O plasmídeo GFP-β-actina foi generosamente fornecidos pelo Dr. Wayne Orr, LSUHSC-S Departamento de Patologia, e foi amplificado no laboratório do Dr. Becky Worthylake, LSUHSC-NO Departamento de Farmacologia. Este trabalho foi financiado por concessões do National Institutes of Health (P20 RR-018766) e da American Heart Association (05835386N).

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Não há conflitos de interesse declarados.

A imagem de GFP-actina em células endoteliais ao vivo permite uma análise detalhada da dinâmica do citoesqueleto de actina em resposta a estímulos inflamatórios. Este método também pode ser útil para construir em cima descobertas anteriores que mostram remodelação do citoesqueleto em resposta às forças físicas, como tensão de cisalhamento 11. Além disso, este método permite uma avaliação detalhada da contribuição da dinâmica do citoesqueleto de actina para diversas atividades das células endoteliais, incluindo a migração, mitose, formação de junções intercelulares e maturação juncional, e manutenção da função de barreira. Nos dados apresentados, o comportamento do citoesqueleto de actina endotelial pode ser observado antes e após o tratamento com trombina. Lamellipodia locais, todos ao longo das bordas das células endoteliais foram observados formando e regredindo ao longo do tempo em monocamadas de células tanto nonconfluent e confluente. Tratamento com trombina brevemente interrompido forma lamellipodiação e volume de negócios. Trombina também causou as células a contrair-se ligeiramente, de acordo com relatos anteriores de que a trombina causas actina formação das fibras de estresse e desenvolvimento crescente tensão centrípeta nas células endoteliais 12-14. No entanto, a partir de estudos de células vivas de imagens como esta, a origem das fibras de estresse pode agora ser determinada. Em HUVEC, a maioria das fibras de estresse originam na periferia celular e assemelham-se fibras de arco transversal na migração de células 8, 9. Outro ponto forte deste método sobre o uso de células fixas é que o número de fibras de stress podem ser quantificados em células individuais antes e após o tratamento de trombina, eliminando o viés de seleção entre os grupos experimentais. Com este protocolo nós avaliamos movimento dinâmico da borda de células e fibras de stress de actina. Para entender a dinâmica de monômero de actina em células endoteliais, as técnicas mais avançadas, como a recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) ou fluorescência speckle microscópia (FSM) pode ser aplicado 15, 16. Além disso, como células endoteliais microvasculares pode representar um modelo melhor da função de barreira microvascular, otimização de protocolos de transfecção de efetivamente expressar GFP-actina em células endoteliais microvasculares representa uma direção futura lógica. Em resumo, a imagem latente de viver células endoteliais expressando GFP-actina representa uma ferramenta poderosa para determinar como o citoesqueleto de actina da célula endotelial responde a vários tipos de estímulos. Estudos utilizando fortemente confluentes monocamadas endotelial irá ajudar a determinar as funções de estruturas dinâmicas, tais como actina-ricos lamellipodia e fibras arco transversal estresse em função de barreira endotelial. Além disso, imagens de células vivas de células endoteliais expressando GFP-actina ou proteínas de fusão outras que permitem a visualização de outras estruturas subcelulares irá fornecer informações detalhadas espaço-temporal necessária para entender a sinalização e os mecanismos estruturais que determine integridade da barreira.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 1. Ringer stock 5x </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Cloreto de Potássio </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 g </td></tr><tr><td> Sulfato de magnésio </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Água filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Trazer para 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtro estéril em frascos autoclavados e lojas a 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2. Tampão MOPS </td></tr><tr><td> Químico </td><td>Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125,6 g </td></tr><tr><td> Água filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Trazer para 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtro estéril em frascos autoclavados e lojas a 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3. Solução Sal albumina Physiological (APSS) </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> Ringer estoque (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td> Tampão Mops </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 mL </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 g </td></tr><tr><td> Piruvato de sódio &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA sal de sódio </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albumina Bovina </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Água filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Trazer para 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Ajustar o pH para 7,4 a 37 ° C, seguida de filtração estéril em frascos autoclavados e armazenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 4. Saline 0,9% </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 9 g </td></tr><tr><td> Água filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Trazer para 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtro estéril em frascos autoclavados e lojas a 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5. 1,5% Solução Gelatina </td></tr><tr><td> Gelatina de pele suína </td><td> Sigma </td><td> G2500 </td><td> 15 g </td></tr><tr><td> Saline 0,9% </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Trazer para 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Aquecer a solução a 37 ° C para dissolver a gelatina suficientemente. Enquanto ainda quente filtro, estéril em frascos autoclavados e armazenar a 4 ° C </td></tr></tbody></table>

study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing gfp-actin

O endotélio microvascular desempenha um papel importante como uma barreira seletiva permeável a fluidos e solutos. As junções adesivas entre as células endoteliais regulam a permeabilidade do endotélio, e muitos estudos têm indicado a importante contribuição do citoesqueleto de actina para determinar a integridade juncional 1-5. Um cinto de actina cortical é pensado para ser importante para a manutenção das junções estável 1, 2, 4, 5. Em contraste, as fibras de estresse actina são pensados ​​para gerar tensão centrípeta no interior das células endoteliais que enfraquece junções 2-5. Grande parte desta teoria foi baseada em estudos em que as células endoteliais são tratados com mediadores inflamatórios conhecidos por aumentar a permeabilidade endotelial e fixação das células e rotulagem F-actina para observação microscópica. No entanto, estes estudos fornecem uma compreensão muito limitada do papel do citoesqueleto de actina porque as imagens de células fixos proporcionam snapshots apenas emtempo com nenhuma informação sobre a dinâmica das estruturas de actina 5. Live-célula de imagem permite a incorporação da natureza dinâmica do citoesqueleto de actina nos estudos dos mecanismos de determinação integridade da barreira endotelial. Uma grande vantagem deste método é que o impacto de vários estímulos inflamatórios em estruturas de actina em células endoteliais pode ser avaliada no mesmo conjunto de células vivas, antes e após o tratamento, a remoção viés potencial que podem ocorrer quando se observa os espécimes fixos. Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) são transfectadas com GFP-β-actina plasmídeo e cresceu para confluência em lamínulas. Lapso de tempo imagens de GFP-actina em HUVEC confluentes são capturados antes e após a adição de mediadores inflamatórios que provocam mudanças dependentes do tempo na integridade da barreira endotelial. Estes estudos permitem a observação visual da seqüência fluida de mudanças no citoesqueleto de actina, que contribuem para endotéliol rompimento da barreira e restauração. Nossos resultados mostram consistentemente local, rico em actina lamellipodia formação e volume de negócios nas células endoteliais. A formação e movimento das fibras de actina estresse também pode ser observado. Uma análise da frequência de formação e volume de negócios do lamellipodia local, antes e após o tratamento com estímulos inflamatórios podem ser documentadas por meio de análises quimógrafo. Estes estudos fornecem informações importantes sobre a natureza dinâmica do citoesqueleto de actina em células endoteliais, que pode ser usado para descobrir previamente não identificados mecanismos moleculares importantes para a manutenção da integridade da barreira endotelial.

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Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Imagens microscópicas de vida das células endoteliais expressando GFP-actina permite a caracterização de mudanças dinâmicas em estruturas do citoesqueleto. Ao contrário das técnicas que utilizam amostras fixadas, este método fornece uma avaliação detalhada das mudanças temporais no citoesqueleto de actina nas mesmas celas antes, durante e depois de vários estímulos físicos, farmacológicos, ou inflamatórias.

Estudo do citoesqueleto de actina em Live Células Endoteliais Expressando GFP-Actina

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

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27.0K visualizações.  Louisiana State University Health Sciences Center. Imagens microscópicas de vida das células endoteliais expressando GFP-actina permite a caracterização de mudanças dinâmicas em estruturas do citoesqueleto. Ao contrário das técnicas que utilizam amostras fixadas, este método fornece uma avaliação detalhada das mudanças temporais no citoesqueleto de actina nas mesmas celas antes, durante e depois de vários estímulos físicos, farmacológicos, ou inflamatórias.