Die GFP-β-Aktin Plasmid wurde freundlicherweise von Dr. Wayne Orr, LSUHSC-S Department of Pathology Verfügung gestellt und wurde im Labor von Dr. Becky Worthylake, LSUHSC-NO Department of Pharmacology verstärkt. Diese Arbeit wurde durch Mittel der National Institutes of Health (P20 RR-018766) und der American Heart Association (05835386N) unterstützt.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Bildgebung von GFP-Aktin in lebenden Endothelzellen ermöglicht eine detaillierte Analyse der Dynamik des Aktin-Zytoskeletts in Reaktion auf entzündliche Reize. Diese Methode kann auch nützlich sein, um auf frühere Ergebnisse zeigen Umbau des Zytoskeletts in Reaktion auf physikalische Kräfte wie Schubspannung 11 Build. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode eine detaillierte Bewertung des Beitrags von Aktin-Zytoskelett Dynamik zu verschiedenen Endothelzellen, einschließlich der Migration, der Mitose, die Bildung von interzellulären Verbindungen und junctional Reifung und Pflege der Barrierefunktion. In den Daten zeigt, kann das Verhalten des endothelialen Aktin-Zytoskeletts vor und nach der Behandlung mit Thrombin beobachtet werden. Lokale Lamellipodien alle an den Rändern von Endothelzellen beobachtet Umform-und Rückschritte im Laufe der Zeit in beiden nonconfluent und konfluierende Zellrasen. Die Behandlung mit Thrombin kurz unterbrochen Lamellipodien FormATION und Umsatz. Thrombin verursachte auch die Zellen mit einem leicht rückläufigen, in Übereinstimmung mit früheren Berichten, dass Thrombin Aktin Stress Faserbildung und erhöhte zentripetalen Zug der Entwicklung in Endothelzellen 12-14 Ursachen. Jedoch von Live Cell Imaging Studien wie diese, kann der Ursprung des Stress-Fasern nun ermittelt werden. In HUVEC, die meisten Stress-Fasern an der Zellperipherie stammen und ähneln quer arc Fasern in wandernden Zellen 8, 9. Eine weitere Stärke dieser Methode gegenüber der Verwendung fixierten Zellen ist, dass die Zahl der Stress-Fasern in einzelnen Zellen können vor und nach der Thrombin-Behandlung quantifiziert werden, sodass selection bias zwischen experimentellen Gruppen. Mit diesem Protokoll bewerten wir dynamische Bewegung der Zelle Rand und Aktin Stress-Fasern. Um Aktin Monomer Dynamik in Endothelzellen, fortgeschrittene Techniken wie die Fluoreszenz-Recovery verstehen nach Ausbleichen (FRAP) oder Fluoreszenz-Speckle-microscopy (FSM) können 15 aufgebracht werden, 16. Darüber hinaus, weil mikrovaskulären Endothelzellen darstellen können ein besseres Modell der mikrovaskulären Barrierefunktion, die Optimierung der Transfektion Protokolle effektiv auszudrücken GFP-Aktin in mikrovaskulären Endothelzellen stellt einen logischen zukünftige Richtung. Zusammenfassend stellt Imaging an lebenden Endothelzellen exprimieren GFP-Aktin ein mächtiges Werkzeug, um festzustellen, wie die Endothelzellen Aktin-Zytoskeletts, um verschiedene Arten von Stimuli reagiert. Studien mit eng konfluente Endothelzellen Monoschichten wird helfen, die Rolle des dynamischen Strukturen wie Aktin-reichen Lamellipodien und quer arc Stress Fasern in endothelialen Barrierefunktion. Darüber hinaus werden Live Cell Imaging von endothelialen Zellen, die GFP-Aktin oder anderen Fusionsproteine, die Visualisierung von anderen subzellulären Strukturen ermöglichen eine detaillierte raumzeitliche Informationen, die zur Signalisierung und strukturellen Mechanismen zu verstehen, dass determine Barriere Integrität.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 1. Ringer 5x Lager </td></tr><tr><td> Chemikalie </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Höhe </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Kaliumchlorid </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Calcium Chloride </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 g </td></tr><tr><td> Magnesium Sulfate </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Steriles gefiltertes Wasser </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bring to 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Sterile Filter in autoklaviert Flaschen und speichert bei 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2. MOPS-Puffer </td></tr><tr><td> Chemikalie </td><td>Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Höhe </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125,6 g </td></tr><tr><td> Steriles gefiltertes Wasser </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bring to 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Sterile Filter in autoklaviert Flaschen und speichert bei 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3. Albumin physiologischer Kochsalzlösung (APSS) </td></tr><tr><td> Chemikalie </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Höhe </td></tr><tr><td> Ringer Lager (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> MOPS-Puffer </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 mL </td></tr><tr><td> Sodium Phosphate </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 g </td></tr><tr><td> Natriumpyruvat &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA-Natriumsalz </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albumin, Bovine </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Steriles gefiltertes Wasser </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bring to 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Der pH-Wert auf 7,4 bei 37 ° C, dann Sterilfilter in autoklaviert Flaschen und lagern bei 4 ° C. </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 4. 0,9% Saline </td></tr><tr><td> Chemikalie </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Höhe </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 9 g </td></tr><tr><td> Steriles gefiltertes Wasser </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bring to 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Sterile Filter in autoklaviert Flaschen und speichert bei 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5. 1,5% Gelatine-Lösung </td></tr><tr><td> Gelatine aus Schweinehaut </td><td> Sigma </td><td> G2500 </td><td> 15 g </td></tr><tr><td> 0,9% Saline </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bring to 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Wärmen Sie die Lösung auf 37 ° C zu lösen Gelatine ausreichend. Während noch warm, Sterilfilter in autoklaviert Flaschen und lagern bei 4 ° C </td></tr></tbody></table>

study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing gfp-actin

Die mikrovaskuläre Endothel spielt eine wichtige Rolle als eine selektiv durchlässige Barriere gegen Flüssigkeiten und gelöste Stoffe. Der Klebstoff Übergänge zwischen Endothelzellen regulieren Permeabilität des Endothels, und viele Studien haben den wichtigen Beitrag des Aktin-Zytoskeletts auf die Bestimmung junctional Integrität 1-5 angegeben. Ein kortikalen Aktin-Gürtel wird angenommen, dass für die Aufrechterhaltung stabiler Verbindungen 1, 2, 4, 5 wichtig. Im Gegensatz dazu sind Aktin-Stress-Fasern gedacht, zentripetalen Spannungen innerhalb Endothelzellen, die Kreuzungen 2-5 schwächt generieren. Ein großer Teil dieser Theorie hat sich auf Studien, in denen Endothelzellen mit Entzündungsmediatoren bekannt endotheliale Permeabilität zu erhöhen behandelt werden, und dann Fixierung der Zellen und Kennzeichnung F-Aktin für die mikroskopische Beobachtung basiert. Allerdings liefern diese Studien ein sehr begrenztes Verständnis von der Rolle des Aktin-Zytoskeletts, weil Bilder von fixierten Zellen nur Momentaufnahmen liefern inZeit ohne Informationen über die Dynamik des Aktin-Strukturen 5. Live-Cell-Imaging ermöglicht Einbindung der dynamischen Natur des Aktin-Zytoskeletts in den Studien über die Mechanismen der Bestimmung endothelialen Barriere Integrität. Ein großer Vorteil dieser Methode ist, dass die Auswirkungen der verschiedenen entzündlichen Stimuli auf Aktin-Strukturen in Endothelzellen in die gleiche Gruppe von lebenden Zellen vor und nach der Behandlung beurteilt werden kann, Beseitigung möglicher Bias, die auftreten, wenn die Beobachtung fixierten Proben können. HUVEC-Zellen (HUVEC) mit einem GFP-β-Aktin transfiziert gewachsen und bis zur Konfluenz auf Deckgläschen. Zeitraffer-Bilder von GFP-Aktin in konfluenten HUVEC werden vor und nach der Zugabe von Entzündungsmediatoren, die zeitabhängige Veränderungen in endothelialen Barriere Integrität entlocken eingefangen. Diese Studien ermöglichen die visuelle Beobachtung der Flüssigkeit Folge von Veränderungen in der Aktin-Zytoskeletts, die Endothelien beitragenl Schrankenstörung und Restaurierung. Unsere Ergebnisse zeigen übereinstimmend, lokale, Aktin-reichen Lamellipodien Bildung und Umsatz in Endothelzellen. Die Bildung und Bewegung von Aktin-Stress-Fasern können auch beobachtet werden. Eine Analyse der Häufigkeit der Bildung und des Umsatzes des lokalen Lamellipodien, vor und nach der Behandlung mit entzündlichen Reizen kann durch Kymographion Analysen dokumentiert werden. Diese Studien liefern wichtige Informationen über die dynamische Natur des Aktin-Zytoskeletts in Endothelzellen, die verwendet werden, um bisher nicht identifizierten molekularen Mechanismen wichtig für die Aufrechterhaltung der endothelialen Barriere Integrität entdecken können.

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Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Mikroskopische Aufnahmen von Live-Endothelzellen exprimieren GFP-Aktin ermöglicht die Charakterisierung der dynamischen Veränderungen in Zytoskelettstrukturen. Im Gegensatz zu Techniken, die fixierten Proben verwenden, bietet diese Methode eine detaillierte Bewertung der zeitlichen Veränderungen in der Aktin-Zytoskelett in den gleichen Zellen vor, während und nach verschiedenen physikalischen, pharmakologischen oder entzündliche Reize.

Studie des Aktin-Zytoskeletts in Live Endothelial Cells, die GFP-Aktin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

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