حصاد exosome المخصب المتوسطة مكيفة من الخلايا المستزرعة في قارورة حيوية والعزلة من قبل sucrose وسادة فائقة التركيز يؤدي إلى إعداد الإزداد من ارتفاع الغلة مع الحد الأدنى من البروتينات الملوثة أو الحويصلات غير exosomal. باستخدام وسادة السكروز واحدة أعدت في أكسيد الديوتريوم يتحايل على إعداد شاقة من التدرج السكروز متقطع ويقلل من كمية السكروز اللازمة لتحقيق الكثافة المطلوبة. فعال في تسليم في المختبر من siRNA تغليف في exosomes أعدت في هذا البروتوكول يسلط الضوء على إمكانات هذا النظام كجيل جديد من العلاج التدخل الحمض النووي الريبي على أساس سرطان البنكرياس.
للبدء، الخلايا لثقافة HEK-293 في الوسط العادي، كما هو موضح في المخطوطة. توسيع الخلايا إلى أربع قارورة T75، وتنمو حتى تصل إلى 90٪التقاء. لإعداد قارورة مفاعل حيوي، إضافة 50 إلى 100 ملليلتر من المتوسط العادي في الخزان المتوسط من قارورة مفاعل حيوي لتبلل الغشاء.
جمع جميع خلايا HEK-293 من قارورة T75 الأربعة، وإعادة تعليقها في 15 ملليلتر من الوسيلة المنضبة exosome في أنبوب الطرد المركزي. ثم، استخدام حقنة 20 ملليلتر متصلة بإبرة تعبئة حادة لإضافة بعناية هذا التعليق الخلية إلى حجرة الخلية من قارورة مفاعل حيوي. ثم، ملء الخزان المتوسط من قارورة مفاعل حيوي مع المتوسطة العادية، تصل إلى 500 ملليلتر، واحتضانه في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوع.
بعد أسبوع واحد من الحضانة، وإزالة كل المتوسطة من خزان المتوسطة من قارورة مفاعل حيوي عن طريق صب بها. باستخدام حقنة 20 ملليلتر متصلة بإبرة تعبئة حادة، قم بإزالة كل الوسط من حجرة الخلية. ثم، إضافة 50 إلى 100 ملليلتر من المتوسط العادي إلى الخزان المتوسط و 15 ملليلتر من المتوسط الطازج المنضب إلى مقصورة الخلية باستخدام حقنة 20 ملليلتر متصلة بإبرة تعبئة حادة.
ثم، ملء الخزان المتوسط من قارورة مفاعل حيوي مع المتوسطة العادية تصل إلى 500 ملليلتر. احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوع آخر. لمسح مسبق المتوسطة المُحَطَّطة التي تم جمعها، يتمّ طرد مركزي عند 500 مرة ز لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
نقل المابير في أنبوب جديد، والتخلص من بيليه. بعد تكرار هذه الخطوة الطرد المركزي مع مستردة، استرداد عظمى مرة أخرى والتخلص من بيليه. ثم، الطرد المركزي مُسترد فوق في 2،000 مرات ز لمدة 15 دقيقة و أربع درجات مئوية.
الحفاظ على عظمى، والتخلص من بيليه. تصفية المابير مرة واحدة من خلال مرشح 22 ميكرومتر تعلق على حقنة 20 ملليلتر في أنبوب طرد مركزي جديد. وفي الوقت نفسه، لإعداد محلول السكروز 25٪في أكسيد الديوتيريوم، تزن بدقة 1.9 غرام من السكروز في أنبوب عالمي.
ثم يضاف أكسيد الديوتيريوم حتى يصل الوزن إلى 7.6 جرام. ثم، ملء أنبوب فائقة الوضوح مع 22.5 ملليلتر من المتوسطة مكيفة تطهيرها مسبقا. ضع ماصة زجاجية في الأنبوب.
إضافة ثلاثة ملليلتر من محلول السكروز من خلال ماصة بحيث يشكل الحل طبقة منفصلة تحت المتوسطة مكيفة. ضع الأنبوب الذي يحتوي على محلول متوسط / سكروز مكيف بالطبقات بعناية في دلو دوار متأرجح. تأمين دلو في الدوار.
ضع الدوار في الrifuge فائقة التركيز، وتدور في 100، 000 مرات ز في أربع درجات مئوية لمدة 1.5 ساعة. جمع ملليلترين من طبقة السكروز من الأنبوب، ملليلتر واحد في وقت واحد باستخدام ماصة P1000، مع طرف تعلق على طرف 10 ميكرولتر، وإضافته إلى زجاجة الطرد الفائق التي تحتوي على 20 ملليلتر من برنامج تلفزيوني تمت تصفيتها للغسيل. ضع الأنبوب في دوار ثابت الزاوية، وطاردة مركزية عند 100،000 مرة ز في أربع درجات مئوية لمدة 1.5 ساعة.
استخدام ماصة المصلية 10 ملليلتر لإزالة بعناية افرنح. Resuspend بيليه مع 400 microliters من برنامج تلفزيوني تمت تصفيتها. قبل البدء في الكهربة، قبل ابرد cuvette الكهربائي على الجليد لمدة 30 دقيقة.
اخلط سبعة ميكروجرامات من الإكسوسومات مع 33 ميكروغرام من الـ سيرنا في أنبوب ميكروسنتريفوغ. إضافة حمض الستريك العازلة لتحقيق حجم 150 ميكروليتر. يُضاف خليط الإزسوس-سيرنا إلى الكوفيت الكهربائي باستخدام ماصة بلاستيكية، وارفع الغطاء عن الكوفييت.
ضع الكوفيت في الاتجاه الصحيح في حامل cuvette من electroporator ، وتناوب عجلة الدوران من 180 درجة في اتجاه عقارب الساعة. حدد البرنامج المطلوب، واضغط على الزر ابدأ لبدء electroporation. سوف تشير الشاشة إلى نبضة ناجحة.
ثم، بدوره إلى الوراء عجلة 180 درجة عكس عقارب الساعة، وإزالة cuvette. استخدام ماصة بلاستيكية لإزالة العينة من cuvette في أنبوب جديد microcentrifuge. إبقاء أنبوب على الجليد أو في الثلاجة قبل مزيد من المعالجة، إذا لم تستخدم على الفور.
لبدء إزالة سرنا الحرة، وتمرير 3.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني تمت تصفيتها من خلال العمود الكروموغرافيا استبعاد حجم مرتين لتكميله. ثم، قم بحل 150 ميكرولترات من عينة كهربائية في 350 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني تمت تصفيتها، ونقلها إلى عمود لجنة الأوراق المالية والبورصة. جمع أول 500 ميكرولتر الكسر مائل من العمود في أنبوب microfuge، ووضع علامة على أنها F0. ثم ، إضافة 500 microliters من برنامج تلفزيوني تمت تصفيتها إلى العمود.
جمع الكسر التالي، ووضع علامة على أنه F1. كرر إضافة برنامج تلفزيوني وجمع كسور elution حتى يتم جمع ما مجموعه 10 500-microliter الكسور، أو حتى F9. وأخيراً، لإزالة أي بقايا عينة، قم بغسل العمود بمقسم PBS مرتين على الأقل، ثم تابع التجارب، كما هو موضح في المخطوطة. أظهر التحليل المورفولوجي باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال أن الهك-293 exosomes كانت هياكل كروية أكبر قليلا من 100 نانومتر.
هذه النتيجة تتفق مع ذلك من قياس تحليل تتبع الجسيمات النانوية ، والتي أظهرت أيضا حجم توزيع الاكسوسومات. وعلاوة على ذلك، كانت إيجابية لعلامات exosomal CD81، CD9، و CD63. تم حساب النسبة المئوية لاسترداد السوسات النقية باستخدام الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم والنسبة المئوية لاسترداد الرنا كما هو موضح في المخطوطة.
وكان الانتعاش بعد تنقية الإكسوسوم 75٪ باستخدام منحنى معيار سيرنا، وكفاءة تغليف سيرنا في الإكسوسيات كان يحسب ليكون حوالي 10 إلى 20٪ تحليل تدفق الخلايا cytometry النوعية من امتصاص في المختبر من exosomes محملة الفلورسنت Atto655-siRNA أظهرت أن الخلايا PANC-1 تعامل مع exosomes مغلفة من سيرنا كان أكبر تحول في الفلور. وقد تأكد ذلك من خلال النتيجة التي وجدت أن الخلايا PANC-1 المعالجة مع exosomes المغلفة من سيرنا سجلت نسبة أعلى من السكان إيجابية لإشارة Atto655 مقارنة بتلك المعالجة مع exosomes تفريغ وخليط سيرنا. وكان امتصاص الخلوية من سيرنا أيضا أعلى بكثير في خلايا PANC-1 تعامل مع exosomes سيرنا المغلفة مقارنة مع تلك المعالجة مع خليط اكسوزووم-سيرنا، مما يؤكد أن exosomes سيرنا مغلفة تم استيعابها من قبل الخلايا PANC-1 وأنها تسليم فعال سيرنا داخل الخلايا.
من المهم أن تزن السكروز وأكسيد الديوتيريوم بدقة شديدة عند إعداد محلول السكروز، ودائما استخدام محلول السكروز الطازج لتجنب تغيير الكثافة أثناء التخزين. يمكن إجراء المجهر Confocal من أجل مزيد من التحقق من استيعاب siRNA مغلفة في exosomes في الخلايا ودراسة الاتجار داخل الخلايا بعد امتصاص الخلوية. يسمح لنا هذا البروتوكول بتقييم الضربة القاضية الخاصة بالجينات من الـ siRNA التي يتم توصيلها بواسطة exosome وتعمل كأداة للتحقق من صحة الهدف الجديد في علاج السرطان القائم على تدخل الحمض النووي الريبي.
