GFP -β-アクチンプラスミドは、寛大に博士ウェインオアー、病理学のLSUHSC - S部門によって提供された、と博士はベッキーWorthylake、薬理学のLSUHSC - NO学科の研究室で増幅した。この作品は、国立衛生研究所（P20 RR - 018766）とアメリカ心臓協会（05835386N）からの補助金によって支えられている。

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利害の衝突は宣言されません。

生内皮細胞におけるGFP -アクチンのイメージングは​​、炎症性刺激に反応してアクチン細胞骨格のダイナミクスの詳細な分析が可能になります。また、このメソッドは、せん断応力11のように物理的な力に反応して細胞骨格のリモデリングを示すこれまでの知見に基づいて構築すると便利な場合があります。さらに、この方法は、マイグレーション、有糸分裂、細胞間接合部と接合部の成熟の形成、及びバリア機能の維持など、さまざまな内皮細胞の活動へのアクチン細胞骨格の動態の寄与の詳細な評価が可能になります。 示されたデータでは、内皮のアクチン細胞骨格の挙動は、トロンビンによる治療前後で観察することができます。すべての内皮細胞の縁に沿って地元の葉状仮足を形成し、非融合と合流両方の細胞の単層で時間をかけて回帰が観察された。トロンビンによる治療は一時的に葉状仮足の形を中断ationと離職。トロンビンはまた、トロンビンは内皮細胞12-14にアクチンストレスファイバーの形成と増加求心張力発生を引き起こすことが以前の報告と一致して、細胞がわずかに縮小していました。しかし、このような生細胞イメージング研究から、ストレスファイバーの起源は、今決定することができます。 HUVECにおいては、ストレスファイバーのほとんどは、細胞の周囲に発信し、細胞の8,9の移行に横アーク繊維に似ている。固定された細胞を使用する場合に比べてこの方法のもう一つの強みは、ストレスファイバーの数は、実験群の間で選択バイアスを排除し、トロンビンの治療の前と後の個々の細胞で定量化できることです。 このプロトコルでは、セルのエッジとアクチンストレスファイバーの動的な動きを評価する。内皮細胞でのアクチンの単量体のダイナミクスを理解するために、このような蛍光退色後回復（FRAP）や蛍光などのより高度な技術がマイクロスペックルコピー（FSM）は、16、15を適用することができます。微小血管内皮細胞は微小血管のバリア機能のより良いモデルを表すことができるので、さらに、効果的に微小血管内皮細胞にGFP -アクチンを発現するようにトランスフェクションプロトコールの最適化は論理的な将来の方向を表します。 要約すると、GFP -アクチンを発現している生内皮細胞のイメージングは​​、内皮細胞のアクチン細胞骨格は、刺激の様々なタイプに応答する方法を決定する強力なツールを表します。しっかりと密内皮単層を用いた研究は、このようなアクチンに富んだ葉状仮足および内皮バリア機能の横アークストレスファイバーなどの動的構造の役割を決定するのに役立ちます。さらに、GFP -アクチンまたは他の細胞内構造の可視化を可能にする他の融合タンパク質を発現する内皮細胞の生細胞イメージングでは、シグナリングと構造的なメカニズムを理解するために必要な詳細な時空間情報を提供することをDetermineバリアの完全性。

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 1。リンガー5倍証券 </td></tr><tr><td> 化学 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 量は </td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td> EMD </td><td> SX0420 - 3 </td><td> 35グラム</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> JTベーカー</td><td> 3040 </td><td> 1.75グラム</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマ</td><td> C - 3881 </td><td> 1.47グラム</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>シグマ</td><td> M - 9397 </td><td> 1.44グラム</td></tr><tr><td>滅菌ろ過された水</td><td> N / </td><td> N / </td><td> 1 Lへ移動</td></tr><tr><td colspan="4"> 4℃オートクレーブボトルや店舗に滅菌フィルターは、° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2。 MOPSバッファー </td></tr><tr><td> 化学 </td><td>会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 量は </td></tr><tr><td> MOPS </td><td>シグマ</td><td> M3183 </td><td> 125.6グラム</td></tr><tr><td>滅菌ろ過された水</td><td> N / </td><td> N / </td><td> 1 Lへ移動</td></tr><tr><td colspan="4"> 4℃オートクレーブボトルや店舗に滅菌フィルターは、° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3。アルブミン生理食塩水（APSS） </td></tr><tr><td> 化学 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 量は </td></tr><tr><td>リンガー株式（5倍） </td><td> N / </td><td> N / </td><td> 200 mLの</td></tr><tr><td> MOPS緩衝液</td><td> N / </td><td> N / </td><td> 5 mLの</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S - 9638 </td><td> 0.168グラム</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム&lt;/ TD&gt; <td>シグマ</td><td> P5280 </td><td> 0.22グラム</td></tr><tr><td> EDTAのナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td> ED2SS </td><td> 0.0074グラム</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ</td><td> G7528 </td><td> 0.901グラム</td></tr><tr><td>アルブミン、ウシ</td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10グラム</td></tr><tr><td>滅菌ろ過された水</td><td> N / </td><td> N / </td><td> 1 Lへ移動</td></tr><tr><td colspan="4"> 37 7.4にpHを調整° C、4℃オートクレーブボトルや店舗にして滅菌フィルター℃に</td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 4。 0.9％生理食塩水 </td></tr><tr><td> 化学 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 量は </td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td> EMD </td><td> SX0420 - 3 </td><td> 9グラム</td></tr><tr><td>滅菌ろ過された水</td><td> N / </td><td> N / </td><td> 1 Lへ移動</td></tr><tr><td colspan="4"> 4℃オートクレーブボトルや店舗に滅菌フィルターは、° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5。 1.5パーセントゼラチン溶液 </td></tr><tr><td>ブタの皮からゼラチン</td><td>シグマ</td><td> G2500 </td><td> 15グラム</td></tr><tr><td> 0.9％生理食塩水</td><td> N / </td><td> N / </td><td> 1 Lへ移動</td></tr><tr><td colspan="4"> ° C十分にゼラチン溶解するために37にソリューションを温める。一方、4℃オートクレーブ滅菌ボトルとストアにまだ温かい、滅菌フィルター° C </td></tr></tbody></table>

study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing gfp-actin

微小血管内皮細胞は、流体と溶質の選択的透過性障壁として重要な役割を果たしている。内皮細胞間の接着剤接合は、内皮の透過性を調節し、そして多くの研究では、接合部の整合性1-5を決定するために、アクチン細胞骨格の重要な貢献を示している。皮質アクチンのベルトは、安定した接合部1、2、4、5の維持に重要であると考えられている。対照的に、アクチンストレスファイバーは接合2-5を弱める内皮細胞内の求心緊張を生成すると考えられている。ずっとこの理論のは内皮細胞が血管内皮透過性を高めるために知られている炎症性メディエーターで処理し、細胞を固定し、顕微鏡観察のためにF -アクチンのラベル付けされた研究に基づいている。に固定された細胞の画像のみスナップショットを提供するため、しかし、これらの研究は、アクチン細胞骨格の役割を非常に限られた理解を提供するアクチンの構造5のダイナミクスに関する情報がないと時間。 生きた細胞のイメージングは​​、内皮障壁の完全性を決定するメカニズムの研究にアクチン細胞骨格の動的な性質に取り込むことができます。この方法の大きな利点は、内皮細胞でのアクチンの構造上の様々な炎症性刺激の影響は、固定標本を観察するときに発生する可能性のある潜在的なバイアスを除去する、治療前と後の生細胞の同じセットで評価することができるということです。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）をプラスミドGFP -β-アクチンをトランスフェクションし、ガラスのカバースリップ上でコンフルエンスまで増殖されています。コンフルエントHUVECにおけるGFP -アクチンの時間経過の画像は、内皮障壁の完全性の時間依存性の変化を誘導する炎症性メディエーターを添加する前と後にキャプチャされます。これらの研究は、内皮に貢献するアクチン細胞骨格の変化の流体シーケンスの視覚的な観察が可能lのバリアの破壊と修復。 我々の結果は一貫して内皮細胞の局所、アクチン豊富な葉状仮足の形成と売上高を示しています。アクチンストレスファイバーの形成と動きも観察することができます。炎症性刺激による治療の前と後のローカル葉状仮足の形成やターンオーバーの頻度の分析は、カイモグラフ解析によって文書化することができます。これらの研究は、内皮障壁の完全性の維持のための重要な以前に正体不明の分子機構を発見するために使用することができる内皮細胞におけるアクチン細胞骨格の動的な性質に関する重要な情報を提供しています。

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Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

GFP -アクチンを発現している生内皮細胞の顕微鏡イメージングは​​、細胞骨格構造の動的変化の特性評価が可能になります。固定標本​​を使用する技法とは異なり、この方法は前と同じ細胞内のアクチン細胞骨格の時間的変化の詳細な評価、中、および様々な物理的、薬理学的、または炎症性刺激の後にしています。

GFP -アクチンを発現するライブ内皮細胞におけるアクチン細胞骨格の研究

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

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26.9K ビュー.  Louisiana State University Health Sciences Center. GFP -アクチンを発現している生内皮細胞の顕微鏡イメージングは​​、細胞骨格構造の動的変化の特性評価が可能になります。固定標本​​を使用する技法とは異なり、この方法は前と同じ細胞内のアクチン細胞骨格の時間的変化の詳細な評価、中、および様々な物理的、薬理学的、または炎症性刺激の後にしています。