La GFP-β-actina plasmide è stato generosamente offerto dal Dr. Wayne Orr, LSUHSC-S Dipartimento di Patologia, ed è stato amplificato nel laboratorio del Dr. Becky Worthylake, LSUHSC-NO Dipartimento di Farmacologia. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health (P20 RR-018766) e l&#39;American Heart Association (05835386N).

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	<li>Spindler, V., Schlegel, N., Waschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+GTPases+in+control+of+microvascular+permeability.">Role of GTPases in control of microvascular permeability.</a> Cardiovasc. Res. 87, 243-253 (2010).</li><li>Wojciak-Stothard, B., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+and+the+regulation+of+endothelial+permeability.">Rho GTPases and the regulation of endothelial permeability.</a> Vascul. Pharmacol. 39, 187-199 (2002).</li><li>Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+in+enhanced+microvascular+permeability.">Signal transduction pathways in enhanced microvascular permeability.</a> Microcirculation. 7, 395-403 (2000).</li><li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+GTPases+in+mechanosensitive+regulation+of+endothelial+barrier.">Small GTPases in mechanosensitive regulation of endothelial barrier.</a> Microvasc. Res. 77, 46-52 (2009).</li><li>Duran, W. N., Sanchez, F. A., Breslin, J. W., Tuma, R. F., Duran, W. N., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculatory+Exchange+Function.">Microcirculatory Exchange Function.</a> Handbook of Physiology: Microcirculation. , 81-124 (2008).</li><li>Hu, Y. L., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+motion+of+paxillin+on+actin+filaments+in+living+endothelial+cells.">Dynamic motion of paxillin on actin filaments in living endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 871-876 (2007).</li><li>Borm, B., Requardt, R. P., Herzog, V., Kirfel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+ruffles+in+cell+migration:+indicators+of+inefficient+lamellipodia+adhesion+and+compartments+of+actin+filament+reorganization.">Membrane ruffles in cell migration: indicators of inefficient lamellipodia adhesion and compartments of actin filament reorganization.</a> Exp. Cell. Res. 302, 83-95 (2005).</li><li>Hotulainen, P., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+fibers+are+generated+by+two+distinct+actin+assembly+mechanisms+in+motile+cells.">Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells.</a> J. Cell. Biol. 173, 383-394 (2006).</li><li>Pellegrin, S., Mellor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+stress+fibres.">Actin stress fibres.</a> J. Cell. Sci. 120, 3491-3499 (2007).</li><li>Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Actin dynamics in living mammalian cells.</a> J. Cell. Sci. 111, 1649-1658 (1998).</li><li>Helmke, B. P., Rosen, A. B., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+mechanical+strain+of+an+endogenous+cytoskeletal+network+in+living+endothelial+cells.">Mapping mechanical strain of an endogenous cytoskeletal network in living endothelial cells.</a> Biophys. J. 84, 2691-2699 (2003).</li><li>Birukova, A. A., Smurova, K., Birukov, K. G., Kaibuchi, K., Garcia, J. G., Verin, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Rho+GTPases+in+thrombin-induced+lung+vascular+endothelial+cells+barrier+dysfunction.">Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction.</a> Microvasc. Res. 67, 64-77 (2004).</li><li>van Nieuw Amerongen, G. P., van Delft, S., Vermeer, M. A., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+RhoA+by+thrombin+in+endothelial+hyperpermeability:+role+of+Rho+kinase+and+protein+tyrosine+kinases.">Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases.</a> Circ. Res. 87, 335-340 (2000).</li><li>Moy, A. B., Blackwell, K., Kamath, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+histamine+and+thrombin+on+endothelial+barrier+function+through+actin-myosin+tension.">Differential effects of histamine and thrombin on endothelial barrier function through actin-myosin tension.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282, H21-H29 (2002).</li><li>Wittman, T., Littlefield, R., Waterman-Storer, C., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeletal+dynamics+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy of cytoskeletal dynamics in living cells.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , 184-204 (2005).</li><li>Rabut, G., Ellenberg, J., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells:+FRAP,+iFRAP,+and+FLIP.">Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , 101-126 (2005).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;imaging di GFP-actina in cellule endoteliali consente di vivere una dettagliata analisi delle dinamiche del citoscheletro di actina in risposta a stimoli infiammatori. Questo metodo può essere utile anche a sviluppare i risultati precedenti che mostrano rimodellamento del citoscheletro in risposta a forze fisiche come lo stress di taglio 11. Inoltre, questo metodo permette una valutazione dettagliata del contributo delle dinamiche di actina del citoscheletro a diverse attività delle cellule endoteliali, compresa la migrazione, la mitosi, la formazione di giunzioni intercellulari e maturazione giunzionale, e il mantenimento della funzione di barriera. Nei dati riportati, il comportamento del citoscheletro di actina endoteliali possono essere osservati prima e dopo il trattamento con trombina. Lamellipodia locali tutti lungo i bordi delle cellule endoteliali è stata osservata formazione e regredire nel tempo in monostrati cellulari sia nonconfluent e confluenti. Il trattamento con trombina interrotto brevemente forma lamellipodiazione e fatturato. La trombina anche causato alle cellule di contratto leggermente, in accordo con i rapporti precedenti che lo stress provoca la formazione di trombina in fibra di actina e il rafforzamento dello sviluppo centripeto tensione nelle cellule endoteliali 12-14. Tuttavia, da studi di imaging dal vivo delle cellule di questo tipo, l&#39;origine delle fibre di stress può essere determinato. In HUVEC, la maggior parte delle fibre di stress origine alla periferia delle cellule e fibre assomigliano arco trasversale nella migrazione delle cellule 8, 9. Altro punto di forza di questo metodo rispetto all&#39;uso di cellule fissa è che il numero di fibre di stress può essere quantificato in celle individuali prima e dopo il trattamento trombina, eliminando bias di selezione tra i gruppi sperimentali. Con questo protocollo si valuta il movimento dinamico del bordo delle cellule e le fibre di stress di actina. Per capire le dinamiche monomero di actina in cellule endoteliali, le tecniche più avanzate, come il recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) o fluorescenza speckle microcopia (FSM) può essere applicato 15, 16. Inoltre, poiché cellule endoteliali possono rappresentare un modello migliore della funzione di barriera microvascolare, l&#39;ottimizzazione dei protocolli di trasfezione per esprimere efficacemente GFP-actina in cellule endoteliali rappresenta una direzione logica futuro. In sintesi, l&#39;imaging dal vivo di cellule endoteliali che esprimono GFP-actina rappresenta un potente strumento per determinare come il citoscheletro delle cellule endoteliali risponde a vari tipi di stimoli. Gli studi che utilizzano monostrati endoteliali strettamente confluenti aiuterà a determinare i ruoli delle strutture dinamiche come actina-lamellipodia ricco e trasversale delle fibre arco stress in funzione di barriera endoteliale. Inoltre, l&#39;imaging cellulare dal vivo delle cellule endoteliali che esprimono GFP-actina o altre proteine ​​di fusione che consentono la visualizzazione di altre strutture subcellulari fornirà dettagliate informazioni spazio-temporali necessarie per comprendere i meccanismi di segnalazione e strutturali che determine barriera integrità.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 1. Suoneria Archivi 5x </td></tr><tr><td> Chimico </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Cloruro di potassio </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Cloruro di calcio </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 g </td></tr><tr><td> Solfato di Magnesio </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Acqua sterile filtrata </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Portare a 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtro sterile in bottiglie in autoclave e negozi a 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2. MOPS buffer di </td></tr><tr><td> Chimico </td><td>Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125,6 g </td></tr><tr><td> Acqua sterile filtrata </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Portare a 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtro sterile in bottiglie in autoclave e negozi a 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3. Albumina soluzione fisiologica (APSS) </td></tr><tr><td> Chimico </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> Ringer magazzino (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td> Mops Buffer </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 mL </td></tr><tr><td> Fosfato di sodio </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 g </td></tr><tr><td> Piruvato di sodio &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA sale di sodio </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albumina, bovina </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Acqua sterile filtrata </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Portare a 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Regolare il pH a 7,4 a 37 ° C, poi filtro sterile in bottiglia in autoclave e conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 4. 0,9% Saline </td></tr><tr><td> Chimico </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 9 g </td></tr><tr><td> Acqua sterile filtrata </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Portare a 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtro sterile in bottiglie in autoclave e negozi a 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5. 1,5% Soluzione di gelatina </td></tr><tr><td> Gelatina da pelle del maiale </td><td> Sigma </td><td> G2500 </td><td> 15 g </td></tr><tr><td> 0,9% Saline </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Portare a 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Caldo la soluzione a 37 ° C per sciogliere la gelatina a sufficienza. Mentre sono ancora calde, filtro sterile in bottiglie in autoclave e conservare a 4 ° C </td></tr></tbody></table>

study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing gfp-actin

L&#39;endotelio microvascolare svolge un ruolo importante come una barriera selettiva permeabile ai fluidi e soluti. Le giunzioni adesive tra cellule endoteliali regolano la permeabilità dell&#39;endotelio, e molti studi hanno indicato l&#39;importante contributo del citoscheletro a determinare l&#39;integrità giunzionale 1-5. Una cintura di actina corticale è pensato per essere importante per il mantenimento di stabili svincoli 1, 2, 4, 5. Al contrario, lo stress delle fibre di actina sono pensati per generare tensione centripeta all&#39;interno delle cellule endoteliali che indebolisce giunzioni 2-5. Gran parte di questa teoria si è basata su studi in cui sono trattate le cellule endoteliali con i mediatori infiammatori noti per aumentare la permeabilità endoteliale, e poi fissare le cellule e l&#39;etichettatura di F-actina per l&#39;osservazione microscopica. Tuttavia, questi studi forniscono una comprensione molto limitata del ruolo del citoscheletro delle cellule perché le immagini fisse fornire istantanee solo neltempo con nessuna informazione sulla dinamica delle strutture actina 5. Live-cell imaging consente l&#39;incorporazione della natura dinamica del citoscheletro di actina in studio dei meccanismi per determinare l&#39;integrità endoteliale barriera. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è che l&#39;impatto di vari stimoli infiammatori sulle strutture di actina in cellule endoteliali può essere valutata alla stessa serie di cellule viventi, prima e dopo il trattamento, eliminando potenziali bias che possono verificarsi quando si osservano campioni fissati. Cellule endoteliali della vena ombelicale (HUVEC) sono transfettate con un GFP-β-actina plasmide e cresciuto fino a confluenza su lamelle di vetro. Time-lapse immagini di GFP-actina in HUVEC confluenti vengono catturati prima e dopo l&#39;aggiunta di mediatori infiammatori che provocano tempo-dipendente cambiamenti nella integrità barriera endoteliale. Questi studi consentono l&#39;osservazione visuale della sequenza fluida di cambiamenti nel citoscheletro di actina che contribuiscono a endotelil interruzione barriera e restauro. I nostri risultati dimostrano costantemente locali, ricche di actina formazione lamellipodia e fatturato in cellule endoteliali. La formazione e la circolazione delle fibre di actina lo stress può anche essere osservato. L&#39;analisi della frequenza di formazione e di fatturato del locale lamellipodia, prima e dopo il trattamento con stimoli infiammatori possono essere documentate da analisi chimografo. Questi studi forniscono informazioni importanti sulla natura dinamica del citoscheletro di actina in cellule endoteliali che può essere usato per scoprire i meccanismi molecolari precedentemente identificati importante per il mantenimento dell&#39;integrità della barriera endoteliale.

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Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

Immagini microscopiche dal vivo di cellule endoteliali che esprimono GFP-actina permette la caratterizzazione dei cambiamenti dinamici nelle strutture del citoscheletro. A differenza delle tecniche che utilizzano campioni fissati, questo metodo fornisce una valutazione dettagliata delle variazioni temporali del citoscheletro di actina nelle cellule stesse prima, durante e dopo vari stimoli fisici, farmacologici o infiammatoria.

Studio del citoscheletro di actina in vivo le cellule endoteliali Esprimendo GFP-Actina

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

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26.9K Views.  Louisiana State University Health Sciences Center. Immagini microscopiche dal vivo di cellule endoteliali che esprimono GFP-actina permette la caratterizzazione dei cambiamenti dinamici nelle strutture del citoscheletro. A differenza delle tecniche che utilizzano campioni fissati, questo metodo fornisce una valutazione dettagliata delle variazioni temporali del citoscheletro di actina nelle cellule stesse prima, durante e dopo vari stimoli fisici, farmacologici o infiammatoria.