Le plasmide GFP-β-actine a été généreusement fourni par le Dr Wayne Orr, LSUHSC-S Département de pathologie, et a été amplifié dans le laboratoire du Dr Becky Worthylake, LSUHSC-NO Département de pharmacologie. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (P20 RR-018 766) et l&#39;American Heart Association (05835386N).

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

L&#39;imagerie de la GFP-actine dans les cellules endothéliales en direct permet une analyse détaillée de la dynamique du cytosquelette d&#39;actine en réponse aux stimuli inflammatoires. Cette méthode peut également être utile de s&#39;appuyer sur les conclusions antérieures montrant remodelage du cytosquelette en réponse aux forces physiques comme la contrainte de cisaillement 11. En outre, cette méthode permet une évaluation détaillée de la contribution de la dynamique de l&#39;actine du cytosquelette à diverses activités de la cellule endothéliale, y compris la migration, la mitose, la formation des jonctions intercellulaires et la maturation jonctionnelle, et le maintien de la fonction de barrière. Dans les données présentées, le comportement du cytosquelette d&#39;actine endothéliales peuvent être observées avant et après traitement par la thrombine. Lamellipodes locale tout au long des bords des cellules endothéliales ont été observées former et régresse au fil du temps dans les monocouches de cellules à la fois nonconfluent et confluentes. Le traitement par la thrombine brièvement interrompu la forme lamellipodesation et le chiffre d&#39;affaires. La thrombine a également causé des cellules de se contracter légèrement, en accord avec les précédents rapports que la thrombine provoque la formation de fibres d&#39;actine stress et les tensions centripètes développement accru dans les cellules endothéliales 12-14. Cependant, à partir des études d&#39;imagerie des cellules vivantes de ce genre, l&#39;origine des fibres de stress peuvent désormais être déterminé. En HUVEC, la plupart des fibres de stress proviennent à la périphérie des cellules et des fibres ressemblent à l&#39;arc dans la migration de cellules transversales 8, 9. Une autre force de cette méthode sur l&#39;utilisation de cellules fixes est que le nombre de fibres de stress peuvent être quantifiés dans des cellules individuelles avant et après traitement de thrombine, en éliminant les biais de sélection entre les groupes expérimentaux. Avec ce protocole, nous évaluons le mouvement dynamique de la bordure des cellules et des fibres de stress d&#39;actine. Pour comprendre la dynamique de monomère d&#39;actine dans les cellules endothéliales, des techniques plus avancées telles que le recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) ou de fluorescence speckle microscopie (FSM) peut être appliquée 15, 16. En outre, parce cellules endothéliales microvasculaires peuvent représenter un meilleur modèle de la fonction de barrière microvasculaire, l&#39;optimisation des protocoles de transfection pour exprimer efficacement GFP-actine dans les cellules endothéliales microvasculaires représente une direction future logique. En résumé, l&#39;imagerie des cellules vivantes endothéliales exprimant la GFP-actine représente un outil puissant pour déterminer comment le cytosquelette d&#39;actine des cellules endothéliales répond à différents types de stimuli. Des études utilisant des monocouches confluentes étroitement endothéliales aideront à déterminer les rôles des structures dynamiques telles que l&#39;actine riches lamellipodes et transversale des fibres de stress d&#39;arc en fonction de la barrière endothéliale. En outre, imagerie des cellules vivantes des cellules endothéliales exprimant la GFP-actine ou d&#39;autres protéines de fusion qui permettent de visualiser d&#39;autres structures subcellulaires fournira des informations détaillées spatio-temporelle nécessaire pour comprendre la signalisation et les mécanismes structurels qui dintégrité de la barrière éterminer.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 1. Ringer stock 5x </td></tr><tr><td> Chimique </td><td> Société </td><td> Nombre de catalogue </td><td> Montant </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Chlorure de Potassium </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Chlorure de calcium </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 g </td></tr><tr><td> Sulfate de magnésium </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Stérile eau filtrée </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Porter à 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtre stérile dans des flacons à l&#39;autoclave et les magasins à 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2. Tampon MOPS </td></tr><tr><td> Chimique </td><td>Société </td><td> Nombre de catalogue </td><td> Montant </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125,6 g </td></tr><tr><td> Stérile eau filtrée </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Porter à 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtre stérile dans des flacons à l&#39;autoclave et les magasins à 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3. L&#39;albumine du sérum physiologique (APSS) </td></tr><tr><td> Chimique </td><td> Société </td><td> Nombre de catalogue </td><td> Montant </td></tr><tr><td> Ringer stock (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> Tampon MOPS </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Phosphate de sodium </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 g </td></tr><tr><td> Pyruvate de sodium &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> Sel de sodium EDTA </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Le glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> L&#39;albumine, bovine </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Stérile eau filtrée </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Porter à 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Ajuster le pH à 7,4 à 37 ° C, puis filtre stérile dans des flacons à l&#39;autoclave et conserver à 4 ° C. </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 4. Saline à 0,9% </td></tr><tr><td> Chimique </td><td> Société </td><td> Nombre de catalogue </td><td> Montant </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 9 g </td></tr><tr><td> Stérile eau filtrée </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Porter à 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtre stérile dans des flacons à l&#39;autoclave et les magasins à 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5. 1,5% une solution de gélatine </td></tr><tr><td> Gélatine de la peau de porc </td><td> Sigma </td><td> G2500 </td><td> 15 g </td></tr><tr><td> Saline à 0,9% </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Porter à 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Chauffer la solution à 37 ° C pour dissoudre la gélatine suffisamment. Alors qu&#39;il était encore chaud, filtre stérile dans des flacons à l&#39;autoclave et conserver à 4 ° C </td></tr></tbody></table>

study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing gfp-actin

L&#39;endothélium microvasculaire joue un rôle important comme une barrière sélective perméable aux fluides et des solutés. Les jonctions d&#39;adhérence entre les cellules endothéliales régulation de la perméabilité de l&#39;endothélium, et de nombreuses études ont montré la contribution importante du cytosquelette d&#39;actine à la détermination de l&#39;intégrité jonctionnelle 1-5. Une ceinture d&#39;actine corticale est pensé pour être important pour le maintien de la stabilité des jonctions 1, 2, 4, 5. En revanche, les fibres de stress d&#39;actine sont censés générer des tensions centripètes dans les cellules endothéliales qui affaiblit les jonctions 2-5. Une grande partie de cette théorie a été basée sur des études dans lesquelles les cellules endothéliales sont traités avec des médiateurs inflammatoires connus pour augmenter la perméabilité endothéliale, puis fixer les cellules et l&#39;étiquetage de F-actine à l&#39;observation microscopique. Cependant, ces études fournissent une compréhension très limitée du rôle du cytosquelette d&#39;actine, car des images de cellules fixes fournissent des instantanés seulement danstemps avec aucune information sur la dynamique des structures d&#39;actine 5. Imagerie des cellules vivantes permet l&#39;incorporation de la nature dynamique du cytosquelette d&#39;actine dans les études des mécanismes de détermination intégrité de la barrière endothéliale. Un avantage majeur de cette méthode est que l&#39;impact de divers stimuli inflammatoires sur les structures d&#39;actine dans les cellules endothéliales peuvent être évalués dans le même ensemble de cellules vivantes avant et après traitement, en supprimant le biais potentiel pouvant survenir lors de l&#39;observation des échantillons fixés. Les cellules humaines endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) sont transfectées avec GFP-β une actine plasmide et cultivées jusqu&#39;à confluence sur lamelles de verre. Time-lapse images de GFP-actine dans confluentes HUVEC sont capturés avant et après l&#39;ajout de médiateurs inflammatoires qui provoquent des changements dépendant du temps dans l&#39;intégrité de barrière endothéliale. Ces études permettent une observation visuelle de la séquence fluide de changements dans le cytosquelette d&#39;actine qui contribuent à des endothéliumsrupture de la barrière l et de restauration. Nos résultats montrent constamment locale, riche en actine formation de lamellipodes et le roulement dans les cellules endothéliales. La formation et le mouvement des fibres de stress d&#39;actine peuvent également être observés. Une analyse de la fréquence de la formation et la rotation de la section locale lamellipodes, avant et après traitement avec des stimuli inflammatoires peuvent être documentés par des analyses kymographe. Ces études fournissent des informations importantes sur la nature dynamique du cytosquelette d&#39;actine dans les cellules endothéliales qui peuvent servir à découvrir les mécanismes moléculaires non identifiés auparavant important pour le maintien de l&#39;intégrité barrière endothéliale.

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Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Imagerie microscopique des cellules endothéliales direct exprimant la GFP-actine permet la caractérisation des changements dynamiques dans les structures du cytosquelette. Contrairement aux techniques qui utilisent des échantillons fixés, cette méthode fournit une évaluation détaillée des changements temporels dans le cytosquelette d&#39;actine dans les mêmes cellules, avant, pendant, et après divers stimuli physiques, pharmacologiques ou inflammatoires.

Étude du cytosquelette d&#39;actine dans les cellules endothéliales en direct exprimant la GFP-actine

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

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26.9K vues.  Louisiana State University Health Sciences Center. Imagerie microscopique des cellules endothéliales direct exprimant la GFP-actine permet la caractérisation des changements dynamiques dans les structures du cytosquelette. Contrairement aux techniques qui utilisent des échantillons fixés, cette méthode fournit une évaluation détaillée des changements temporels dans le cytosquelette d'actine dans les mêmes cellules, avant, pendant, et après divers stimuli physiques, pharmacologiques ou inflammatoires.