традиционным кювет основе протоколов. Во-первых, прямой A260 поглощения методом с использованием спектрофотометра микрообъеме описано. Это сопровождается демонстрацией флуоресценции основе метода, который позволяет снизить объемы флуоресценции реакции с fluorospectrometer микрообъеме. Эти новые методы позволяют оценивать нуклеиновых кислот концентрацией от 1 пг / мкл до 15000 нг / мкл с минимальным потреблением образца.

Watch this Scientific Journal Video about NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids at JoVE.com

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Использование системы NanoDrop микрообъеме практические и эффективные альтернативы традиционной методологии количественного нуклеиновых кислот описывается через демонстрацию двух микрообъеме нуклеиновых протоколами количественного кислоты.

NanoDrop микрообъеме Количественное определение нуклеиновых кислот

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

<a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2891"> &#x4E2D;&#x6587; </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2892"> Deutsch </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2893"> Fran&#231;ais </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2894"> Espa&ntilde;ol </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/Details.stp?ID=2895"> &#x65E5;&#x672C;&#x8A9E; </a>

nanodrop-microvolume-quantitation-of-nucleic-acids

Research

JoVE Journal

Biology

201.9K Views.  Thermo Scientific NanoDrop Products.  中文 Deutsch Français 

Video: NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

Метилированный Иммунопреципитация ДНК

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Микрообъеме концентрации белка Определение использованием NanoDrop 2000c Спектрофотометр

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Циркулирующие микроРНК Количественное Использование ДНК-связывающих Dye Химия и дроплет Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Bioengineering

<meta charset="utf8"></head><body>Прецизионные наномашины DNAzyme для дискриминантного анализа РНК и ДНК

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>В центре внимания автора: Достижения в области наносенсоров ДНК – решение проблем чувствительности и селективности при молекулярном детектировании

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

DNAzyme 10-23 - Наномашины для распознавания нуклеиновых кислот

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

Biochemistry

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Определение концентрации нуклеиновых кислот и белков Использование Micro объемом Био-спецификации Nano Спектрофотометр

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Высокоэффективная Лигирование малых РНК молекул для микроРНК количественного путем высокопроизводительного секвенирования

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Зонд на основе ПЦР в реальном времени подходов к количественному измерению микроРНК

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Простой Массовая считывания цифровых нуклеиновых кислот количественного определения Анализы

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

NanoDrop микрообъеме Количественное определение нуклеиновых кислот

Транскрипт

Резюме

Смотреть дополнительные видео

PLAYLIST