وقدمت بسخاء البلازميد GFP - β - الأكتين من قبل الدكتور واين أور ، LSUHSC - S قسم علم الأمراض ، وتتضخم في مختبر الدكتور بيكي Worthylake ، LSUHSC - NO قسم الصيدلة. وأيد هذا العمل عن طريق المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (P20 RR - 018766) ، وجمعية القلب الأميركية (05835386N).

<ol>
	<li>Spindler, V., Schlegel, N., Waschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+GTPases+in+control+of+microvascular+permeability.">Role of GTPases in control of microvascular permeability.</a> Cardiovasc. Res. 87, 243-253 (2010).</li><li>Wojciak-Stothard, B., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+and+the+regulation+of+endothelial+permeability.">Rho GTPases and the regulation of endothelial permeability.</a> Vascul. Pharmacol. 39, 187-199 (2002).</li><li>Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+in+enhanced+microvascular+permeability.">Signal transduction pathways in enhanced microvascular permeability.</a> Microcirculation. 7, 395-403 (2000).</li><li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTPases+in+mechanosensitive+regulation+of+endothelial+barrier.">Small GTPases in mechanosensitive regulation of endothelial barrier.</a> Microvasc. Res. 77, 46-52 (2009).</li><li>Duran, W. N., Sanchez, F. A., Breslin, J. W., Tuma, R. F., Duran, W. N., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculatory+Exchange+Function.">Microcirculatory Exchange Function.</a> Handbook of Physiology: Microcirculation. , 81-124 (2008).</li><li>Hu, Y. L., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+motion+of+paxillin+on+actin+filaments+in+living+endothelial+cells.">Dynamic motion of paxillin on actin filaments in living endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 871-876 (2007).</li><li>Borm, B., Requardt, R. P., Herzog, V., Kirfel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+ruffles+in+cell+migration:+indicators+of+inefficient+lamellipodia+adhesion+and+compartments+of+actin+filament+reorganization.">Membrane ruffles in cell migration: indicators of inefficient lamellipodia adhesion and compartments of actin filament reorganization.</a> Exp. Cell. Res. 302, 83-95 (2005).</li><li>Hotulainen, P., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+fibers+are+generated+by+two+distinct+actin+assembly+mechanisms+in+motile+cells.">Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells.</a> J. Cell. Biol. 173, 383-394 (2006).</li><li>Pellegrin, S., Mellor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+stress+fibres.">Actin stress fibres.</a> J. Cell. Sci. 120, 3491-3499 (2007).</li><li>Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Actin dynamics in living mammalian cells.</a> J. Cell. Sci. 111, 1649-1658 (1998).</li><li>Helmke, B. P., Rosen, A. B., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+mechanical+strain+of+an+endogenous+cytoskeletal+network+in+living+endothelial+cells.">Mapping mechanical strain of an endogenous cytoskeletal network in living endothelial cells.</a> Biophys. J. 84, 2691-2699 (2003).</li><li>Birukova, A. A., Smurova, K., Birukov, K. G., Kaibuchi, K., Garcia, J. G., Verin, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Rho+GTPases+in+thrombin-induced+lung+vascular+endothelial+cells+barrier+dysfunction.">Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction.</a> Microvasc. Res. 67, 64-77 (2004).</li><li>van Nieuw Amerongen, G. P., van Delft, S., Vermeer, M. A., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+RhoA+by+thrombin+in+endothelial+hyperpermeability:+role+of+Rho+kinase+and+protein+tyrosine+kinases.">Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases.</a> Circ. Res. 87, 335-340 (2000).</li><li>Moy, A. B., Blackwell, K., Kamath, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+histamine+and+thrombin+on+endothelial+barrier+function+through+actin-myosin+tension.">Differential effects of histamine and thrombin on endothelial barrier function through actin-myosin tension.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282, H21-H29 (2002).</li><li>Wittman, T., Littlefield, R., Waterman-Storer, C., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeletal+dynamics+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy of cytoskeletal dynamics in living cells.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , 184-204 (2005).</li><li>Rabut, G., Ellenberg, J., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells:+FRAP,+iFRAP,+and+FLIP.">Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , 101-126 (2005).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

التصوير من GFP - الأكتين في الخلايا البطانية العيش يتيح تحليلا مفصلا لديناميات الهيكل الخلوي الأكتين استجابة لمحفزات للالتهابات. هذا الأسلوب قد يكون من المفيد أيضا للبناء على النتائج السابقة تبين إعادة تشكيل الهيكل الخلوي استجابة لقوى مادية مثل إجهاد القص 11. بالإضافة إلى ذلك ، هذا الأسلوب يسمح للتقييم مفصل للمساهمة الديناميات الأكتين هيكل الخلية لمختلف أنشطة الخلية البطانية ، بما في ذلك الهجرة ، والانقسام ، وتشكيل تقاطعات بين الخلايا وصلي النضج ، والحفاظ على وظيفة الحاجز. في البيانات الواردة ، يمكن ملاحظة سلوك الهيكل الخلوي الأكتين البطانية قبل وبعد العلاج مع ثرومبين. وقد لوحظت lamellipodia المحلية على طول حواف الخلايا البطانية تشكيل وتراجع مع مرور الزمن في كل من الخلية monolayers nonconfluent ومتموجة. المعاملة مع توقف لفترة وجيزة ثرومبين lamellipodia شكلأوجه ودوران. ثرومبين تسبب أيضا في الخلايا لعقد بقليل ، وذلك بالاتفاق مع التقارير السابقة التي ثرومبين أسباب تشكيل ألياف الأكتين الإجهاد وزيادة حدة التوتر جابذ التنمية في الخلايا البطانية 12-14. ومع ذلك ، يعيش من الدراسات التصويرية مثل هذه الخلية ، ويمكن الآن منشأ ألياف الإجهاد يتم تحديدها. في HUVEC ، أكثر من ألياف التوتر تنشأ في محيط الخلايا وألياف تشبه قوس عرضية في الخلايا المهاجرة 8 و 9. آخر قوة من هذا الأسلوب أكثر من استخدام الخلايا الثابتة التي يمكن كميا في عدد من ألياف التوتر في الخلايا الفردية قبل وبعد العلاج الثرومبين ، والقضاء على التحيز في الاختيار بين المجموعات التجريبية. مع هذا البروتوكول نقيم حركة ديناميكية من حافة الخلية وألياف الأكتين الإجهاد. لفهم ديناميات مونومر الأكتين في الخلايا البطانية ، وتقنيات أكثر تقدما مثل الانتعاش بعد مضان photobleaching (FRAP) أو مضان رقطة MICROSويمكن تطبيق نسخة (FSM) 15 ، 16. بالإضافة إلى ذلك ، لأنه قد الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة تمثل أفضل نموذج من وظيفة الاوعية الدموية الدقيقة الحاجز ، والتحسين من البروتوكولات ترنسفكأيشن بفعالية للتعبير عن GFP - الأكتين في الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة يمثل الاتجاه المستقبلي منطقية. في الموجز ، والتصوير من الخلايا البطانية يعيش معربا عن GFP - الأكتين يمثل أداة قوية لتحديد كيفية الأكتين الخلية البطانية الهيكل الخلوي يستجيب لأنواع مختلفة من المحفزات. وسوف تستخدم الدراسات monolayers البطانية متكدسة بإحكام مساعدة في تحديد أدوار هياكل دينامية مثل الأكتين الغنية lamellipodia والعرضي ألياف الإجهاد في وظيفة حاجز قوس البطانية. بالإضافة إلى ذلك ، سوف يعيش التصوير خلية من الخلايا البطانية معربا عن GFP - الأكتين أو البروتينات الانصهار الأخرى التي تسمح التصور الهياكل التحت خلوية أخرى تقدم معلومات مفصلة spatiotemporal اللازمة لفهم الإشارات والآليات الهيكلية التي دetermine حاجز النزاهة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> 1. الجرس أسهم 5X </td></tr><tr><td> مادة كيميائية </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> كمية </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> EMD </td><td> SX0420 - 3 </td><td> 35 ز </td></tr><tr><td> كلوريد البوتاسيوم </td><td> JT بيكر </td><td> 3040 </td><td> ز 1.75 </td></tr><tr><td> كلوريد الكالسيوم </td><td> سيغما </td><td> C - 3881 </td><td> ز 1.47 </td></tr><tr><td> كبريتات المغنيسيوم </td><td> سيغما </td><td> M - 9397 </td><td> ز 1.44 </td></tr><tr><td> معقمة الماء المصفى </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> جلب إلى 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> تصفية في زجاجات معقمة تعقيمها ومخازن في 4 درجات مئوية </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2. اجتماعات الأطراف العازلة </td></tr><tr><td> مادة كيميائية </td><td>شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> كمية </td></tr><tr><td> اجتماعات الأطراف </td><td> سيغما </td><td> M3183 </td><td> ز 125.6 </td></tr><tr><td> معقمة الماء المصفى </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> جلب إلى 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> تصفية في زجاجات معقمة تعقيمها ومخازن في 4 درجات مئوية </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3. ألبومين محلول الملح الفسيولوجي (هذه الخدمات) </td></tr><tr><td> مادة كيميائية </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> كمية </td></tr><tr><td> قذف الأسهم (5X) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 مل </td></tr><tr><td> المماسح العازلة </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td> فوسفات الصوديوم </td><td> سيغما </td><td> S - 9638 </td><td> 0،168 ز </td></tr><tr><td> البيروفات الصوديوم &lt;/ TD&gt; <td> سيغما </td><td> P5280 </td><td> ز 0.22 </td></tr><tr><td> الصوديوم EDTA الملح </td><td> سيغما </td><td> ED2SS </td><td> ز 0.0074 </td></tr><tr><td> جلوكوز </td><td> سيغما </td><td> G7528 </td><td> 0،901 ز </td></tr><tr><td> الزلال ، البقري </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 ز </td></tr><tr><td> معقمة الماء المصفى </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> جلب إلى 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 في 37 درجة مئوية ، ثم التصفية في زجاجات معقمة تعقيمها وتخزينها في 4 درجات مئوية. </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 4. 0.9 ٪ مالحة </td></tr><tr><td> مادة كيميائية </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> كمية </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> EMD </td><td> SX0420 - 3 </td><td> 9 ز </td></tr><tr><td> معقمة الماء المصفى </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> جلب إلى 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> تصفية في زجاجات معقمة تعقيمها ومخازن في 4 درجات مئوية </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5. الحل الجيلاتين 1.5 ٪ </td></tr><tr><td> الجيلاتين من جلد الخنزير </td><td> سيغما </td><td> G2500 </td><td> 15 ز </td></tr><tr><td> 0.9 ٪ مالحة </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> جلب إلى 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> دافئة الحل ل37 درجة مئوية لإذابة الجيلاتين بما فيه الكفاية. في حين لا تزال دافئة ، في زجاجات معقمة تصفية تعقيمها وتخزينها في 4 درجات مئوية </td></tr></tbody></table>

study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing gfp-actin

بطانة الاوعية الدموية الدقيقة تلعب دورا هاما كحاجز منفذة بشكل انتقائي للسوائل والأملاح. منعطفات لاصق بين الخلايا البطانية تنظيم نفاذية البطانة ، والعديد من الدراسات بينت أهمية المساهمة في الهيكل الخلوي الأكتين لتحديد سلامة صلي 1-5. ويعتقد أن الحزام الأكتين القشرية إلى أن تكون مهمة للحفاظ على استقرار تقاطعات 1 ، 2 ، 4 ، 5. في المقابل ، يعتقد أن ألياف الأكتين الإجهاد لتوليد الجاذبية التوتر داخل الخلايا البطانية التي تضعف تقاطعات 2-5. وقد استند جزء كبير من هذه النظرية على الدراسات التي تعامل بها مع الخلايا البطانية وسطاء التهابات معروفة لزيادة نفاذية البطانية ، ثم وتحديد الخلايا ووضع العلامات F - الأكتين لمراقبة مجهرية. ومع ذلك ، فإن هذه الدراسات توفر فهم محدود جدا من دور الهيكل الخلوي الأكتين لأن الصور من الخلايا الثابتة الوحيدة في تقديم لقطاتالوقت مع عدم وجود معلومات حول ديناميات الهياكل الأكتين 5. تعيش خلية التصوير يسمح بإدراج الطبيعة الديناميكية لالهيكل الخلوي الأكتين في دراسات لتحديد آليات البطانية سلامة الجدار. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه يمكن تقييم أثر المحفزات التهابات مختلفة في هياكل الأكتين في الخلايا البطانية في نفس مجموعة من الخلايا الحية قبل وبعد العلاج ، وإزالة التحيز المحتملة التي قد تحدث عند مراقبة عينات ثابتة. وtransfected خلايا بطانة الوريد السري (HUVEC) مع GFP - β - الأكتين البلازميد ونمت لالتقاء coverslips على الزجاج. يتم التقاط الصور مرور الزمن من GFP - الأكتين في HUVEC متموجة قبل وبعد إضافة وسطاء التهابات التي تثير التغيرات التي تعتمد على الوقت في نزاهة حاجز غشائي. هذه الدراسات تمكن الملاحظة البصرية لتسلسل السائل من التغييرات في الهيكل الخلوي الأكتين التي تسهم في بطائنل خلل الحاجز والترميم. نتائجنا تظهر باستمرار المحلية ، وتشكيل lamellipodia الأكتين الغنية ودوران في الخلايا البطانية. ويمكن أيضا تشكيل والحركة من ألياف الأكتين الإجهاد يمكن ملاحظتها. يمكن أن تكون موثقة تحليلا للتشكيل وتيرة دوران من lamellipodia المحلية ، قبل وبعد العلاج مع المثيرات التي يحلل kymograph التهابات. هذه الدراسات توفر معلومات هامة حول طبيعة ديناميكية الهيكل الخلوي الأكتين في الخلايا البطانية التي يمكن استخدامها لاكتشاف الآليات الجزيئية التي لم تحدد سابقا هامة للحفاظ على سلامة حاجز غشائي.

Watch this Scientific Journal Video about Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin at JoVE.com

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

التصوير المجهري للخلايا البطانية يعيش معربا عن GFP - الأكتين يسمح توصيف التغيرات الدينامية في الهياكل هيكل الخلية. على عكس التقنيات التي تستخدم عينات ثابتة ، وهذا الأسلوب يوفر تقييما مفصلا للتغيرات الزمنية في الهيكل الخلوي الأكتين في الخلايا نفسها قبل وأثناء وبعد مختلف المحفزات المادية والدوائية ، أو التهابات.

دراسة الهيكل الخلوي أكتين في الخلايا البطانية لايف تعرب عن GFP - أكتين

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

study-actin-cytoskeleton-live-endothelial-cells-expressing-gfp

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

SCIENTISTS IN ACTION

27.0K Views.  Louisiana State University Health Sciences Center. التصوير المجهري للخلايا البطانية يعيش معربا عن GFP - الأكتين يسمح توصيف التغيرات الدينامية في الهياكل هيكل الخلية. على عكس التقنيات التي تستخدم عينات ثابتة ، وهذا الأسلوب يوفر تقييما مفصلا للتغيرات الزمنية في الهيكل الخلوي الأكتين في الخلايا نفسها قبل وأثناء وب?...

Video: Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

الحاسوب خلق المحفزات الحيوان النموذجي

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

أكتين المشارك الترسيب الفحص ، وبالنسبة للتحليل البروتين ملزمة لF - أكتين

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

يعيش التصوير خلية من طراز F - أكتين حيوية عن طريق الميكروسكوب الرقطة نيون (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

يعيش التصوير في القدرة على الحركة والهيكل الخلوي أكتين خلية من الخلايا العصبية الفردية والخلايا العصبية في الأجنة كريست اسماك الزرد

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

زرع GFP - معربا عن Blastomeres للتصوير لايف التنمية الشبكية والدماغ في الجنين اسماك الزرد همي

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

افعل ذلك بنفسك جهاز لاستخراج العينات Cryopreserved سقطت سهوا في صهاريج التخزين المبردة

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

البطانية أنبوب تشكيل خلية الفحص ل<em&gt; في المختبر</em&gt; دراسة الأوعية الدموية

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...