Ce travail a été financé par le Wellcome Trust (WT 0795880).

Le protocole suivant décrira l&#39;étude de l&#39;invasion des cellules endothéliales par S. aureus, mais peuvent théoriquement être utilisés pour étudier l&#39;invasion cellulaire par toute bactérie cultivable. Étapes spécifiques à S. cellules endothéliales et de Staphylococcus aureus sont indiqués. 1. Préparation des bactéries <ol><li> Culture S. pour les souches de Staphylococcus 4-16 h (selon la phase de croissance requis) dans 10 ml d&#39;infusion cerveau-coeur (BHI) à 37 ° C dans l&#39;air avec agitation à 200 rpm. Ces conditions de croissance sont spécifiques pour S. aureus et peut-être besoin d&#39;être adapté pour d&#39;autres bactéries. </li><li> Lavez les bactéries à trois reprises dans le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM; Invitrogen) par tours suppléant de centrifugation à la température ambiante (5000 x g, 10 min), l&#39;enlèvement du surnageant de culture et de la remise en suspension du culot bactérien dans un volume équivalent de DMEM. Mesurer la densité optique de la suspension résultant de bactéries qui peuvent ensuite être ajustés selon les besoins. Pour S. aureus, nous préparons une suspension à DO600 = 1, ce qui correspond à ~ 10 9 cfu ml -1. </li></ol> 2. Culture de cellules endothéliales <ol><li> Culture de la lignée cellulaire endothéliale EA.hy926 1 dans DMEM supplémenté avec du sérum de veau fœtal (FBS; 10%) et la L-glutamine (2 mM) à 37 ° C dans 5% de CO 2. Alternativement, les cellules humaines primaires regroupés endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) peuvent être achetés auprès de Lonza (Bâle, Suisse) et cultivées dans un milieu de base endothéliales supplémenté avec 2% de FBS, extrait de cerveau bovin (y compris l&#39;héparine), facteur de croissance endothélial humain et l&#39;hydrocortisone à 37 ° C en 5% de CO 2 selon les instructions du fabricant (Lonza). Ces conditions de croissance sont spécifiques à ces cellules et peut-être besoin d&#39;être adapté à d&#39;autres types de cellule hôte. </li><li> Cultiver des cellules endothéliales dans les flacons T75 pour compléter confluence, vérifiée par l&#39;œil. </li><li> Préparer les plaques de 24 puits pour l&#39;insertion des lamelles. Pinces fines (flamme stérilisés) sont nécessaires pour déplacer les lamelles, qui ont une surface opaque et un brillant. Lamelles Placer dans le puits de la plaque de 24 puits avec la surface opaque vers le haut pour permettre la fixation des cellules. </li><li> Libérez les cellules du ballon T75 avec 3 ml de trypsine-EDTA (0,25%) et ajouter 10 ml du milieu de culture concernés. </li><li> Ajouter 500 ul de cellules remises en suspension à des plaques 24 puits contenant des lamelles en verre Thermanox. Un flacon T75 confluente de cellules fourni suffisamment de cellules pour deux plaques de 24 puits, résultant en environ 5 × 10 5 cellules par puits (dans 500 pl de milieu). </li><li> Incuber les plaques pendant 48 h comme décrit ci-dessus, et vérifier 100% de confluence des cellules par microscopie optique inversée. </li><li> Trempez-wash lamelles dans du PBS et ajouter de nouvelles plaques de 24 puits contenant 490 ul DMEM contenant 10% de FBS dans chaque puits. </li><li> Pour examiner le rôle des processus métaboliques spécifiques dans l&#39;invasion cellulaire, les inhibiteurs peuvent être ajoutés à des cellules cultivées 1 h avant l&#39;ajout des bactéries et des concentrations maintenue pendant le dosage. Par exemple, pour déterminer le rôle de réarrangement d&#39;actine dans S. l&#39;invasion des cellules endothéliales aureus, 50 uM cytochalasine D peuvent être ajoutés ou pour le rôle des cavéoles, 5 mM méthyl-β-cyclodextrine peut être ajoutée. </li></ol> 3. Assay Invasion <ol><li> Ajouter 10 ul de bactéries lavées (résultant en environ 2 × 10 7 cfu ml -1 S. aureus) dans chaque puits contenant une lamelle lavés avec une couche confluente de cellules endothéliales dans 490 ul DMEM contenant 10% de FBS. </li><li> Incuber pendant 15-90 minutes à 37 ° C dans 5% de CO 2. </li><li> Pour mesurer le nombre total de bactéries associées aux cellules (adhérentes et intériorisé), trempez-laver les lamelles à trois reprises dans du PBS et ajouter aux puits frais contenant 500 ul de 0,5% de Triton X-100 dans le PBS. Pour assurer les cellules totalement lyser et libérer toutes les bactéries internalisées, pipetter le plusieurs fois, pointant le bout de la pipette directement sur la surface de la lamelle. </li><li> Énumérer les bactéries en étalant le liquide en suspension (ou des dilutions de cette si nécessaire) sur la surface des plaques de TSA. Depuis TX-100 lyseront nombreuses bactéries Gram-négatives, la saponine peut être utilisé à la place 2. </li><li> Pour mesurer le nombre de bactéries internalisées, enlever le surnageant de culture de chaque puits contenant des bactéries non liée et la remplacer par 500 ul FBS DMEM/10% additionné de 200 pg ml -1 gentamicine. Nous utilisons régulièrement la gentamicine, plutôt que lysostaphine ici car il est moins cher et nous permet de basculer entre les expériences en utilisant différents types de bactéries (par exemple les staphylocoques et les lactocoques) sans avoir à modifier le protocole expérimental. </li><li> Incuber les plaques à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant 60 minutes pour tuer toutes les bactéries extracellulaires. </li><li> Lavez lamelles 3 fois en PBS,lyser et d&#39;énumérer par étalement sur TSA comme décrit pour le dosage d&#39;adhésion ci-dessus. </li><li> Dans certains cas il peut être préférable de visualiser compter le nombre de bactéries en utilisant la microscopie optique. Dans ce cas, et spécifiques à S. l&#39;invasion des cellules aureus, l&#39;utilisation lysostaphine (10 pg ml -1) au lieu de gentamicine de détruire physiquement les bactéries extracellulaires. </li><li> Incuber lamelles pendant 20min à 37 ° C en CO 2 dans la solution lysostaphine, puis rincez et fixer avec Cytopath (Cellpath). </li><li> Déluge les lamelles avec du cristal violet (0,5%, p / v) pendant 5 min. </li><li> Trempez-rincer à l&#39;eau, sécher à l&#39;air et monter sur des lames de verre. Le nombre de bactéries par mm 2 de confluence les cellules endothéliales peuvent être quantifiés en utilisant la microscopie optique. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: L&#39;expression de la fibronectine protéines de liaison (FnBPA et FnBPB) sur la surface de S. Staphylococcus confère la capacité d&#39;envahir les cellules endothéliales. Des travaux récents ont redéfini le domaine de liaison de la fibronectine FnBPA 3. De type sauvage (WT) S. Staphylococcus 8325,4 envahit les cellules endothéliales avec une grande efficacité, tout en manquant à la fois une souche FnBPA et B (Δ FNB) ont montré des niveaux significativement réduit d&#39;internalisation (figure 1A). La complémentation du mutant avec un plasmide codant pour la FNB a moins le domaine liant la fibronectine (pFnR0) n&#39;a pas favorisé l&#39;invasion (figure 1A). En revanche, la complémentation du mutant avec un plasmide codant pour la FNB ensemble un gène (pFnBA4) restaurés à des niveaux d&#39;invasion WT (figure 1A). Le rôle de FnBPA dans l&#39;invasion des cellules endothéliales peut également être démontrée en utilisant les lactis expression de l&#39;hôte hétérologue Lactococcus. Expression de plasmidique FnBPA dans L. lactis (pRM9 9) n&#39;a pas significativement améliorer l&#39;adhérence aux cellules endothéliales par rapport aux bactéries n&#39;exprimant pas FnBPA (CTL) (open bars, figure 1B). En revanche, FnBPA exprimant L. lactis ont envahi les cellules endothéliales à des niveaux sensiblement plus élevés que la souche non-exprimant (bars fermés, figure 1B). Des expériences ont été réalisées quatre fois en double et la moyenne ± écart type est présenté. * Représenter des données qui sont statistiquement significativement différent (p = &lt;0,05) de WT ou des valeurs de CTL. <img src="/files/ftp_upload/2693/2693fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Invasion de EA. Hy926 cellules endothéliales par S. aureus (A) ou L. lactis (B).

<ol>
	<li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization.">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).</li><li>Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+variation+of+the+opacity+outer+membrane+protein+controls+invasion+by+Neisseria+gonorrhoeae+into+human+epithelial+cells.">Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells.</a> EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).</li><li>Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+attach+to+human+fibronectin+through+a+tandem+beta-zipper.">Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper.</a> Nature. 423, 177-181 (2003).</li><li>Magoffin, R. L., Spink, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protection+of+intracellular+Brucella+against+streptomycin+alone+and+in+combination+with+other+antibiotics.">The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics.</a> J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).</li><li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+intraleukocytic+bacteria.">Interaction of intraleukocytic bacteria.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 52, 1673-1679 (1973).</li><li>Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gentamicin+antibacterial+activity+in+the+presence+of+human+polymorphonuclear+leukocytes.">Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).</li><li>De Melo, M. A., Pechere, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+mucin+on+Campylobacter+jejuni+association+and+invasion+on+HEp-2+cells.">Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells.</a> Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).</li><li>Shaw, J. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+invasion+of+human+tissue+culture+cells+by+Neisseria+gonorrhoeae.">Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).</li><li>Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Host+Cell+Invasion+and+Virulence+in+Sepsis+is+Facilitated+by+the+Multiple+Repeats+within+FnBPA.">Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA.</a> PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).</li><li>Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+invasion+of+a+human+oral+cell+line+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans.">Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans.</a> Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).</li><li>Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusobacterium+nucleatum+transports+noninvasive+Streptococcus+cristatus+into+human+epithelial+cells.">Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).</li><li>Menzies, B. E., Kourteva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+Staphylococcus+aureus+by+Endothelial+Cells+Induces+Apoptosis.">Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis.</a> Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).</li><li>Schr&#246;der, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+fibronectin+binding+protein-A+induces+motile+attachment+sites+and+complex+actin+remodeling+in+living+endothelial+cells.">Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).</li><li>Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells.">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li><li>Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pyogenes+serotype+M1+encodes+multiple+pathways+for+entry+into+human+epithelial+cells.">Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).</li><li>Eiff, C. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+small+colony+variants:+a+challenge+to+microbiologists+and+clinicians.">Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians.</a> Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).</li><li>Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-linked+kinase+is+an+essential+link+between+integrins+and+uptake+of+bacterial+pathogens+by+epithelial+cells.">Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).</li></ol>

<html> Le test que nous décrivons est basé sur le dosage de protection gentamicine, qui a été largement utilisée pour étudier l&#39;invasion des cellules hôtes par des bactéries. Observations de l&#39;incapacité des antibiotiques gentamicine et d&#39;autres pour tuer les bactéries intracellulaires ont été utilisés dans les premières études sur l&#39;invasion des cellules hôtes par les bactéries 4-8. L&#39;utilisation de 24, 48 ou même des plaques 96 puits permet la génération de grandes quantités de données quantitatives et reproductibles dans un court laps de temps et à un coût relativement faible. Le test est également intéressante, car elle ne nécessite aucun équipement spécialisé, il peut être adapté pour fonctionner avec diverses bactéries et les cellules, et peut être utilisée pour étudier le rôle des processus cellulaires bactériennes et d&#39;accueil dans l&#39;invasion 9. En effet, depuis les premiers essais, le dosage de protection de gentamicine a été largement utilisé pour mesurer l&#39;invasion de la cellule hôte par un éventail de bactéries différentes ou même des combinaisons de bactéries 10,11. Alors que les principes de base sont les mêmes, beaucoup de subtiles variations dans la méthode ont été rapportés. Dans cet article nous avons décrit notre version et indiqué où des modifications peuvent être nécessaires pour d&#39;autres bactéries ou des cellules hôtes. Lors de la conception d&#39;une expérience pour mesurer l&#39;invasion de la cellule hôte en utilisant cette approche il ya un certain nombre de points importants à considérer: La sensibilité des bactéries à la gentamicine. Cela peut sembler évident, mais il est important de s&#39;assurer que la bactérie étudiée est sensible à la gentamicine à la concentration, la température et sur ​​la durée du temps à être utilisé. Dans le cas d&#39;insensibilité, il peut être possible d&#39;utiliser d&#39;autres antibiotiques 5. Une approche alternative peut être d&#39;utiliser des enzymes lytiques (lysostaphine, mutanolysine, lysozyme) 12. L&#39;incubation et l&#39;inoculum. Lorsque vous effectuez ce test pour la première fois, il est important d&#39;établir le temps d&#39;incubation optimal et inoculum bactérien à être utilisé. Par conséquent, les premières expériences devraient examiner à la fois adhésion et d&#39;invasion dans le temps (5 min jusqu&#39;à 6 h). Il est également important d&#39;évaluer comment l&#39;invasion est affectée par la multiplicité d&#39;infection (MOI, le nombre de bactéries par cellule). En général, il est préférable d&#39;utiliser le moins de bactéries possible car cela permettra de réduire les dommages aux cellules cultivées. Des différences importantes entre les souches peuvent être manquées si les périodes d&#39;incubation prolongée ou inoculums importants sont utilisés 9,13. Les dommages cellulaires. Il est important de se laver les bactéries avant leur utilisation. Toutefois, les dommages cellulaires n&#39;est pas limitée à la production de toxines. L&#39;invasion bactérienne, l&#39;induction de l&#39;apoptose et la perturbation des fonctions cellulaires normales peuvent tous causer des dommages cellulaires. Cela peut conduire à la pénétration de la gentamicine dans la cellule, tuant les bactéries internalisées et donnant l&#39;impression que l&#39;invasion n&#39;a pas eu lieu 14. Les conditions d&#39;incubation. La température et la composition du milieu de culture peut avoir un impact significatif sur l&#39;invasion. Par exemple, l&#39;invasion des cellules HeLa par Streptococcus pyogenes est tributaire de la présence de fibronectine soluble, qui est généralement présente dans le sérum 15. Une autre considération est la croissance bactérienne dans le milieu de culture au cours de l&#39;expérience. Culture et quantification des bactéries intracellulaires. Bien TX-100 ne peut pas tuer les bactéries intracellulaires, il peut inhiber leur croissance. Comme tel, il est important de vérifier la réplication bactérienne sur un milieu solide, en présence du détergent. Où affectée, il peut être possible d&#39;utiliser des concentrations plus faibles de la lessive ou d&#39;utiliser une alternative comme la saponine. Un des avantages de l&#39;épreuve de protection de gentamicine sur la coloration au cristal violet et le dosage de microscopie est qu&#39;elle est moins laborieuse, et elle permet la détection et la différenciation des sous-populations de bactéries internalisées. Par exemple, S. aureus peut produire soit un type de colonie normale (TRN), ou la variante petite colonie (SCV) 16, qui ne serait pas distinguables par microscopie des cellules individuelles bactérienne. Un des avantages de la coloration au cristal violet et le dosage de microscopie sur le dosage de protection gentamicine est l&#39;agglutination de cellules peuvent être comptabilisées et que les bactéries intracellulaires qui entrent dans un «viables mais non cultivables&quot; état ​​sera détecté 17. Examiner le rôle des processus de la cellule hôte dans l&#39;invasion bactérienne. De nombreuses études ont utilisé des inhibiteurs de la fonction des cellules hôtes telles que la cytochalasine D, ce qui interfère avec réarrangement d&#39;actine. De telles études peuvent aussi inclure des anticorps qui ciblent les récepteurs de surface cellulaire et démontable siARN de gènes spécifiques 18. Il est extrêmement important de s&#39;assurer que ces traitements n&#39;affectent pas la viabilité ou la fixation des cellules en culture ou d&#39;avoir des effets toxiques sur les bactéries. Les orientations futures: ONTENU &quot;&gt; Parce que ce dosage est généralement effectuée dans les plaques multi-puits culture cellulaire, il est théoriquement possible de l&#39;adapter à une opération de criblage à haut débit, ce qui pourrait impliquer l&#39;examen des bibliothèques du potentiel des inhibiteurs de la fonction des cellules, des anti-infectieux ou antibiotiques conçus pour cibler des bactéries intracellulaires. Alternativement, une telle approche pourrait être utilisée pour cribler des bibliothèques mutant à identifier les gènes impliqués dans l&#39;adhésion, d&#39;invasion ou de survie intracellulaire. Dans certains cas, il peut être souhaitable d&#39;inclure les forces de cisaillement (flux) dans le système modèle, par exemple lors de la modélisation de l&#39;endothélium, pour mieux imiter l&#39;environnement in vivo. Les progrès actuels dans la conception et la fabrication de cellules d&#39;écoulement et de microfluidique systèmes de culture cellulaire de fournir la possibilité d&#39;employer le dosage de la protection de la gentamicine hôte-pathogène des modèles qui intègrent les forces de cisaillement. En résumé, le protocole décrit ici est basé sur des approches similaires utilisés depuis de nombreuses années. Il est largement applicable à de nombreux types de cellules cultivées et des espèces bactériennes et peut générer de grandes quantités de données rapidement et à un coût relativement peu.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31885-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Brain heart infusion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioChemika</td>
<td>53286</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10091-148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HUVECs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-2519</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Endothelial basal medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-3121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine brain extract (including heparin)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4092</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human endothelial growth factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4017C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrocortisone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4035C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GA-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4092C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lysostaphin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AMBI</td>
<td>LSPN-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermanox coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>TKT-210-330P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytopath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TCS Biosciences</td>
<td>HC8595</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Crystal violet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3886</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T75 flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>430641</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytochalasin D</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C2618</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl-B-cyclodextrin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>332615</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

invasion of human cells by a bacterial pathogen

Ici, nous allons décrire comment nous étudions l&#39;invasion des cellules endothéliales humaines par Staphylococcus aureus bactérie pathogène. Le protocole général peut être appliqué à l&#39;étude de l&#39;invasion des cellules par pratiquement toute bactérie cultivable. Les étapes au cours desquelles des aspects spécifiques de l&#39;invasion peut être étudiée, comme le rôle de réarrangement actine ou cavéoles, sera mis en surbrillance. Les cellules hôtes sont cultivées dans des fioles et quand prêt à l&#39;emploi sont ensemencées dans des plaques 24 puits contenant des lamelles Thermanox. En utilisant des lamelles permet l&#39;élimination ultérieure des cellules dans les puits pour réduire les interférences à partir de protéines de sérum déposé sur les côtés du puits (à laquelle S. aureus serait joindre). Les bactéries sont cultivées à la densité requise et lavées pour éliminer toutes les protéines sécrétées (par exemple les toxines). Lamelles avec des couches confluentes de cellules endothéliales sont transférées à de nouvelles plaques de 24 puits contenant du milieu de culture frais, avant l&#39;addition de bactéries. Les bactéries et les cellules sont ensuite incubées ensemble pour la quantité de temps requise à 5% de CO 2 à 37 ° C. Pour S. Staphylococcus ce n&#39;est généralement entre 15-90 minutes. Lamelles Thermanox sont retirés de chaque puits et dip-lavées dans du PBS pour éliminer les bactéries seules. Si le total de bactéries associées (adhérentes et intériorisé) doivent être quantifiés, des lamelles sont ensuite placés dans un endroit bien frais contenant 0,5% de Triton X-100 dans le PBS. Pipetage doux entraîne une lyse cellulaire complète et les bactéries sont énumérés par dilution en série et étalement sur gélose. Si le nombre de bactéries qui ont envahi les cellules est nécessaire, des lamelles sont ajoutés aux puits contenant 500 pl de milieu de culture tissulaire complété par la gentamicine et l&#39;incubation poursuivie pendant 1 h, ce qui va tuer toutes les bactéries externes. Lamelles peut ensuite être lavé, les cellules lysées et les bactéries énumérés par étalement sur gélose comme décrit ci-dessus. Si l&#39;expérience nécessite une visualisation directe, lamelles peuvent être fixées et colorées pour la microscopie optique, la fluorescence ou confocal ou préparés pour la microscopie électronique.

Watch this Scientific Journal Video about Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen at JoVE.com

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Un protocole général pour l&#39;étude de l&#39;invasion des cellules hôtes par une bactérie pathogène, en se concentrant sur<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Et des cellules endothéliales humaines.

L&#39;invasion des cellules humaines par une bactérie pathogène

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

invasion-of-human-cells-by-a-bacterial-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.6K vues.  University of Bath. Un protocole général pour l'étude de l'invasion des cellules hôtes par une bactérie pathogène, en se concentrant sur Staphylococcus aureus Et des cellules endothéliales humaines.

Vidéo: Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Application d&#39;une souris ligaturés Assay Peyer Patch anse intestinale pour évaluer absorption par les cellules bactériennes M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Recherche

Immunologie et infection

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

Schéma de flux de travail d&#39;une journée pour la détection de pathogènes et des bactéries tests de résistance antimicrobienne à partir d&#39;hémocultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell culture assays are performed under aerobic conditions, these in vitro models may not accurately represent the in vivo environment in which the host-pathogen interactions take place. We have developed an in vitro model of infection that permits the coculture of bacteria and host cells under different medium and gas conditions. The Vertical Diffusion Chamber (VDC) model mimics the conditions in the human intestine where bacteria will be under conditions of very low oxygen whilst tissue will be supplied with oxygen from the blood stream. Placing polarized intestinal epithelial cell (IEC) monolayers grown in Snapwell inserts into a VDC creates separate apical and basolateral compartments. The basolateral compartment is filled with cell culture medium, sealed and perfused with oxygen whilst the apical compartment is filled with broth, kept open and incubated under microaerobic conditions. Both Caco-2 and T84 IECs can be maintained in the VDC under these conditions without any apparent detrimental effects on cell survival or monolayer integrity. Coculturing experiments performed with different C. jejuni wild-type strains and different IEC lines in the VDC model with microaerobic conditions in the apical compartment reproducibly result in an increase in the number of interacting (almost 10-fold) and intracellular (almost 100-fold) bacteria compared to aerobic culture conditions1. The environment created in the VDC model more closely mimics the environment encountered by C. jejuni in the human intestine and highlights the importance of performing in vitro infection assays under conditions that more closely mimic the in vivo reality. We propose that use of the VDC model will allow new interpretations of the interactions between bacterial pathogens and host cells.

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Performing cell culture assays for investigating bacterial adhesion and invasion under aerobic conditions is usually unrepresentative of the in vivo environment. A Vertical Diffusion Chamber model allows study of interactions of the human pathogen Campylobacter jejuni with intestinal epithelial cells under more in vivo-like conditions, resulting in enhanced bacterial invasion.

Entérique invasion bactérienne des cellules épithéliales intestinales<em&gt; In Vitro</em&gt; Est considérablement améliorée en utilisant une chambre diffusion verticale du modèle

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imagerie RICL sécrétion d&#39;enquêter sur l&#39;infection cellulaire par le pathogène bactérien<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

Séparation automatique des<em&gt; C. elegans</em&gt; Façon variable colonisé par une bactérie pathogène

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

L&#39;évaluation de l&#39;Innate détection du VIH-1 CD4 infectés<sup&gt; +</sup&gt; Cellules T par les cellules dendritiques plasmacytoïdes Utilisation d&#39;un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de co-culture.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Évaluation de l’invasion bactérienne des cellules cardiaques en culture et colonisation cardiaque chez des souris infectées à l’aide de Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Génération et multi-phénotypique criblage à haut contenu de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants de transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Démêler la fonction d&#39;un effecteur bactérien à partir d&#39;un non-cultivable Pathogen usine utilisant une levure de l&#39;écran à deux hybrides

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.