وأيد هذا العمل من خلال تمويل من المعهد Morgridge للبحوث وجامعة ولاية ويسكونسن مؤسسة. نشكر كريستا إيستمان للمساعدة التحرير.

<ol>
	<li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li><li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis.">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRT-seq+amplification-free,+strand-specific+transcriptome+sequencing.">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li><li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+consistent,+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA.">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li><li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty.">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li></ol>

الكتاب يكشف ان جات هو مؤسس ، حاملي الأسهم ، ومستشار وعضو مجلس الخلوية حيوية الدولية (CDI). وهو يشغل أيضا منصب المستشار العلمي لديها مصالح مالية والثانية في المشاريع التكتيك الخلايا الجذعية.

البروتوكولات الحالية لجعل المكتبات نهاية الاقتران تتطلب ما بين 1 ميكروغرام 9-2،5 10 ميكروغرام كمية بدءا من الحمض النووي الريبي الإجمالي. نحن هنا حاضرنا التضخيم T7 خطية إلى (T7LA) طريقة واحدة لإعداد كلا البورشيد نهاية القراءة والمكتبات المقترنة التسلسل وتبين أن هذا الأسلوب يسمح للمكتبات من الجيل منخفضة تصل إلى 10 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع إنتاج البيانات التي يمكن أن تقارن من تضخيم الحد الأدنى (MinAmp) مصنوعة من مواد المكتبات أضعاف بدءا من 1000 (10 ميكروغرام RNA المجموع). المكتبات 10 نانوغرام لم يحدد فقط العدد الإجمالي للجينات مماثلة ، ولكن أيضا إنتاج التوقيعات التعبير الجيني التي تشبه (أرقام 3a و ب). وعلاوة على ذلك ، فإن كلا من واحدة نهاية القراءة والمكتبات المقترنة التي تنتجها T7LA طريقة مشابهة جدا لبعضها البعض (الشكل 3C) ، الذي يسمح للباحثين لمقارنة البيانات التي تم إنشاؤها من قبل المكتبات إما مصنوعة من البروتوكول. منذ أعدت هذه المكتبات من الحمض النووي الريبي الجنينية البشرية الخلايا الجذعية ، بحثنالمدة 30 جينات الخلايا الجذعية محددة بين المكتبات وجدت أن ما يقرب من تحديد جميع هذه الجينات (93-100 ٪) من المكتبات مصنوعة من لا يقل عن 10 نانوغرام من بدء RNA الكلي (الشكل 4) ، والمصادقة على البروتوكول وبالتالي لدينا. نعتقد بروتوكول لدينا ستكون مفيدة جدا للباحثين ، وخاصة في ظروف مثل الخلايا التي تم فرزها أو تدفق الليزر الدقيقة تشريح الأنسجة حيث بدأ يحد من المواد. في مثل هذه الظروف ، سيكون لدينا بروتوكول يسمح توليد بيانات قابلة للمقارنة في التعبير الجيني للمكتبات مصنوعة من كميات أكبر من ذلك بكثير منذ بدء بروتوكول لدينا تنتج ملامح التعبير للمقارنة بين ما لا يقل عن 3 أوامر من حجم بدءا من الحمض النووي الريبي.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> شركة </td><td> طقم / الكاشف </td><td> كتالوج # </td><td> تعليقات خاصة </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> التفتت كاشف </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> بطانة الأكريلاميد </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 كيت </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> DEPC غير المعالجة nuclease المياه مجانا </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> تعيين dNTP </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> ميثليته dNTPs </td><td> R0431 </td><td> لعينة واحدة الإعدادية للقراءة فقط </td></tr><tr><td> البورشيد </td><td> TruSeq ريال الكتلة انشاء عدة V5 </td><td> GD - 203 - 5001 </td><td> لعينة واحدة الإعدادية للقراءة فقط </td></tr><tr><td> البورشيد </td><td> TruSeq تسلسل عدة دورات V5 36 </td><td> FC - 104 - 5001 </td><td></td></tr><tr><td> البورشيد </td><td> رقاقة تسلسل نموذج الإعدادية كيت </td><td> IP - 102 - 1001 </td&gt; <td> لعينة واحدة الإعدادية للقراءة فقط. ويمكن الاستعاضة عنها ميكس NEB عينة من الحمض النووي ماجستير الإعدادية مجموعة 1 القط # E6040S </td></tr><tr><td> البورشيد </td><td> TruSeq PE الكتلة انشاء عدة V5 </td><td> PE - 203 - 5001 </td><td> لإقران نهاية الإعدادية عينة فقط </td></tr><tr><td> البورشيد </td><td> إقران طقم نهاية نموذج الإعدادية </td><td> PE - 102 - 1001 </td><td> لإقران نهاية الإعدادية عينة فقط </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1KB زائد سلم </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> كولاي ريبونوكلياز H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> ريبونوكلياز خارج </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 2 العازلة حبلا 5X </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> هاء القولونية بوليميريز الحامض النووي </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E - هلام SYBR آمنة 2 ٪ </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> أنا مرتفعالثاني (مع العازلة FS 5X و0.1M DTT) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNA quibit مقايسة طقم </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA HS و qubit مقايسة طقم </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> كولاي DNA يغاز </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> T4 بوليميراز الدنا </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> ماء نقي جدا الدناز ريبونوكلياز </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> ثانيا مرتفع مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل عدة توليف [كدنا] </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> عشوائي التمهيدي (invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> لإقران نهاية الإعدادية عينة فقط </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer B التمهيدي </td><td> N / A </td><td> لقراءة واحدة سامالتنوير القائل الإعدادية فقط </td></tr><tr><td> IDT </td><td> أليغو DT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> NEB </td><td> Not1 الهضم عدة </td><td> R0189S </td><td> لعينة واحدة الإعدادية للقراءة فقط </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy Minelute طقم </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNEasy ميني كيت (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> هلام تنقية عدة </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> تعيين الدناز </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute طقم </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> الإنزيم بحوث </td><td> الحمض النووي نظيفة والمكثف (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna

يستخدم الآن كله التسلسل transcriptome بواسطة تسلسل - مرنا على نطاق واسع لأداء عالمية التعبير الجيني ، الطفرة ، أليل محددة التعبير وغيرها من التحليلات الجينوم واسعة. تسلسل مرنا ، حتى يفتح الباب لتحليل التعبير الجيني للمورثات غير متسلسلة. مرنا ، يقدم تسلسل حساسية عالية ، ومجموعة كبيرة ديناميكية ويسمح بقياس الأرقام نسخ النص في العينة. البورشيد في الجينوم محلل يؤدي تسلسل لعدد كبير (&gt; 10 7) من سلسلة قصيرة نسبيا يقرأ (&lt;150 BP) ، والتسلسل و&quot;إقران نهاية&quot; النهج ، وفيه قراءة واحدة طويلة في كل أهدافها ، ويسمح لتعقب التقاطعات لصق بديل ، الإدراج والحذف ، ومفيد لتجميع دي transcriptome نوفو. واحدة من التحديات الرئيسية التي تواجه الباحثين هو كمية محدودة من المواد ابتداء. على سبيل المثال ، في التجارب حيث يتم حصاد الخلايا بواسطة الليزر الدقيقة تشريح المتاحة بدءا مجموع RNA مالمنعم يوسف في قياس نانوجرام. وقد وصفت إعداد تسلسل مرنا - المكتبات من مثل هذه العينات 1 ، 2 ولكن ينطوي كبيرة PCR التضخيم التي قد أعرض عن التحيز. وقد نشرت الأخرى بناء مكتبة الرنا تسلسل الإجراءات مع الحد الأدنى من التضخيم PCR 3 ، 4 ، ولكنها تتطلب كميات ميكروغرام من الحمض النووي الريبي ابتداء الإجمالي. نحن هنا وصف بروتوكول لمنصة الجينوم محلل البورشيد الثاني لتسلسل تسلسل مرنا ، لإعداد المكتبة التي تتجنب كبيرة PCR التضخيم ويتطلب سوى 10 نانوجرام من الحمض النووي الريبي الإجمالي. في حين وصفت في وقت سابق هذا البروتوكول والمصادقة على واحد في نهاية التسلسل 5 ، حيث تم عرض لانتاج مكتبات الاتجاه دون إدخال كبيرة التحيز التضخيم ، نحن هنا من صحة أكثر من ذلك لاستخدامها بوصفها بروتوكول نهاية المقترنة. نحن تضخيم انتقائي الرناوات رسول مذيل بعديد الأدينيلات بدءا من الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام الأسلوب يستند T7 Eberwine التضخيم الخطية ، صاغ &quot;T7لوس انجليس &quot;(T7 خطية التضخيم) ، وتضخيم بولي - A مجزأة mRNAs ، عكس كتب ومحول ligated لإنتاج مكتبة التسلسل النهائي. بالنسبة لكل من يعمل واحد نهاية القراءة والمقترنة ، يتم تعيينها لسلاسل transcriptome الإنسان (6) وتطبيع بحيث ويمكن مقارنة البيانات من تشغيل متعددة ، ونحن التقرير قياس التعبير الجيني في وحدات من النصوص لكل مليون (TPM) ، وهو مقياس متفوقة على RPKM عند مقارنة عينات 7.

Watch this Scientific Journal Video about Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA at JoVE.com

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

نحن هنا وصف طريقة لتحضير كل واحد المكتبات نهاية القراءة ومرنا ، المقترنة تسلسل البورشيد التسلسل الجيني للتحليل بناء على تضخيم الحمض النووي الريبي T7 الخطية. هذا البروتوكول لا يتطلب سوى 10 نانوجرام من الحمض النووي الريبي ابتداء مجموع المكتبات ويولد متسقة للغاية تمثل النصوص كلها.

قراءة واحدة المقترنة مكتبات نهاية البورشيد مرنا ، في الفترة من 10 نانوجرام تسلسل الحمض النووي الريبي مجموع

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

single-read-paired-end-mrna-seq-illumina-libraries-from-10-nanograms

Research

JoVE Journal

Biology

39.0K Views.  Morgridge Institute for Research. نحن هنا وصف طريقة لتحضير كل واحد المكتبات نهاية القراءة ومرنا ، المقترنة تسلسل البورشيد التسلسل الجيني للتحليل بناء على تضخيم الحمض النووي الريبي T7 الخطية. هذا البروتوكول لا يتطلب سوى 10 نانوجرام من الحمض النووي الريبي ابتداء مجموع المكتبات ويولد متسقة للغاية ت...

Video: Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

على نطاق واسع من شاشات مكتبات Metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

استخراج خلايا الحمض النووي الريبي من Neuroprecursor باستخدام بيو راد إجمالي RNA كيت

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

الحصول على جودة عالية من الحمض النووي الريبي بالسكان خلية واحدة في الإنسان تشريح أنسجة المخ

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel production 1. Chemical methods to modify or degrade cellulose typically require strong acids and high temperatures. As such, enzymatic methods have become prominent in the bioconversion process. While the identification of active cellulases from bacterial and fungal isolates has been somewhat effective, the vast majority of microbes in nature resist laboratory cultivation. Environmental genomic, also known as metagenomic, screening approaches have great promise in bridging the cultivation gap in the search for novel bioconversion enzymes. Metagenomic screening approaches have successfully recovered novel cellulases from environments as varied as soils 2, buffalo rumen 3 and the termite hind-gut 4 using carboxymethylcellulose (CMC) agar plates stained with congo red dye (based on the method of Teather and Wood 5). However, the CMC method is limited in throughput, is not quantitative and manifests a low signal to noise ratio 6. Other methods have been reported 7,8 but each use an agar plate-based assay, which is undesirable for high-throughput screening of large insert genomic libraries. Here we present a solution-based screen for cellulase activity using a chromogenic dinitrophenol (DNP)-cellobioside substrate 9. Our library was cloned into the pCC1 copy control fosmid to increase assay sensitivity through copy number induction 10. The method uses one-pot chemistry in 384-well microplates with the final readout provided as an absorbance measurement. This readout is quantitative, sensitive and automated with a throughput of up to 100X 384-well plates per day using a liquid handler and plate reader with attached stacking system.

This protocol describes a high throughput screen for cellulolytic activity from a metagenomic library expressed in Escherichia coli. The screen is solution based and highly automated, and uses one-pot chemistry in 384 well microplates with the final readout as an absorbance measurement.

شاشة إنتاجية عالية للنشاط Biomining سلولاز من مكتبات Metagenomic

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

في المختبر، والسد النسخ من مرنا luciferase المراسل Gaussia تلاه ترنسفكأيشن الخلية هيلا

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

الكروماتين تحليل التفاعل مع تسلسل العلامات المقترنة النهائي (شيا-PET) لرسم خرائط التفاعلات الكروماتين وفهم تنظيم النسخ

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

تشيب-Seq: التنميط Epigenome الخلية-نوع معين

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

عزل النوى من كلية الفأر البالغة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

عزل وتوصيف النوى المفردة من أنسجة الثدييات المجمدة

A Simple, Quick, and Partially Automated Protocol for the Isolation of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues for Single Nucleus Sequencing

Single-cell and single-nucleus RNA sequencing have become common laboratory applications due to the wealth of transcriptomic information that they provide. Single nucleus RNA sequencing, particularly, is useful for investigating gene expression in difficult-to-dissociate tissues. Furthermore, this approach is also compatible with frozen (archival) material. Here, we describe a protocol to isolate high-quality single nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nucleus RNA sequencing in a partially-automated manner using commercially available instruments and reagents. Specifically, a robotic dissociator is used to automate and standardize tissue homogenization, followed by an optimized chemical gradient to filter the nuclei. Lastly, we accurately and automatically count the nuclei using an automated fluorescent cell counter. The performance of this protocol is demonstrated on mouse brain, rat kidney, and cynomolgus liver and spleen tissue. This protocol is straightforward, rapid, and readily adaptable to various mammalian tissues without requiring extensive optimization and provides good quality nuclei for downstream single nuclei RNA sequencing.

تسليط الضوء على المؤلف: تعزيز اكتشاف الأدوية - تطوير بروتوكولات آلية وموحدة لاستخراج النوى من الأنسجة المجمدة 

The study describes a simple, quick, and partially automated protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nuclei RNA sequencing.